九蒸黃精의 벤조피렌 함량과 마우스 단일투여 독성실험
김용웅․노성수1*
대구한의대학교 한방산업대학 한방제약공학과, 1 : 한의과대학 본초학교실
Single Toxicity Evaluation of the Polygonati Rhizoma Preparata with Benzo[a]pyrene Contents in ICR Mice
Yong Ung Kim, Seong Soo Roh1*
Department of Herbal Pharmaceutical Engineering, College of Herbal Bio-Industry, 1 : Department of Herbology, College of Oriental Medicine, Daegu-Haany University
The object of this study was two. One was if Polygonati Rhizoma preparata had a benzo(a)pyrene, the other was to evaluate the single dose toxicity of 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma, dried root parts of Polygonati Rhozoma preparata extract, in male and female mice. We measured a content of benzo(a)pyrene in Polygonati Rhozoma preparata using a method with HPLC/FLD. And for single dose toxicity, aqueous extracts of Polygonati Rhozoma preparata (EPP; Yield = 35.4 %) was administered to female and male ICR mice as an oral dose of 2,000, 1,000 and 500 mg/kg (body weight) according to the recommendation of Korea Food and Drug Administration (KFDA) Guidelines. Animals were monitored for the mortality and changes in body weight, clinical signs and gross observation during 14 days after dosing, upon necropsy; organ weight and histopathology of 12 principle organs were examined. As results, we could not find any mortality, clinical signs, and changes in the body and organ weight except for slight soft feces sporadically detected in EPP treated male mice at 1 day after administration. In addition, no EPP-treatment related abnormal gross findings and changes in histopathology of principle organs were detected except for some sporadic accidental findings. The results obtained in this study suggest that benzo(a)pyrene was not existed in Polygonati Rhozoma preparata and the 50% lethal dose and approximate lethal dose of EPP aqueous extracts in both female and male mice were considered as over 2,000 mg/kg, the limited highest dosage recommended by KFDA Guidelines. However, it also observed that the possibilities of digestive disorders, like soft feces when administered over 500 mg/kg of EPP aqueous extracts in the present study.
Key words : Polygonati rhizoma preparata, benzo(a)pyrene, single oral dose toxicity, mice
* 교신저자 : 노성수, 경산시 유곡동 290, 대구한의대학교 한의과대학
․E-mail : [email protected], ․Tel : 053-819-1459
․접수 : 2010/11/19 ․수정 : 2011/01/20 ․채택 : 2011/02/07
서 론
黃精은 백합과에 속한 다년생 초본인 층층갈고리둥글레 Polygonatum sibiricum Redoute, 진황정 (대잎둥굴레) Polygonatum falcatum A. Gray 또는 滇黃精 Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.의 根莖으로, 봄과 가을에 채취해서 蒸하여 曬乾한 것이다
1).
黃精의 화학성분은 nicotinic acid, 점액질, 다당류, 유기산류, sibiricoside A, B, neoprazerigenin A-3-O-β-lycotetraoside, aspartic acid, homoserine, digitalis glicoside, polygonaquine 등
이 함유되어 있다
2).
黃精의 炮製에 관하여,《東醫寶鑑 : 內經編 》에 먼저 물에
우려 쓴맛을 뺀 다음 아홉 번 찌고 아홉 번 말려 먹는다 하였고
3),
諸 문헌에 의하면 黃精은 증숙 후 補脾潤肺益腎 작용이 增强되
고, 生黃精은 咽喉를 자극하고, 맛이 달고 質이 潤하므로 脾胃의
運化를 방해할 수 있다. 그런데 酒製를 거친 후에는 咽喉를 자극
하는 부작용이 제거되고, 더불어 술의 힘을 빌려 藥力을 도우며,
滋膩한 성질이 줄어들어서 濕을 助長하는 弊害가 없어진다. 따라
서 補中益氣, 養脾胃, 潤肺, 益腎하는 효능이 증가되며, 특히 補
腎益血의 작용을 높여주게 되어 脾胃虛弱, 病後 虛損의 病症과
腎虛精虧로 인한 頭暈目眩 등의 증을 치료할 때 적용한다
4). 4차
蒸熟 후부터 아린 맛과 刺激이 제거되며, 腎虛로 인한 腰酸, 足軟
無力과 腎虛精虧證, 筋骨軟弱, 風濕疼痛을 치료할 수 있다
1,5-7).
최근에 들어 중국산 한약재의 수입과 대량 생산에 따른 농 약 등의 오염에 의한 독성문제가 심각한 사회문제로 대두됨에 따라 오랫동안 사용되어 온 한약 역시 독성으로부터 완전히 벗 어나지 못하게 되었다. 따라서 근래에 들어 한약 자체의 독성평 가가 폭넓게 진행되어 왔으나, 한약이 장기복용 약물이며, 또 잔 류 가능성이 있는 잠재적인 독성 평가는 현재 거의 이루어지지 않고 있다. 이는 한약이 생약복합물이기 때문에 실험의 진행이 매우 어렵다는 문제점과 또 동물의 생체 내에서 약물의 동태를 파악하기 어려움이 있기 때문이다. 하지만 오랫동안의 시행착오 와 경험을 바탕으로 확립된 처방전은 처방 자체로 하나의 의약 품과 같은 역할을 하게 되었다. 이에 따라 양방의학에서 말하는 의약품의 독성평가에 준하여 한의학의 처방을 적용․안전성 평 가가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 또한 최근에 들어 생약 성 분을 함유한 기능성 식품에 대한 독성검시 기준 역시 점점 강화 되고 있는 실정이며, 곧 이들 역시 의약품 등과 동일한 독성 평 가 수행될 것으로 생각된다
8).
이에 저자는 자극성과 부작용이 없고, 滋養强壯의 효능이 강 한 九蒸黃精을 이용한 건강보조식품 개발 가능성에 관심을 두고, 단회 투여 독성실험을 실시하였으며 본 실험에서는 九蒸黃精의 안전성에 대한 객관적 근거를 확보하기 위해 일반 독성시험 중 현재 한국식품의약품안전청 고시 제 2009-116호 의약품 등의 독 성시험기준
9)에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여독성시험을 실시하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 재료
1) 동물 및 사양관리
암수 각 20마리의 ICR 마우스 (6 wk old upon receipt, SLC, Japan)를 10일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화 과정 및 실험 전 기간 동안 온도 (20-25℃)와 습도 (30-35%)가 조 절된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사육상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기 (light : dark cycle)는 12시간 주 기로 조절하였으며, 사료 (Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종 부검일 18시간 전 절식을 실시하였으며 (이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였 다), picric acid로 개체를 식별하였다.
2) 시료제조
본 실험에 사용한 黃精 (Polygonatum sibiricum Redoute；
Polygonati Rhizoma)은 충북 제천시 수산면 수리에서 김한종 씨가 재배한 7년생 黃精을 2005년 11월에 채취된 것을 구입하였다. 시료 제조를 위하여 生黃精을 옹기 (引月窯業, Korea)로 된 찜솥을 이용 하여 2시간 증숙하였고, 증숙 후 꺼내어 12시간 원적외선 건조기 (수붕산업, Korea)로 60℃에서 건조하으며, 위 과정을 9회 반복하 여 九蒸黃精 (Polygonati Rhizoma Preparata)을 제조하였다.
2. 방법
1) 구증黃精 시료 추출
九蒸黃精 100 g에 각각 증류수 1,000 ㎖를 가하여 열탕 추출 기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하고, 이를 감압 추 출장치로 농축하였다. 위 과정을 3회 반복하였고, 3회 농축한 것 을 다시 모아서 동결 건조기를 이용하여 완전 건조 (DLH-0600 1；35.4 g)하여 九蒸黃精抽出物 (extract of Polygonati Rhizoma Preparata ; EPP)을 제조하였고, 대구한의대학교 한의과대학 본 초학교실에서 냉동 (-84℃) 보관하였으며, 사용시 적당한 농도로 희석하여 사용하였으며 나머지는 냉동보관 하였다.
2) 벤조피렌 함량 분석
식약청 고시 ‘식용유지 중 벤조피렌 분석시험법’에 따라 HPLC/FLD를 이용한 방법으로, 숙지황 및 초탄한약재 500-600 g을 잘 분쇄한 후 가루로 하여 잘 섞고 약 5.0 g을 정밀하게 달아 적당한 용기에 넣고 물 100 ml를 넣은 후 90분간 초음파 추출한 다. 만일 분쇄하기 어려울 경우 하루 동안 실온에서 건조한 다음 분쇄하여 사용한다. 여기에 헥산 약 100 ml 및 내부 표준액 1 ml 를 넣어 호모게나이저에서 5분간 균질하게 섞는다. 이 용액을 실 온에서 30분간 초음파로 추출한 다음 정치하여 헥산층을 분액깔 대기에 옮긴다. 만일, 헥산층에 에멀젼이 생성된 경우에는 5-10 ml의 메탄올을 넣어 방치한다.
다시 물층에 헥산 약 50 ml씩을 넣고 2회 반복하여 진탕 추 출한 후 헥산층을 분액깔대기에 합한다. 합한 헥산층에 물 약 50 ml을 넣어 세척하고, 이 헥산층을 무수황산나트륨을 넣은 여과 지를 사용하여 탈수 여과한 다음 45℃의 수욕상에서 감압(약 700 mbar)하여 헥산 약 2 ml가 될 때까지 건고한다. 플로리실카트리 지는 미리 디클로로메탄 10 ml 및 헥산 20 ml을 순서대로 초당 2-3방울의 속도로 유출시켜 활성화시킨 후 사용한다. 활성화된 카트리지에 위의 추출용액을 넣어 헥산 ： 디클로로메탄올(3：1) 20 ml을 초당 2-3방울의 속도로 용출시킨다. 이 용출된 용액을 35℃의 질소가스 하에 날려보낸 후 잔류물을 아세토니트릴 1 ml 에 녹인 다음 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 검액으로 한다.
따로 벤조피렌표준품 약 1.0 mg을 정밀하게 달아 아세토니트릴 에 녹여 ml당 100 ㎍이 되게 하여 표준원액으로 한다.
3) EPP의 투여
현재까지 黃精 또는 九蒸黃精의 독성에 대한 보고를 찾아볼 수 없어, 한국식품의약품안전청 고시 제 2009-116호에 의거하여
9)
, 설치류 최고 한계투여용량인 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 설정하였으며, 공비 2로 1,000 및 500 mg/kg을 중간 및 저용량 투여군으로 설정하였다. 또한 암수 각각에 대한 매체 대조군을 추가 하였으며, 실험동물은 암수 각각 군당 5마리씩 실험에 사용 하였다. 모든 투여군에서는 EPP을 멸균 증류수에 용해시켜 20 ml/kg의 용량으로 존데 (zonde)가 부착된 1 ml 주사기를 이용하 여, 강제 경구투여하였다. 식이와 음수에 따른 약물의 흡수 변화 를 최소화 하기 위해, 투여 후 대략 3시간 동안 사료와 음수 공급 을 제한하였다.
4) 임상증상 및 체중의 관찰
모든 실험동물의 임상증상을 투여 전후에 각각 functional
observational battery test
10,11)를 기초하여 동물의 행동, 자극에
대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에 관한 일
반증상을 관찰, 기록하였으며, 투여일 이후에도 하루에 최소한 2 번씩 모든 실험동물의 임상증상을 관찰, 기록하였다. 또한 모든 실험동물의 체중을 투여 전 1일, 투여직전, 투여 후 1, 2, 7, 13 및 14일 (최종 희생일)에 각각 측정하였으며, 실험 시작 시 개체 차 이에 따른 체중의 변화를 최소화하기 위하여, 투여일～투여 후 7 일, 투여 후 7일～13일 및 투여일～투여 후 14일간의 체중 증가 량인 증체량을 각각의 체중을 이용하여 산출하였다.
5) 부검
투여 14일 후 모든 실험동물은 이산화탄소 마취하에 부검을 실시하고, 주요 장기를 위주로 이상 육안소견을 각각 관찰, 기록 하였다.
6) 장기중량 측정
모든 실험동물은 육안부검 소견을 관찰 기록한 후 하기의 장기에 대한 절대 중량을 각각 측정하였으며, 체중의 변화에 수 반된 이차적 변화를 최소화하기 위해 체중에 대한 각각의 장기 절대중량의 비율인 상대 중량을 산출하였다.
중량이 측정된 장기로는 폐 (Lung), 심장 (Heart), 좌측 신장 (Kidney-left), 비장 (Spleen), 좌측 고환 (Testis-left), 간 (Liver), 췌장 비장엽 (Pancreas-splenic lobes), 좌측 부고환 (Epididymis-left), 좌측 하악임파절 (Submandibular lymph node-left), 좌측 난소 (Ovary-left), 뇌 (Brain) 및 자궁 (Uterus)이 었다.
7) 조직병리 검사
상기의 조직을 10% 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 3 ㎛의 절편을 제작하였다. 이 후 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학현미경 하에서 이상 유무를 관찰, 기록하였다.
8) 통계처리
모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검 증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 Scheffe test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U (MW) test를 실시하여 군간의 유의성을 검증 하였다. 반수치사량 및 95% 신뢰한계 (confidence limits)를 Probit 방법으로 측정하였으며, 임상 증상, 육안부검 및 조직병리 학적 소견은 각각 그 정도에 따라 0 (normal), 1+ (slight), 2+
(moderate) 및 3+ (severe)로 구분하였다. 통계처리 및 Probit 방 법은 SPSS for Windows (Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용 하여 평가하였으며, p-value가 0.05 이하인 경우 통계적 유의성 을 인정하였다.
결 과
1. 벤조피렌 함량
EPP의 벤조피렌 함량을 측정한 결과, 벤조피렌 검출이 되지 않았다(Fig. 1).
Fig. 1. The content of benzo(a)pyrene in EPP.
2. 사망례
EPP 투여와 관련 있는 사망례는 실험 전 기간동안 관찰되지 않아, 모든 실험동물 (5/5; 100%)을 최종부검을 실시하였다 (Table 1).
Table 1. Mortalities Observed in Female and Male Mice after Single Oral Treatment with EPP
Groups Day after treatment
Total*
0
a1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Male 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)
Female 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)
EPP treated male groups 2,000
mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)
1,000
mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)
mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 0/5 (0%) EPP treated female groups
2,000
mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)
1,000
mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 (0%)
mg/kg 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 500 0/5 (0%)
Fig. 2. Diarrhea detected as clinical signs.
Note that 2 (2/5; 40%), 1 (1/5;20%) and 1 (1/5; 20%) male mice in 2,000, 1,000 and 500mg/kg treated groups showed slight (1+) soft feces at 1 day after treatment as one of clinical signs related to EPP treatment, respectively. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma
Table 3. Changes on the Absolute Organ Weights Observed in Female and Male Mice after Single Oral Treatment with EPP
Groups Absolute weights of 12 principal organs (g)
Lung Heart Thymus Kidney
L Adrenal
gland L Spleen T/O L Liver Pan S Brain Epi L
/Uterus LN L Vehicle control
Male 0.194±
0.014 0.176±
0.017 0.051±
0.017 0.275±
0.050 0.002±
0.001 0.109±
0.016 0.125±
0.015 1.505±
0.121 0.192±
0.012 0.472±
0.014 0.049±
0.006 0.007±
0.005 Female 0.180±
0.015 0.136±
0.012 0.065±
0.020 0.167±
0.016 0.004±
0.001 0.117±
0.038 0.019±
0.005 1.080±
0.135 0.170±
0.016 0.480±
0.016 0.175±
0.081 0.004±
0.002 EPP treated male groups (mg/kg)
2,000 0.184±
0.006 0.170±
0.013 0.058±
0.012 0.263±
0.042 0.002±
0.001 0.126±
0.022 0.119±
0.007 1.631±
0.202 0.182±
0.012 0.470±
0.010 0.045±
0.003 0.005±
0.003 1,000 0.185±
0.006 0.169±
0.013 0.054±
0.016 0.287±
0.020 0.006±
0.002* 0.098±
0.021 0.125±
0.010 1.468±
0.159 0.173±
0.014 0.468±
0.013 0.044±
0.003 0.005±
0.003 500 0.196±
0.014 0.164±
0.004 0.056±
0.005 0.281±
0.016 0.004±
0.001 0.110±
0.022 0.127±
0.012 1.567±
0.080 0.190±
0.010 0.479±
0.003 0.044±
0.006 0.004±
0.002 EPP treated female groups (mg/kg)
2,000 0.169±
0.013 0.128±
0.012 0.052±
0.019 0.165±
0.010 0.004±
0.002 0.114±
0.020 0.017±
0.003 1.208±
0.080 0.159±
0.007 0.463±
0.020 0.132±
0.057 0.004±
0.002 1,000 0.169±
0.014 0.135±
0.015 0.081±
0.053 0.170±
0.025 0.004±
0.003 0.127±
0.039 0.020±
0.006 1.238±
0.187 0.167±
0.019 0.455±
0.010 0.152±
0.075 0.004±
0.001 500 0.173±
0.006 0.133±
0.006 0.063±
0.009 0.181±
0.012 0.006±
0.002 0.124±
0.025 0.027±
0.004 1.206±
0.074 0.163±
0.015 0.469±
0.013 0.217±
0.065 0.004±
0.001
Values are expressed as mean ± S. D. of five mice L, left sides; T/O, testis/ovary; Pan, pancreas; S, splenic lobes; Epi, epididymis; LN, submandibular lymph node. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma * p<0.05 as compared with male vehicle control by MW test3. 임상증상
경미한 (1+) 연변 소견 (Fig. 2)이 EPP 2,000, 1,000 및 500 mg/kg 수컷 투여군에서, 투여 1일 후에 국한되어 각각 2 (2/5;
40%), 1 (1/5; 20%) 및 1 (1/5; 20%) 례 인정된 이외에 EPP 투여 와 관련된 임상증상은 실험 전 기간동안 인정되지 않았다.
4. 체중의 변화
각각의 동일 성별의 매체 대조군에 비해, EPP 투여와 관련 있 는 체중 및 증체량의 변화는 인정되지 않았다(Fig. 3&4, Table 2).
Days after administeration
before 0 1 2 7 13 sacrifice
Body weights (g)
28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
Male vehicle control
RSFHJ extracts 2000mg/kg treated male mice RSFHJ extracts 1000mg/kg treated male mice RSFHJ extracts 500mg/kg treated male mice
Fig. 3. Changes on the body weights during 14 Days of observation in male mice after single oral treatment with EPP.
No significant changes on body weights were detected in all EPP extract treated male groups as compared with male vehicle control, respectively. Values are expressed as mean ± S. D. of five mice. ‡, all mice were overnight fasted; before means 1 day before injection day 0 means just before injection. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma.5. 장기 중량의 변화
수컷 1,000 mg/kg 투여군에 국한되어 인정된 유의성 있는 (p<0.05) 부신 절대 및 상대 중량의 증가와 암컷 1,000 및 500 mg/kg 투여군에 국한되어 인정된 간 상대 중량의 유의성 있는 (p<0.05) 증가 이외에, EPP 투여와 관련된 의미 있는 장기중량의
변화는 인정되지 않았다(Table 3, 4).
Days after administeration
before 0 1 2 7 13 sacrifice
Body weights (g)
22 24 26 28 30 32 34 36
Male vehicle control
RSFHJ extracts 2000mg/kg treated female mice RSFHJ extracts 1000mg/kg treated female mice RSFHJ extracts 500mg/kg treated female mice
Fig. 4. Changes on the body weights during 14 Days of observation in female mice after single oral treatment with EPP.
No significant changes on body weights were detected in all EPP extract treated female groups as compared with female vehicle control, respectively. Values are expressed as mean ± S. D. of five mice. ‡, all mice were overnight fasted; before means 1 day before injection day 0 means just before injection. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati RhizomaTable 2. Body Weight Gains in Female and Male Mice after Single Oral Treatment with EPP
Groups Interval
Day 0a~Day7 Day 7 ~ Day 13 Day 0 ~ Day 14 Vehicle control
Male 7.62±0.85 1.66±0.71 4.30±0.83
Female 4.72±0.50 1.20±1.41 2.24±1.44
EPP treated male groups
2,000 mg/kg 8.84±0.61 2.48±0.66 5.52±0.37 1,000 mg/kg 7.62±1.37 1.80±0.83 4.52±1.82
500 mg/kg 7.66±0.44 1.88±0.30 5.16±0.36
EPP treated female groups
2,000 mg/kg 4.36±1.56 1.66±0.93 2.02±2.60 1,000 mg/kg 5.04±0.46 1.32±2.27 3.34±1.51
500 mg/kg 6.24±1.19 1.88±1.55 4.62±1.25
Values are expressed as mean ± S. D. g of five mice a Day of treatment after overnight fasted. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma
Table 4. Changes on the Relative Organ Weights Observed in Female and Male Mice after Single Oral Treatment with EPP Groups Relative weights of 12 principal organs (% vs body weights at sacrifice)
Lung Heart Thymus Kidney
L Adrenal
gland L Spleen T/O L Liver Pan S Brain Epi L
/Uterus LN L Vehicle control
Male 0.537±
0.037 0.487±
0.043 0.139±
0.040 0.761±
0.147 0.006±
0.004 0.301±
0.037 0.344±
0.033 4.157±
0.215 0.530±
0.031 1.305±
0.063 0.135±
0.022 0.020±
0.016 Female 0.628±
0.055 0.475±
0.044 0.225±
0.065 0.582±
0.035 0.014±
0.004 0.402±
0.111 0.067±
0.022 3.745±
0.145 0.593±
0.044 1.680±
0.147 0.619±
0.313 0.015±
0.009 EPP treated male groups (mg/kg)
2,000 0.499±
0.018 0.462±
0.033 0.158±
0.029 0.713±
0.100 0.006±
0.003 0.341±
0.059 0.323±
0.029 4.428±
0.496 0.494±
0.029 1.278±
0.069 0.124±
0.010 0.013±
0.008 1,000 0.540±
0.058 0.466±
0.037 0.147±
0.041 0.791±
0.041 0.016±
0.007* 0.288±
0.040 0.347±
0.057 4.028±
0.084 0.478±
0.038 1.290±
0.140 0.122±
0.015 0.013±
0.007 500 0.528±
0.028 0.442±
0.010 0.150±
0.011 0.757±
0.120 0.011±
0.003 0.297±
0.060 0.344±
0.034 4.227±
0.278 0.512±
0.027 1.291±
0.029 0.118±
0.016 0.011±
0.006 EPP treated female groups (mg/kg)
2,000 0.607±
0.029 0.458±
0.024 0.181±
0.056 0.593±
0.055 0.016±
0.009 0.412±
0.091 0.062±
0.009 4.368±
0.632 0.573±
0.062 1.672±
0.209 0.470±
0.182 0.015±
0.006 1,000 0.586±
0.040 0.467±
0.023 0.274±
0.168 0.588±
0.054 0.015±
0.008 0.435±
0.109 0.070±
0.020 4.263±
0.323# 0.576±
0.022 1.584±
0.134 0.524±
0.239 0.013±
0.003 500 0.573±
0.034 0.441±
0.013 0.207±
0.030 0.599±
0.047 0.020±
0.006 0.414±
0.099 0.089±
0.015 3.985±
0.121# 0.539±
0.059 1.552±
0.058 0.725±
0.243 0.014±
0.004
Values are expressed as mean ± S. D. of five mice. L, left sides; T/O, testis/ovary; Pan, pancreas; S, splenic lobes; Epi, epididymis; LN, submandibular lymph node; EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma * p<0.05 as compared with male vehicle control by LSD test # p<0.05 as compared with female vehicle control by MW test6. 부검소견
다양한 정도 [1 ~ 3+]의 폐 충출혈, 가슴샘 위축 (atrophy), 비장 위축, 하악임파절 종대 또는 자궁부종 소견이 암수 매체 대 조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적으로 관찰되었으며, 암 컷 2,000 mg/kg 투여군에 국한되어 경미 [1+]한 간의 비정형성 흰색반점 소견이 1례 (1/5; 20%) 인정된 이외에 의미 있는 육안 부검소견은 인정되지 않았다(Table 5, 6).
Table 5. Necropsy Findings Observed in Male Mice after Single Oral Treatment with EPP (Group summary)
Necropsy Findings at Sacrifice (Day 14) Groups Vehicle control EPP (mg/kg)
2,000 1,000 500
Lung Normal
Congestion 3/5
2/5 4/5
1/5 4/5
1/5 4/5
1/5 Thymus
Normal
Atrophy 3/5
2/5 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 Spleen
Normal
Atrophy 3/5
2/5 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 Lymph nodea
Normal
Hypertrophy 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 4/5
1/5
Values are expressed as observed animals/total observed animals a Bilateral submandibular lymph node. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma7. 조직병리학적 관찰
경미하거나 중등도 [2+]의 폐 충출혈 (Fig. 5), 가슴샘 피질 임파구 감소 (Fig. 6), 신장 낭포 및 염증세포 침윤 (Fig. 7), 비장 임파구 감소 (Fig. 8) 또는 간의 국소 괴사 및 염증세포 침윤 (Fig.
9) 소견이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발 적으로 관찰되었으며, EPP 암컷 1,000 mg/kg 및 수컷 500 mg/kg 투여군에 국한되어 각각 1례 (1/5; 20%)의 경미한 가슴 샘 충혈 (Fig. 5)이 인정된 이외에 의미 있는 조직병리학적 이상 소견은 인정되지 않았다(Table 7, 8).
Table 6. Necropsy Findings Observed in Female Mice after Single Oral Treatment with EPP(Group summary)
Necropsy Findings at Sacrifice (Day 14) Groups Vehicle control EPP (mg/kg)
2,000 1,000 500
Lung Normal
Congestion 4/5
1/5 4/5
1/5 4/5
1/5 4/5
1/5 Thymus
Normal
Atrophy 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 4/5
1/5 Spleen
Normal
Atrophy 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 5/5
0/5 Liver
Normal
Atypical white foci 5/5
0/5 4/5
1/5 5/5
0/5 5/5
0/5 Uterus
Normal
Edematous change 3/5
2/5 3/5
2/5 3/5
2/5 0/5
5/5 Lymph nodea
Normal
Hypertrophy 4/5
1/5 5/5
0/5 5/5
0/5 5/5
0/5
Values are expressed as observed animals/total observed animals a Bilateral submandibular lymph node. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati RhizomaFig. 5. Histopathological changes detected on the lung.
Note that slight (1+) lung focal congestional spots (CG) – thickening of alveolar lung inflammatory cell infiltration with/without focal hemorrhages were randomly detected throughout the experimental groups tested regardless of genders including vehicle controls as sporadic findings not EPP treatment related toxicological signs. A, Alveolar sac-respiratory bronchiole; B, Bronchiole; EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma. All stained with Hematoxylin & Eosin. Scale bars = 160 µm.Fig. 6. Histopathological changes detected on the thymus.
Note that slight [1+] to moderate [2+] decreases of lymphoid cells in thymic cortex (DE;as seen vacuolation or loosening of lymphoid cells) were sporadically detected throughout most of all experimental groups tested regardless of genders including vehicle controls as sporadic findings not EPP treatment related toxicological signs.
In addition, one (1/5; 40%) male treated with 500 mg/kg and one female treated with 1,000mg/kg showed slight congestion (CG) of cortico-medullary junction regions as sporadic accidental finding, it did not showed any dose-relations in the present study. M, Medulla; C, Cortex; EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma. All stained with Hematoxylin & Eosin. Scale bars
= 160 µm.
Fig. 7. Histopathological changes detected on the kidney.
Note that slight [1+] cyst formation (CY) and focal inflammatory cell infiltrations (IF) was detected in one male vehicle control as one of sporadic finding. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma. All Hematoxylin & Eosin stain. Scale bars = 160 µm.Fig. 8. Histopathological changes detected on the spleen.
Note that slight [1+] decreases of lymphoid cells (DE; as seen loosening of red pulp cells) were sporadically detected regardless of genders including vehicle controls as sporadic accidental finings not EPP treatment related toxicological signs. A, Central arteriole; W, White pulp; R, Red pulp. EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma. All stained with Hematoxylin & Eosin. Scale bars= 160 µm.
Table 7. Histopathological Observed in Male Mice after Single Oral Treatment with EPP (Group summary)
Sampled at Sacrifice (Day 14)
Groups Vehicle control EPP (mg/kg)
2,000 1,000 500
Normal Lung
Congestional spot 3/5
2/5 4/5
1/5 4/5
1/5 4/5
1/5 Thymus
Normal Cortex DE*
Congestion
4/5 1/5 0/5
5/5 0/5 0/5
5/5 0/5 0/5
4/5 0/5 1/5 Kidney
Normal
Focal cyst-IF* 4/5
1/5 5/5
0/5 5/5
0/5 5/5
0/5 Spleen
Normal
White pulp DE* 3/5
2/5 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 Liver
Normal
Focal IF-FN* 5/5
0/5 4/5
1/5 5/5
0/5 5/5
0/5
Values are expressed as observed animals/total observed animals a Left submandibular lymph node. *Abbreviations of signs – DE, decreases of lymphoid cells; IF, inflammatory cell infiltrations; FN, focal necrosis EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati RhizomaTable 8. Histopathological Findings Observed in Female Mice after Single Oral Treatment with EPP (Group summary)
Groups Vehicle control EPP (mg/kg)
2,000 1,000 500
Lung Normal
Congestional spot 4/5
1/5 4/5
1/5 4/5
1/5 4/5
1/5 Thymus
Normal Cortex DE*
Congestion
4/5 1/5 0/5
4/5 1/5 0/5
4/5 0/5 1/5
4/5 1/5 0/5 Spleen
Normal
White pulp DE* 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 5/5
0/5 Liver
Normal
Focal IF-FN* 4/5
1/5 4/5
1/5 5/5
0/5 4/5
1/5
Sampled at Sacrifice (Day 14). Values are expressed as observed animals/total observed animals a Left submandibular lymph node. *Abbreviations of signs – DE, decreases of lymphoid cells; IF, inflammatory cell infiltrations; FN, focal necrosis EPP: 9 repetitive steaming and fermenting processed Polygonati Rhizoma고 찰
黃精의 기원은 生品을 건조한 것이 아닌 蒸한 것을 건조한 것이며, 이외 炮製品으로는 酒黃精, 蒸黃精
4), 黑豆煮黃精, 地黃汁 黃精
7), 蜜製黃精
12)등이 있다. 蒸黃精은 원약재를 取하여 淸水를 뿌려서 潤透한 다음 찜통에 넣고 안팎에 윤기가 흐르고 黑色을 띨 때까지 쪄서 꺼내어 햇볕에 말리거나 혹은 外部가 건조되고 內部는 윤기가 있도록 말린다. 그런데 蒸하는 횟수가 증가할수록 외관의 성상에 영향을 주고, 炮製品이 완성되는 비율도 떨어지 며, 浸出物, 總糖 및 還元糖의 함량은 모두 減少된다
4).
黃精을 포제하면 毒性은 줄어들고, 물과 알코올추출물은 모 두 生品보다 함량이 증가되고, 蒸製 시간이 연장됨에 따라서 점 점 증가되므로 蒸製 시간은 10시간이 가장 적합하다고 밝혀졌다
4)
. 또한 炮製品에 따라 蒸黃精은 味가 甘하고 性은 平해서 補脾 氣할 뿐만 아니라 益脾陰하며 補中益氣하는 效能이 增强되고, 酒 黃精은 술의 힘을 빌려 藥力을 돕고 滋膩한 성질이 줄어들어서 濕이 內生하지 않아 補脾하고 潤肺시키며 益腎하는 작용이 높아 진다. 黑豆煮黃精은 黑豆가 味甘性平하기 때문에 그 健脾益氣하 는 效能이 增强되며, 地黃汁黃精은 地黃이 養陰養血, 補益肝腎하 는 效能이 있는데 黃精과 함께 炙하면 黃精의 補腎滋陰하는 效 能이 더욱 强하게 된다
7).
따라서 여러 臨床醫書에서 九蒸黃精을 임상에서 활용하였는 데,《本草備要》
13)에서炮製 : 九蒸九晒用 (仙家以爲芝草之類, 服之長生)라 하여 九蒸九曝한 黃精을 仙家의 靈藥으로 간주하 여 복용하면 長生할 수 있다고 하였으며,《本草綱目》
14)에서
黃精, 補肝明目, 同蔓荊子九蒸九晒為末, 日服之라 하여 蔓荊子 와 같이 九蒸九晒하여 가루내어 복용하면 補肝明目 효능이 있다 고 하였다.《古今醫統大全：夢遺精滑門》
15)에서枸杞子丸 治腎 虛精滑，補精氣. 甘州枸杞子, 黃精 (九蒸九晒. 各等分), 二味相和, 搗作餅子, 焙乾為末, 煉蜜為丸, 梧桐子大, 每服五十九, 空心溫酒 送下라 하여 腎虛精滑한 증상에 應用하였고,《古今醫統大全：
螽斯廣育》
15)에서는還真二七丹壯顏容, 健筋骨, 添精補隨, 烏鬚 黑髮, 久服通仙. 何首烏 (忌鐵器), 黑椹子, 生地黃, 旱蓮草 (以上四
味俱用鮮者, 以石臼內搗, 各取汁半斤), 鹿角膠, 生薑汁, 白蜜 (半 斤), 黃精 (九蒸九晒), 人參, 白茯苓, 小茴香, 枸杞子, 鹿角霜 (各四 兩), 秦椒 (一兩. 共為末用), 上除蜜另煉外, 以諸汁熬將成膏, 方入 蜜攪勻, 然後下人參等六味末藥, 又和勻以新瓷瓶收貯, 隨時以溫熱 酒調下二三匙, 夏月以白湯調.라 하여 筋骨을 튼튼히하고, 精髓 를 補養시키고, 모발과 수염을 검게하는 효능으로 임상에 다용되 었다. 또한《萬病回春 》
16)은一用黃精, 九蒸九晒, 八兩, 為末聽 用이라 하여 九蒸黃精이 聽覺을 回復시키는데 有效하다고 하 였다. 李梴은《醫學入門》
17)에서黃精無毒味甘平, 大補勞傷心 肺清, 除風濕益牌胃氣, 十年專服可長生, 得太陽之精也. 補五勞七 傷, 潤心肺, 除風濕, 益脾胃, 補中益氣, 安五臟, 耐寒暑, 服十年乃 可延年不飢. 其花勝其實, 但難得耳. 二月采正精, 陰乾入藥, 生用.
若單服之, 先用滾水綽去苦汁, 九蒸九晒이라 하여 單用할 경우 九蒸九晒하여 사용한다고 하였다.
최근 한약포제품에 대한 벤조피렌 함량이 문제가 되었으며 黑蔘을 주원료로 하는 건강보조식품의 발암 물질 적발 보도와 및 수입산 乾地黃으로 제조한 유통 熟地黃의 벤조피렌 검출 보도가 있었다. 黑蔘과 熟地黃은 열을 가하는 가공과정을 거친 가공한약 재로, 한약재에 직접 열을 가해 볶는 초탄한약재가 벤조피렌 (benzo[a]pyrene)과 연관이 있을 가능성이 크다고 생각된다. 벤조 피렌은 담배연소나 육류 조리과정에서 높은 빈도로 발견되는 다 환성 탄화수소계 화합물의 대표적인 물질로 저농도로 작용하여 도 발암, 생식독성 및 장기손상을 유발할 수 있다고 알려져 있다
18-20)
. 따라서 黃精에 열을 가하는 蒸法과 乾燥法을 9회 연속 반복
한 九蒸黃精에 벤조피렌이 생성될 가능성이 있다고 사료된다.
벤조피렌의 독성은 식약청 식품첨가물데이타베이스 식품첨 가물 용어집에 의하면 벤조피렌은 황색결정으로, 그 발암성은 체 내에서 대사활성화되어 DNA와 결합함으로써 생긴다. 식품에 미 량 검출되는 benzo[a]pyrene은 대기, 물, 토양유래의 것과, 가열 처리나 훈제공정에 의한 것이 있으며 대도시, 중공업지역의 대기 로부터 1일당 12～80 mg의 benzo[a]pyrene을 인간이 섭취하고 있다고 한다. 한편 benzo[a]pyrene은 탄화수소, 아미노산, 전분, 지방산 등을 600℃ 이상으로 가열함으로써 생성된다.
벤조피렌에 대한 세계적 관점은 발암등급을 분류하는 IARC (International Agency for Research on Cancer(국제암연구소)) 분류체계 그룹1인「인체발암물질」에 해당되는 발암 물질로 알 려져 왔고, 국제암연구소에서 다음과 같은 평가들도 이루어졌다.
인간에게 끼치는 발암성에 대한 부적당한 증거, 동물들에게 끼치 는 발암성에 대한 충분한 증거, 단기간에 이루어진 실험에서 확 인한 발암성의 활동성에 대한 충분한 증거가 그것이다
21,22).
그러나 정상 식사 유래의 benzo[a]pyrene의 1일 섭취량은 40～60 mg/성인 정도라고 생각되고 있고, 유럽과 중국에서만 식 용유지류에 관하여 2 ppb, 10 ppb의 권장기준이 있다. 그러나 다 른 나라에서는 권장기준이나 규제기준이 현재 없는 실정이다.
본 연구에서 EPP에 대한 벤조피렌 함량을 분석한 결과 유의
성 있는 결과는 보이지 않았다. 이에 저자는 마우스 단일투여 독
성 실험을 시행하였다. EPP의 일반적인 독성시험 중 현재 한국
식품의약품안전청 고시 의약품 등의 독성시험기준에 명시되어
있는 마우스 경구 단회투여독성 시험을 실시하였다.
단회투여독성 시험은 장기투여 독성 시험과 생식ㆍ발생독성 시험을 위시한 특수 독성시험에 대한 기초자료를 제공하고, 안전 성을 확보하고자 하였다. 한국식품의약품안전청 고시 [2009-116]
에 따라 EPP 2,000, 1,000 및 500 mg/kg의 농도로 단회 경구 투 여한 다음 14일간 체중 및 임상증상을 관찰하였으며, 14일 후 최 종 부검을 통하여 12개의 주요 장기에 대한 장기 중량, 육안 부 검 및 조직병리학적 관찰을 실시한 결과, 단회투여 독성 시험에 서 설치류 최대 한계투여 용량인 2,000 mg/kg까지 EPP 투여와 관련된 사망례가 인정되지 않았으며, EPP 투여와 관련된 장기중 량 및 육안 부검소견 역시 인정되지 않았고, 3 용량의 모든 수컷 투여군에 국한된 일시적인 軟便 소견을 제외하고, EPP 투여와 관련된 임상증상 역시 인정되지 않았다.
수컷 1,000 mg/kg 투여군과 암컷 1,000 및 500mg/kg 투여 군에 국한되어 인정된 부신 또는 간 중량의 증가는 투여 용량 의 존성이 인정되지 않아, EPP 투여와 관련된 변화는 아닌 것으로 판단되며, 부신과 간의 육안부검 및 조직병리학적 검사 결과에서 도 의미 있는 이상 소견은 인정되지 않았다. 한편 이들 부신 및 간 중량을 포함하여, 본 실험에서 모든 실험동물의 체중 및 장기 중량은 동일한 주령의 마우스들의 정상 범주에 포함되어 관찰되
었다
23,24). 모든 3 용량의 수컷 투여군에서 1 또는 2 례에 국한되
어, 인정된 연변 소견은 출현빈도가 비교적 낮고, 투여 1일 후에 국한되어 일시적으로 인정되어 큰 의미는 없을 것으로 판단되나, 500 mg/kg 이상의 EPP 투여에 의해 연변 등의 경미한 소화기 장애가 초래될 가능성은 배제할 수 없다.
한국식품의약품 안전청 고시 제 2009-116호에 따르면, 설치 류에서 투여한계 농도를 2,000 mg/kg 또는 최대 용해농도로 규 정하고 있으며, 투여 용량은 용액의 경우 20 ml/kg, 현탁액인 경 우 10 ml/kg을 넘지 못하게 규정하고 있다. 본 실험에서 사용한 EPP은 멸균 증류수에 100 mg/ml까지 비교적 잘 용해되었으며, 현재까지 독성에 대한 자료를 찾아 볼 수 없어, 멸균 증류수에 100 mg/ml의 농도까지 용해시켜 20 ml/kg의 용량 즉, 2,000 mg/kg을 최고 농도로 투여하였다.
육안 부검시 인정된 폐 충출혈, 가슴샘 및 비장 위축, 하악임 파절 종대 또는 자궁부종 소견과 조직병리학적 검사에서 관찰된 폐 충출혈, 가슴샘 피질 임파구 감소, 신장 낭포 및 염증세포 침 윤, 비장 임파구 감소 또는 간의 국소 괴사 및 염증세포 침윤 소 견들은 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적 으로 관찰되었으며, 용량 의존성이 인정되지 않아, EPP 투여와 관련 없는 우발적 병소로 판단되고, 암컷 2,000 mg/kg 투여군에 서 육안부검 관찰 시 1례 인정된 간의 비정형성 흰색반점 소견은 조직병리학적 관찰 결과, 간의 표면에 위치한 중등도의 국소 괴 사 및 염증세포 침윤소견으로 인정되었으며, 암컷 1,000mg/kg 및 수컷 500 mg/kg 투여군에 국한되어 각각 1례 (1/5; 20%) 인 정된 가슴샘 충혈 소견 역시 출현빈도가 낮고, 용량 의존성이 전 혀 인정되지 않아, EPP 투여와 관련된 독성 증상으로 간주하기 는 어렵다. 한편 이들 병소들은 정상 마우스에서 드물게 인정되 는 소견으로 알려져 있고
25,26), 자궁은 estrus cycle에 따라 쉽게
변화할 수 있어
27,28), 자궁 부종 소견은 estrus cycle에 따른 이차 적 변화로 판단된다.
US Environmental Protection Agency OPPTS 870.100
29)에 따르면 일반적으로 반수 치사량이 5,000～15,000 mg/kg인 물질 을 무독성 물질로, 5,00～5,000 mg/kg을 비교적 저독성 (Class III) 물질로 규정하고 있으나, 한국식품의약품 안전청 고시 제 2009-116호, 설치류에서 투여한계 농도를 2,000 mg/kg으로 제한 하고 있다. 따라서 본 실험의 마우스 단회 경구투여 독성실험에 서 EPP의 반수치사량 및 개략적 치사량은 각각 2,000 mg/kg 이 상으로 관찰되었으며 무독성 물질로 판단된다고 사료된다.
결 론
본 연구는 구증황정을 제조하고 이것에 대한 벤조피렌 함량 분석을 HPLC를 이용하여 측정하였다. 또한 구증황정에 대한 단 일투여독성 시험을 시행하였는데, 이는 한국식품의약품안전청 고시 [2009-116, 2009]에 따라 실시한 결과, 제조된 구증황정에는 벤조피렌이 함유되어 있지 않았다. 단회투여 독성 시험에서 설치 류 최대 한계투여 용량인 2,000 mg/kg까지 EPP 투여와 관련된 사망례가 인정되지 않았다. EPP 투여와 관련된, 체중, 장기중량, 육안 및 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다. 수컷생쥐 투여군 에서 인정된 일시적인 軟便 소견을 제외하고, EPP 투여와 관련 된 임상증상 역시 인정되지 않았다. EPP의 마우스에 있어서 반 수치사량 및 개략적 치사량은 각각 2,000 mg/kg 이상으로 관찰 되었다. 500 mg/kg이상의 EPP 투여는 軟便과 같은 경미한 위장 관 장애를 초래할 수 있을 것으로 판단되나, 그 정도가 경미하고 일시적으로 인정되어 임상사용에는 별 다른 문제를 일으키지는 않을 것으로 판단된다.
감사의 글
이 논문은 2010 년도 대구한의대학교 기린연구비 지원에 의 한 것임
참고문헌
