ABO Genotyping by Pyrosequencing Analysis

Pyrosequencing을 이용한 ABO 유전자형 검사

송은영, 노재광, 윤여민, 최영숙, 박성섭¹, 나은경², 한규섭¹

건국대학교 의과대학 진단검사의학교실, 서울대학교 의과대학 검사의학교실¹, 서울대학교병원 진단검사의학과²

= Abstract ₌

ABO Genotyping by Pyrosequencing Analysis

Eun Young Song, Jae Kwang Noh, Yeomin Yoon, Young Sook Choi, Sung Sup Park

, Eun Kyung Ra

, Kyou Sup Han

Department of Laboratory Medicine, Konkuk University College of Medicine; Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine

; Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Hospital

; Seoul, Korea

Background: ABO genotyping is being used increasingly when the results of serologic typing are unclear or

Methods: A total of 36 samples, which had previously been analyzed by PCR-RFLP and serological method

Results: The ABO genotypes from pyrosequencing and the interpretation of the pyrograms according to the

Conclusion: ABO genotyping for A, B, O, cis-AB alleles by pyrosequencing of nucleotides 261, 796 and 803

J Blood Transfusion 17(2) : 106∼115, 2006)

접수일：2006년 8월 24일, 승인일：2006년 10월 28일

책임저자：한 규 섭 110-744 서울특별시 종로구 연건동 28번지 서울대학교병원 진단검사의학과

Pyrosequencing을 이용한 ABO 유전자형 검사

서 론

ABO 유전자형검사는 ABO 혈액형이 불확실하 거나 cis-AB형 등의 아형이 의심되는 경우, 또한, 법의학 분야에서 개인 식별에도 유용하게 이용되 는 검사로 PCR-restriction fragment length polymor- phism (RFLP)¹⁾, allele-specific PCR²⁾, PCR-single- stranded conformational polymorphism (SSCP)³⁾, se- quence-based typing⁴⁾ 등이 검사법으로 이용되어 왔으며, 최근 multiplex single-base primer extension 원리를 이용한 SNaPshot 검사^5,6)도 소개되었다.

PCR-RFLP는 제한효소를 사용하기 때문에 불 완전한 효소작용으로 인한 검사오류의 우려가 있 고, 단일염기다형성(single nucleotide polymor- phism, 이하 SNP) 부위 수만큼의 제한효소가 필 요하며, 한 가지 조건에서 검사를 시행하기가 어 려울 수 있고⁷⁾, allele-specific PCR은 multiplex PCR 형태로 시행하면 검사가 간단하고, 여러 SNP 부 위를 동시에 검사할 수 있는 장점이 있으나, 정확 한 검사를 위해 최적의 조건을 잡아야 하며 비특 이밴드가 나타나기도 하는 등 어려움이 역시 존 재한다⁸⁾. PCR-SSCP는 예상하지 못한 아형을 찾 는 데는 유용하나, 통상의 검사로 이용하기에는 인력이 많이 들고, 재현성 있는 밴드 패턴을 보는 것이 어려울 수 있다⁹⁾.

Pyrosequencing은 DNA 합성 중 유리되는 pyrop- hosphate (PPi)를 검출하는 원리에 근거한 방법^10,11) (Fig. 1)으로 Sanger DNA sequencing에 비해 최대 로 분석할 수 있는 염기서열의 길이가 30∼40 bp 이내로 짧은 것이 단점이나, 검사과정이 매우 간 단하고, 비용이 적게 소요되는 장점이 있어^12,13)

최근 돌연변이 검출, cDNA 분석, 미생물 유전자 형 검사, SNP 분석 등의 분야에 널리 시도되고 있다¹⁰⁾. 이에 저자들은 혈액은행에서 가장 흔히 이용되는 분자유전학적 검사인 ABO 유전자형 검사에 pyrosequencing 기법을 적용할 수 있는지 확인해 보고자 하였다.

대상 및 방법

1. 대상

2001년 8월부터 2004년 9월까지 서울대학교병 원 혈액형클리닉을 방문하여 혈청학적 검사와 PCR-RFLP를 이용한 ABO 유전자형검사를 시행 후 -70^oC에 보관 중인 검체 중 A/A, A/B, A/O, B/B, B/O, O/O, cis-AB/O, cis-AB/A, cis-AB/B 유전자형으 로 판정된 각 4검체씩, 총 36검체를 검사하였다.

PCR-RFLP법은 DNA를 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)으로 추출한 후 nucleo- tide 261번, 526번, 703번, 796번, 803번에 대하여 제한효소(BstE II, Pvu II, BssH II, Alu I, Mva I)를 이용하는 방법¹⁴⁾으로 검사하였다.

2. 방법

ABO 유전자는 9번 염색체 장완에 위치하며 exon 6번과 7번에 주요변이가 존재한다. O형(통 상 *O01 대립유전자를 의미함)은 nucleotide 261 번 G가 결손되어 있고(Table 1)^15,16), A형(통상

*A101 또는 *A102 대립유전자를 의미함)과 B형 (*B101)은 nucleotide 526번, 703번, 796번, 803번 의 염기서열의 차이로 아미노산의 변화를 유발하 고, cis-AB형(*cis-AB01)은 526, 703, 796번째 염기

Key words: ABO genotyping, ABO blood group, Pyrosequencing

는 A형과 같고, 803번 염기만 B형과 같다. 따라 서, 4가지 혈액형은 261번 염기와, 803번 염기, 그 리고 526, 703, 796번 염기 중 한 가지를 검사하

면, 감별이 가능하다. 또한, 802번 염기가 확인되 면 O²형(*O03)도 추가로 감별할 수 있다. 이에 저 자들은 261번 염기와 796번, 802번, 803번을 포함 Fig. 1. Principle of pyrosequencing. The five steps of a single pyrosequen-

cing cycle, which takes approximately 60 s to complete and which invo- lves the cooperative actions of four enzymes (DNA polymerase, ATP sul- furylase, luciferase, apyrase). 1) The first step is the addition (dispen- sation) of new dNTPs (dATPαS, dCTP, dGTP or dTTP). 2) If the dNTP is complementary to the next position in the template, it is incorporated and PPi is released. If the dNTP does not match the template, it is not incorporated and no PPi is released. 3) If PPi has been released, it is used to convert AMP into ATP. 4) The ATP is used to produce visible light through the action of the luciferase. 5) The cycle is completed when apy- rase degrades unused dNTPs and ATP.

Pyrosequencing을 이용한 ABO 유전자형 검사

하는 부위의 PCR 시발체(primer)를 Pyrosequen- cing^TM Assay Design Software v.1.0 (Bitage AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 고안하였다(Table 2,

Fig. 2). PCR은 10 pmol의 forward primer와 biotiny- lated reverse primer (Bioneer Corporation, Daejeon, Korea), 5 uL의 10× Taq PCR buffer (Promega, Table 1. Differences in sequence of alleles in the ABO blood group system for use in genotyping

Allele* Alias nt261 nt467 nt526 nt646 nt703 nt796 nt802 nt803 nt1061

*A101 A(Pro)

*A102 A(Leu)

*A201

*B101

*O01 O(T)

*O02 O(A)

*O03

*cis-AB01

*ABO alleles were named according to the nomenclature used in the Blood Group Antigen Gene Mutation Database (http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/abo.htm).

Fig. 2. Scheme of PCR and sequencing primers for pyrosequencing of ABO gene.

Table 2. Primers for PCR and pyrosequencing of ABO gene

Primer name Primer location Primer sequence (5'→3')

ABO-261F Intron5/exon6 5'-CGCCTCTCTCCATGTGCAGTA-3'

ABO-261R Exon 6 5'-biotin-AGTTAACCCAATGGTGGTGTTCTG-3' ABO-261Seq Exon 6 5'-GGATGTCCTCGTGGT-3'

ABO-796F Exon 7 5'-ATCCTGACTCCGCTGTTCG-3' ABO-796R Exon 7 5'-biotin-ACCGACCCCCCGAAGAAC-3' ABO-796Seq Exon 7 5'-CGAGGGCGATTTCTACT-3'

Fig. 3. Examples of theoretical (upper panels) and actual (lower panels) pyrograms for B/O, B/cis-AB and O/O genotypes. The nucleotide dispensation order (Disp:) is displayed directly under the theroretical pyrograms. The pyrosequencing result is displayed at the bottom of the actual pyrograms. (A) B/O for nt 261; (B) B/O for nt 796, 803 (C) B/cis-AB for nt 261 (D) B/cis-AB for nt 796, 803 (E) O/O for nt 261 (F) O/O for nt 796, 803, nt: nucleotide.

Pyrosequencing을 이용한 ABO 유전자형 검사

Madison, WI, USA), 2.5 U Taq DNA polymerase (Promega, Madison, WI, USA)를 포함하여 최종 50 uL 반응으로 시행하였다. PCR은 두 반응 모두 초 기 denaturation 95^oC, 5분 후 denaturation (95^oC, 20 초), annealing (60^oC, 20초), extension (60^oC, 20초) 을 45 cycle을 시행하고 최종 extension으로 72°C, 5분을 시행하였다.

Pyrosequencing은 PSQ^TM96MA system (Biotage AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 시행하였다. 우 선 streptavidin이 코팅된 Sepharose bead (Amer- sham Bioscience AB, Uppsala, Sweden) 3 uL를 37 uL의 2× binding buffer (5 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 7.6)와 섞어 96 well plate에 분주하고, PCR 산물 20 uL에 D.W.

20 uL를 가하여 총 40 uL를 bead가 들어있는 well 에 추가로 분주한 후, 실온에서 5분간 1,400 rpm 으로 지속적으로 혼합하였다. 다음 단계로 Va- cuum Prep Workstation (Biotage AB, Uppsala, Swe- den)을 이용하여 bead에 부착된 PCR 산물을 0.1 M NaOH로 denaturation시켜 single-stranded DNA 로 만든 후 분리하였다. 15 pmol의 sequencing primer (ABO-261Seq와 ABO-796Seq) (Table 2)와 각각의 single-stranded DNA를 45 uL의 annealing buffer (20 mM Tris-Acetate, 5 mM MgCl2, pH 7.6) 에 분주하여 80°C에 2분간 방치 후 실온에 방치 하여 냉각하였다. Pyrosequencing은 dATPαS, dCTP, dGTP, dTTP, 효소 혼합액(DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase), 그리고 기질 혼합 액(adenosine 5’ phosphosulfate와 luciferin)을 포함 하는 SNP reagent kit (Biotage AB, Uppsala, Swe- den)를 이용하였다.

반응이 종료된 후 방출된 빛의 강도를 Y축으 로 나타내는 pyrogram의 peak의 높이를 자동분석 프로그램으로 판독하여 261, 796, 803 부위의 SNP 결과를 판정하였다. Fig. 3에 261번, 796번, 803번

염기가 각기 다른 조합의 예시가 가능하도록 B/

O, B/cis-AB, O/O의 세 종류 검체에 대한 실제 분 석례를 표시하였다. 각 패널의 상단에는 이론적 으로 기대되는 pyrogram의 모식도를 표시하였고 dNTP의 분주순서가 모식도 하단에 표시되었다.

각 패널의 하단에는 실제로 출력된 pyrogram을 표시하였고 가장 하단에 분석된 염기서열을 표시 하였다. 261번, 796번, 803번의 SNP분석 결과를 회색박스로 표시하였다. 예를 들면 B/O 유전자형 을 표시한 (A) 패널에서는 261번 G가 하나의 대 립유전자에서는 소실되어 없으므로, 염기의 양이 다음번 염기인 A의 절반이다. 따라서, 이론적인 pyrogram 모식도에서 두 번째에 분주된 G peak의 높이는 네 번째에 분주된 A peak 높이의 절반이 된다. 자동분석프로그램은 이러한 원리로 염기서 열을 판정하여 peak의 상태에 따라 분석결과를 확신할 수 있다는 의미인 ‘passed’, 점검이 필요하 다는 의미의 ‘check’, 결과를 보장할 수 없다는 의 미의 ‘failed’ 표시를 같이 하도록 되어 있다. 또한

Table 3.Reference table for assigning ABO genotype based on pyrosequencing analysis of three sin- gle-nucleotide polymorphisms

Polymorphic nucleotides

Genotype Exon 6 Exon 7 nt261 nt796 nt803

A/A

A/B

A/O

B/B

B/O

O/O

cis-AB/A

cis-AB/B

cis-AB/O

pyrogram의 peak 높이를 연구자가 직접 판독하여 SNP 판정을 시행하였다. SNP 판정 후 Table 3을 이용하여 ABO 유전자형을 판정하였다.

결 과

36개의 검체를 261, 796, 803번의 염기 세 부위 의 SNP 분석을 하여 총 108예의 자동분석프로그 램을 이용한 분석 예 중 ‘check’표시가 4예, ‘fai- led’ 표시가 6예 있었으며, 이는 모두 803번 염기 판정에서 발생하였다. ‘failed’로 표시된 6예 중 한 예는 자동분석프로그램으로는 C/C로 판정되었으 나, PCR-RFLP 결과는 G/C로 불일치 소견을 보였 다(0.9%). 연구자가 pyrogram을 판정한 결과는 이 전의 PCR-RFLP로 검사한 결과와 모두 일치하였 다.

고 찰

본 연구에서는 pyrosequencing 기법을 A, B, O, cis-AB 대립유전자를 구별하는 ABO 유전자형 검 사에 적용시켜 보았다. 자동분석프로그램의 결과 가 108예 중 1예(0.9%)에서 PCR-RFLP 및 연구자 가 판정한 결과와 불일치하였는데, 이는 ABO 유 전자의 803번 염기 앞의 염기서열이 G가 5개 연 속으로 존재하기 때문에 dGTP의 분주 시 발생하 는 빛의 강도가 일반적으로 검출되는 범위를 벗 어나 1회의 dGTP 분주로 PPi 발생이 완료되지 못 하여 2회의 dGTP 분주를 시행하여 peak 높이를 산정하는 과정에서 peak 높이가 낮게 판독되어 발생한 오류로 생각되었다. 이로 인해 803번 염 기판정에서만 ‘check’ 표시가 4예, ‘failed’ 표시가 6예로 높은 빈도로 발생한 것으로 생각되며 향후 primer와 dNTP 분주순서를 고안할 때 고려하여 야 할 사항으로 생각되었다. 그러나, 이들 결과에

대해서도 검사자가 직접 pyrogram을 판독하는 경 우에는 정확한 판정이 가능하였다. 단, pyrose- quencing 자체가 생소한 검사법이기 때문에 검사 자가 판독이 익숙해지는데는 Sanger sequencing과 마찬가지로 어느 정도 경험이 필요할 것으로 생 각된다.

Pyrosequencing 기법은 현재까지 상품화되어 있 는 장비가 고가이기 때문에 ABO 유전자형 검사 만을 목적으로 작은 규모의 병원에 도입하기는 어려움이 있다. 단, Sanger sequencing 원리를 이 용하는 SNaPshot 방법^5,6)과 비교하면 ABI PRISM^Ⓡ 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 의 경우 1∼2시간에 16검체를 처리하는 것에 비 해, PSQ^TM 96MA system (Biotage AB, Uppsala, Sweden)은 30∼40분에 96검체를 분석할 수 있고 PCR 산물의 정제단계를 필요로 하지 않는 장점 이 있으며, 정확도와 비용면에서도 192검체의 24 부위의 SNP를 분석하여 정확도와 비용을 비교한 최근 보고¹²⁾에서 SNaPshot 방법은 PCR 비용을 제 외하고 SNP 한 부위당 $2.00, pyrosequencing은

$0.83이었고, 불충분한 PCR이나 불순물 등으로 인한 검사실패율은 SNaPshot이 14.75%, pyrose- quencing이 10.58%였으며, 검사결과의 오류는 각 각 0.71%와 0.75%로 보고된 바 있다.

Pyrosequencing의 가장 큰 단점은 분석 가능한 염기의 길이가 짧다는 것으로 sequencing을 위한 PSQ 96 SQA reagent kit (Biotage AB, Uppsala, Sweden)를 이용할 경우 30∼40 bp 정도만 정확히 판정할 수 있고, SNP 분석을 위한 PSQ 96 SNP reagent kit (Biotage AB, Uppsala, Sweden)를 사용 하면 10∼15 bp 범위 내에서의 SNP를 주로 판정 하게 된다. 따라서, pyrosequencing은 주로 근접한 SNP나 짧은 길이의 염기서열을 판정하는 경우 효율적일 수 있어 최근 HLA 검사¹⁷⁾, 혈전질환¹⁸⁾, 미생물 종 감별¹⁹⁾등의 분야에 시도되고 있으며,

Pyrosequencing을 이용한 ABO 유전자형 검사

분석결과에 정량적인 개념이 포함되어 있어 DNA 혼주검체(pools)를 이용한 SNP 연구²⁰⁾, methyla- tion 연구²¹⁾와 관련된 논문이 발표되고 있으며, 혈 액은행 검사로는 기타 적혈구 항원 및 혈소판 항 원의 유전자형 검사에 이용될 수 있음이 보고되 었다⁹⁾. 본 연구에서도 cis-AB 대립유전자와 같이 빈도가 높은 유전형의 SNP 분석에는 효과적으로 이용할 수 있었으나 그 외의 한국인에서 발견되 는 A 또는 B 아형 유전자^22,23)에 대한 분석을 시행 하기 위해서는 추가로 또 다른 시발체를 고안하 여야 하는 단점이 있다.

Pyrosequencing은 최근 biotinylated primer를 공 통으로 사용할 수 있도록 primer를 고안하는 방법 으로 비용을 낮추기도 하고²⁴⁾, primer 디자인이나 세척단계를 개선하여 기저신호(background signal) 을 낮추어 판독능력을 향상시키는 등²⁵⁾향후로도 개선의 여지가 있는 방법으로 생각되며, 임상 검 사실에서 이용 가능한 새로운 분자유전검사기법 의 하나로 관심을 가져볼 수 있을 것으로 생각된 다.

요 약

배경 : ABO 유전자형검사는 혈청학적 검사결 과가 애매하거나 ABO 아형이 의심되는 경우 시 행되는 검사이다. 기존의 분자유전학적 방법으로 PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP), allele-specific PCR, PCR-single stranded conformational polymorphism (PCR-SSCP) 그리고 sequence-based typing 등이 이용되어 왔다. 최근 에 pyrosequencing 기법이 소개되어 검사실에서의 이용되기 시작하여 본 연구에서는 ABO 유전자 형검사에 pyrosequencing 기법의 적용 가능성을 알아보고자 하였다.

방법: 2001년 8월부터 2004년 9월 사이에 서울

대학교병원 혈액형 클리닉에서 혈청학적 검사와 PCR-RFLP를 이용한 유전자형검사를 시행하여 A/A, A/B, A/O, B/B, B/O, O/O, cis-AB/O, cis-AB/A, cis-AB/B 유전자형으로 판정된 각 4 검체씩, 총 36 개의 보관검체를 대상으로 PSQ^TM 96MA System (Biotage AB, Uppsala, Sweden)을 이용한 pyrose- quencing 분석을 시행하였다. ABO 유전자의 261 염기와 796/803 염기를 포함하는 부위에 대하여 PCR을 각각 시행하였고 이어 pyrosequencing을 실시한 후 제조사에서 제공하는 자동분석프로그 램을 이용하는 방법과 검사자가 직접 pyrogram을 판독하는 방법 각각을 이용하여 261, 796, 803 염 기의 서열을 판정하여 ABO 유전자형을 결정하 였다.

결과: Pyrosequencing 결과를 검사자가 직접 판 독한 경우에는 36 검체 모두에서 기존의 PCR- RFLP 검사로 시행하여 판정된 ABO 유전자형 결 과와 일치하였다. Pyrogram을 자동분석프로그램 을 이용하여 판독한 결과에서는 36 검체당 3 부 위, 총 108예의 염기서열 판정 중 1예(0.9%)에서 오류가 있었다.

결론 : 한국인에서 261, 796, 803 세 부위의 염 기를 판정하는 pyrosequencing 기법을 이용한 ABO 유전자형검사로 비교적 간편하고 정확한 A, B, O, cis-AB 대립유전자의 판정이 가능하였다. ABO 유 전자형 검사는 검사실에서 pyrosequencing 기법을 이용할 수 있는 또 하나의 분야가 될 수 있을 것 으로 생각된다.

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