Characterization of CH₄-oxidizing and N₂O-reducing Bacterial Consortia Enriched from the Rhizospheres of Maize and Tall Fescue

옥수수와 톨페스큐 근권 유래의 메탄 산화 및 아산화질소 환원 세균 컨소시움 특성

이수정^†, 김서영^†, 김예지, 이윤영, 조경숙*

이화여자대학교환경공학과

Received: February 22, 2021 / Revised: March 24, 2021 / Accepted: March 26, 2021

서 론

대표적인

^non-CO

2온실가스인메탄

^(CH

4

)

과아산화질소

(N

₂

O)

의 지구온난화지수

^(GWP)

는이산화탄소의

²⁸

배와

265

배로이들온실가스저감의필요성이증가하고있다

^{[1, 2].}

CH

₄와

^N

2

O

의

²⁰¹⁸

년배출량은

¹⁹⁹⁰

년에비해각각

^24%

및

28%

증가하여

^[1],

이들온실가스의배출량을최소화할수있

는다양한방법들에대한연구가필요하다

^{. CH}

4와

^N

2

O

배 출을저감할수있는다양한기술중

^,

미생물을이용한생물 학적저감기술은물리

^·

화학적인기술에비해경제적이고환

경친화적방법으로주목을받고있다

^[3].

대부분의생물학적

CH

₄와

^N

2

O

저감기술은

^CH

4를

^CO

2로산화하거나

^{, N}

2

O

를

N

₂로환원할수있는세균을활용하고있다

^{[4, 5].}

세균에의 한

^CH

4산화의최종산물인

^CO

2도온실가스이지만

^{, CH}

4의

GWP

가

^CO

2의

²⁸

배이므로

^{, CH}

4을

^{1 mole}

을제거하면

^CO

2

를

^{28 mole}

제거하는효과가있다

^.

비록

^CH

4산화혹은

^N

2

O

환원세균에관한연구가보고되고있지만

^{[5, 6],}

혁신적인

신기술개발을위해서는새로운미생물자원확보를위한연 구는지속될필요가있다

^{[7, 8].}

근권

(rhizoshpere)

은식물

^,

토양

^,

미생물들이서로상호작 용을하며미생물들이생장할수있는적합한환경을제공 한다

^{[9, 10].}

특히

^,

식물의뿌리는미생물에게필요한영양물 질을제공하여근권미생물의다양성이높아져여러가지다 양한기능을가진미생물자원이근권에많이서식하고있 으므로

^{[9, 10],}

근권

^CH

4산화혹은

^N

2

O

환원세균을탐색하 는것은의의가있다

^.

낙엽송

(Larix decidua)

의비근권

^(bulk) Characterization of CH

4

-oxidizing and N

2

O-reducing Bacterial Consortia Enriched from the Rhizospheres of Maize and Tall Fescue

Soojung Lee

^†

, Seoyoung Kim

^†

, Ye Ji Kim, Yun-Yeong Lee, and Kyung-Suk Cho*

Department of Environmental Science and Engineering, Ewha Womans University, Seoul 03760, Republic of Korea

CH

₄

-oxidizing and N

₂

O-reducing bacterial consortia were enriched from the rhizosphere soils of maize (Zea mays) and tall fescue (Festuca arundinacea). Illumina MiSeq sequencing analysis was performed to com- paratively analyze the bacterial communities of the consortia with those of the rhizosphere soils. Addition- ally, the effect of root exudate on CH

₄

oxidation and N

₂

O reduction activities of the microbes was evaluated.

Although the inoculum sources varied, the CH

₄

-oxidizing and N

₂

O-reducing consortia derived from maize and tall fescue were similar. The predominant methanotrophs in the CH

₄

-oxidizing consortia were Methylo- sarcina, Methylococcus, and Methylocystis. Among the N

2

O-reducing consortia, the representative N

₂

O- reducing bacteria were Cloacibacterium, Azonexus, and Klebsiella. The N

2

O reduction rate of the N

₂

O- reducing consortium from maize rhizosphere and tall fescue rhizosphere increased by 1.6 and 2.7 times with the addition of maize and tall fescue root exudates, respectively. The CH

₄

oxidization activity of the CH

₄

-oxidizing consortia did not increase with the addition of root exudates. The CH

₄

-oxidizing and N

₂

O- reducing consortia can be used as promising bioresources to mitigate non-CO

₂

greenhouse gas emissions during remediation of oil-contaminated soils.

Keywords: Methane, nitrous oxide, bacterial consortium, maize, tall fescue, rhizosphere

*Corresponding author

Tel: +82-2-3277-2393, Fax: +82-2-3277-3275 E-mail: [email protected]

†

These authors contributed equally to this work.

토양및근권에서식하는세균을분석한결과

, methanotrophs

중

^{group I}

에 속하는

Methylococcus, Methylomarinum,

Methylocapsa

가비근권토양보다근권토양에서더많은비

율로존재하였다

^[11].

벼의근권토양의메탄산화세균의 양이비근권토양보다약

⁷

배−

¹⁸

배많았다

^[12].

옥수수근 권 토양에는

^N

2

O

환원 탈질세균인

Agrobacterium

와

Streptomyces

가많이존재하였다

^[13].

토마토와기장의근권 에서는대표적인탈질세균인

Pseudomonas

의비율이비근

권토양보다높았다

^{[14, 15].}

이러한선행연구에서는비근권

토양에비해근권토양에서

^CH

4산화혹은

^N

2

O

환원세균 의비율이높음을보고하고있지만

^,

근권토양으로부터이들

non-CO

₂온실가스분해세균자원을확보하고자하는연구

는거의진행되지않았다

^.

세균은수분함량

^{, pH,}

온도

^,

산소농도

^,

영양분과같은토 양인자들뿐아니라뿌리에의해서도영향을받아근권과 상호작용을하며서식한다

[9].

식물로부터분비되는뿌리삼 출물은유기물질

^,

무기물질등을포함하고있어근권세균의 탄소원이나성장인자로작용한다

^{[16, 17].}

따라서근권토양

은비근권토양과구분되는세균군집특성을보인다

^[16].

또

한

^,

뿌리삼출물의성분은근권세균대사작용에영향을미치 고

^,

이로인해토양에서탄소와질소의생지화학적순환의

변화를야기할수있다

^[18].

따라서근권세균활성에뿌리

삼출물이어떤역할을하는지규명할필요가있다

^.

옥수수

^{(Zea mays)}

와 톨페스큐

(Festuca arundinacea)

는 수염뿌리계

(fibrous root system)

식물로

^,

뿌리가잘발달하 기때문에유류오염토양을정화에널리활용되고있다

^[19

−

22].

근권세균의작용으로유류의생분해과정에서생성되

는

^CH

4와

^N

2

O

의배출량을줄일수있다면

^,

유류오염정화 와더불어온실가스배출량도저감하는효과를얻을수있 을것이다

^.

따라서본연구에서는옥수수와톨페스큐근권 토양을접종원으로활용하여농화배양을통해

^CH

4산화세 균 컨소시움과

^N

2

O

환원 세균 컨소시움을 확보하였다

^.

Illumina MiSeq

염기서열분석법을사용하여세균군집특

성을분석하여식물종류와농화배양조건차이에따른군 집특성을분석하였다

^.

또한이들 컨소시움의

^CH

4 산화와

N

₂

O

환원활성에미치는뿌리삼출물의영향을규명하였다

^.

재료 및 실험방법

비근권 및 근권 토양 시료

서울시서대문구소재이화여자대학교신공학관옥상정 원에서식물이자라지않는부분의토양을비근권토양으로 채취하였다

^.

동일공간에서재배한옥수수

^{(Zea mays)}

와톨 페스큐

(Festuca arundinacea)

의뿌리에붙어있는토양을조 심스럽게털어내어근권토양으로사용하였다

^.

채취한토양

시료를실온에서하루정도풍건한후

^{, 2 mm}

크기의체로

쳐서입자크기가큰것을제거한후얻은토양시료를농화 배양을위한접종원으로사용하였다

^.

CH

4 산화 세균 컨소시움의 농화배양

1,200 ml

혈청병에옥수수혹은톨페스큐근권토양

^{60 g}

과

^CH

4 산화 세균용

^(MOB)

배지

^{100 ml}

를 주입하였다

^. MOB

배지 조성은 다음과 같다

(g/l): MgSO

₄

· 7H

₂

O, 1.0;

CaCl

₂

· 6H

₂

O, 0.2; KNO

₃

, 1; KH

₂

PO

₄

, 0.272; Na

₂

HPO

₄

· 12H

₂

O, 0.717; CuSO

₄

·5H

₂

O, 0.75; trace element

용액

0.25 ml/l. Trace element

용액 조성은다음과 같다

^(mg/l):

FeSO

₄

· 7H

₂

O, 200; ZnSO

₄

· 7H

₂

O, 10; MnCl

₂

· 4H

₂

O, 3;

H

₃

BO

₃

, 30; CoCl

₂

·6H

₂

O, 20; CaCl

₂

· 2H

₂

O, 1; NiCl

₂

·6H

₂

O, 2; Na

₂

MoO

₄

· 2H

₂

O, 3.

부틸고무마개로혈청병의입구를막

은후

^,

실린지를이용해혈청병내부의공기

^{60 ml}

를제거

하였다

^.

고순도

^CH

4 가스

(99.995%, Gas Valley, Korea) 60 ml

를주입해

^,

혈청병상부가스중의

^CH

4 초기농도가

50,000 ppm

이되도록하였다

^.

혈청병을

³⁰

℃에서교반배양

(120 rpm)

하면서

^,

혈청병상부가스를실린지로채취하여

CH

₄농도를분석하였다

^.

혈청병내

^CH

4농도가

^{5 ppm}

미 만이되면배양액에동일양의

^CH

4 가스를주입하여재배양 하였다

^.

이러한재배양을반복하는과정에서산소

^,

질소및 인성분의부족으로

²

일이상

^CH

4감소가관찰되지않으면

^,

클린벤치안에서혈청병마개를열고혈청병내부 공기를

2

시간동안새로운공기로치환하였다

^.

배지내의질소와인 을재공급하기위하여질산농축액

^(KNO

3

, 2 g/l)

과인산농축 액

^(KH

2

PO

₄

, 0.52 g/l; Na

₂

HPO

₄

·12H

₂

O, 1.65 g/l)

을각각

^{1 ml}

씩주입한후

^,

부틸고무마개로혈청병을밀폐한후앞에서 기술한방법과동일하게

^CH

4를주입하였다

^{. 35}

일동안배양 한 후

^{, 2}

개의 혈청병에

¹

차 배양액을 각각

^{60 ml}

씩 넣고

MOB

배지를

^{60 ml}

씩첨가한후

^{, 12}

일동안상기와동일한 방법으로

²

차농화배양하였다

^{. 2}

차농화배양액을

²⁰

분동 안정치시켜토양을가라앉힌후상등액을취하여

^{, 3}

개의혈 청병에각각

²

차배양액

70 ml, MOB

배지

^{70 ml}

를넣고

^, 20

일동안

³

차농화배양하였다

^.

이러한방법으로얻은

³

차 농화배양액을본실험에사용하였다

^.

옥수수와톨페스큐근권 토양에서얻은

³

차농화배양액을각각

^‘CH

4

_M

컨소시움

^’

과

‘CH

₄

_TF

컨소시움

^’

으로명명하였다

^.

N

₂

O 환원 세균 컨소시움 농화배양

1,200 ml

혈청병에근권 토양

^{60 g}

과

^N

2

O

환원 세균용

(NRB)

배지

^{100 ml}

를주입하였다

^{. NRB}

배지조성은다음 과 같다

^{(g/l): KH}

2

PO

₄

, 0.170; MgSO

₄

· 7H

₂

O, 0.571;

CaCl

₂

· 2H

₂

O, 0.452; EDTA, 0.005; FeSO

₄

· 7H

₂

O, 0.005;

trace element

용액

1 ml. Trace element

용액의조성은다

음과 같다

(mg/l): ZnSO

₄

· 7H

₂

O, 0.43; CoCl

₂

· 6H

₂

O, 0.24;

MnCl

₂

· 4H

₂

O, 0.99; CuSO

₄

· 5H

₂

O, 0.25; Na

₂

MoO

₄

· 2H

₂

O, 0.22; NiCl

₂

· 6H

₂

O, 0.19; Na

₂

SeO

₄

, 0.21.

탄소원으로글루코 스

^(C

6

H

₁₂

O

₆

, 9.4 g/l)

와 아세테이트

^(CH

3

COONa· 3H

₂

O, 21.25 g/l)

용액을

^{10 ml/l}

씩배지에추가하였다

^.

고순도

^(99%, Dong-A Specialty Gases Co., Korea)

질소 가스로혈청병 내부공기를약

³

분간치환한다음부틸고무마개로혈청병 의입구를막았다

^.

실린지를이용하여

^N

2

O

가스

(99%, Dong- A Specialty Gases Co., South Korea) 1.2 ml

를주입해혈 청병

^N

2

O

의초기농도가

^{1,000 ppm}

이되도록하였다

^.

혈청

병을

³⁰

℃에서교반배양

^{(120 rpm)}

하면서혈청병상부가스

를실린지로채취하여

^N

2

O

농도를분석하였다

^.

혈청병내

N

₂

O

농도가

^{5 ppm}

미만이되면혈청병에동일양의

^N

2

O

가 스를주입하여재배양하였다

^.

상기와동일한방법으로질소 가스로혈청병내부공기를치환

^,

부틸고무마개로밀폐

^{, N}

2

O

를주입한후

^{, 11}

일동안배양하여

¹

차농화배양액을얻었다

^.

1

차배양액을

²⁰

분동안정치한후상등액을취하여

²

개의

혈청병에각각

^{50 ml}

씩넣고

^{, NRB}

배지

^{50 ml,}

글루코스용 액

^{1 ml,}

아세테이트용액

^{1 ml}

를첨가한후

^,

상기와동일한 방법으로

⁶

일동안

²

차농화배양하였다

^{. 2}

차농화배양액을

3

개의혈청병에각각

^{60 ml}

씩넣은후

^{, NRB}

배지

^{40 ml,}

글 루코스와아세테이트용액을각각

^{1 ml}

씩첨가한후

^{, 8}

일동 안배양하여얻은

³

차농화배양액을본실험에사용하였다

^.

옥수수와톨페스큐근권토양에서얻은

³

차농화배양액을각 각

^‘N

2

O_M

컨소시움

^’

과

^‘N

2

O_TF

컨소시움

^’

으로명명하였다

^.

CH

₄산화와 N2

O

환원 세균 컨소시움의 군집 분석

CH

₄산화및

^N

2

O

환원미생물컨소시움의군집분석을위 해

Illumina MiSeq Sequencing

방법을이용하였다

^.

또한농 화배양에의한미생물군집변화를비교하기위해

^,

비근권 토양

(Non-Rhizo),

옥수수근권토양

^(M),

및톨페스큐근권토 양

^(TF)

의미생물군집도분석하였다

^.

Genomic DNA

추출을위해모든토양시료

(Non-Rhizo, M

및

^TF

시료

⁾

는 풍건 후

^{2 mm}

체로 친 후

, 1.5 ml micro- centrifuge tube

에 각각

^{0.3 g}

씩 소분하였다

^{. CH}

4 산화

(CH

₄

_M, CH

₄

_TF)

및

^N

2

O

환원컨소시움

^(N

2

O_M, N

₂

O_TF)

의경우

^,

각각의농화배양액

^{1 ml}

을

1.5 ml micro-centrifuge tube

에넣고원심분리

(11,000 rpm, 2 min)

하여상등액을제 거한뒤균체만을회수하는과정을

³

회반복하여시료를준 비하였다

^.

모든시료는

genomic DNA

추출전까지

^-20

℃에 냉동보관하였다

. NucleoSpin

^®

Soil Kit (Macherey-Nagel, Germany)

와

Bead beater-8 system (Biospec, USA)

을사용 하여시료의

genomic DNA

를추출하였다

^.

추출방법은제조 사의 메뉴얼을 따랐고

^,

최종 용출 부피를

⁵⁰

μ

^l

로 하여

SpectraMax QuickDrop spectrophotometer (Molecular

Devices, USA)

를이용해추출된

genomic DNA

의농도와순 도를 확인하였다

^.

미생물 군집 분석을 위해

^bacteria

의

16S rRNA

유전자영역을타겟으로하여

^,

중합효소연쇄반

응

(polymerase chain reaction, PCR)

을

^T100

^TM

^Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, USA)

를이용하여수행하였 다

^[19].

프라이머는

515F (5′-TGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)

와

806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)

을 기본 으로 하여

[23, 24], 1

차

^PCR

에서는

amplicon 515F (5'-

TCGTCGGCAGCGTC- AGATGTGTATAAGAGACAG-

GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')

와

amplicon 806R (5'-

GTCTCGTGGGCTCGG- AGATGTGTATAAGAGACAG-

GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')

을프라이머로사용하였

으며

, pre-adapter, sequencing primer sequences, specific locus primers

는밑줄

^,

볼드체

^,

이탤릭체로표기하였다

^[19].

2

차

^PCR

은제조사의메뉴얼에따라

^N7XX

및

^S5XX

인덱스 프라이머를사용하였다

(NexteraXT FC-131-1001, Illumina Inc., USA). 1

차및

²

차

^PCR

은

^Lee

등에서기술한방법에따 라 수행하였다

^[19].

미생물 군집의 염기서열 분석은

Macrogen Incorporation (Korea)

에 의뢰하여

^{, Illumina} MiSeq sequencing platform (Illumina Inc.)

를통해분석하 였다

^.

미생물군집의염기서열은

QIIME software version 1.9

로분석하였다

[25]. Fastp

프로그램을이용하여어댑터 서열을 제거하였으며

[26], Fast Length Adjustment of Short reads (FLASH) software version 1.2.11

을 통해 염 기서열을하나의서열로조립하였다

^[27].

이후길이가

²⁰⁰ bp

보다작고

^{400 bp}

보다큰

^DNA

단편을

FLASH software

로 제거하였다

[27]. CD-HIT-OTU program

을 이용하여

chimeric

시퀀스등을제거한후

^{, 97%}

이상의유사성을갖 는 서열을

clustering

하여

Operational Taxonomic Units (OTUs)

를 구분하였다

[28]. NCBI 16S microbial database

를

reference DB

로활용하여

taxonomic assignment

를수행하 였다

^.

연구에서 얻은 미생물 군집의 염기서열 결과는

National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

에 등록하였다

(Accession number SRP301179).

마지막으로

^, Chao1, Shannon index,

그리고

Simpson index

는

^QIIME software version 1.9

로계산되었다

^[25].

CH

4 산화 컨소시움 N2

O 환원 컨소시움 활성에 미치는 뿌

리삼출물 영향

뿌리삼출물을만들기위해옥수수와톨페스큐의뿌리를

3

−

^{5 cm}

의길이로자른뒤뿌리

^{10 g}

당멸균수

^{100 ml}

를첨 가한 후

⁵⁰

℃에서

²

시간 동안교반하였다

^.

이후상온에서

4

시간정치시킨뒤

^0.45

μ

^m

필터로여과하여얻은여과액을 뿌리삼출물으로사용하였다

^.

이뿌리삼출물에

^MOB

배지혹

은

^NRB

배지성분을첨가하여배지를제조하였다

^. CH

₄ 산화세균컨소시움의

^CH

4 산화활성에미치는뿌리 삼출물의영향을조사하기위해

^{, 600 ml}

혈청병에

^CH

4_

M

컨

소시움

^{25 ml}

과옥수수 뿌리삼출물로 제조한

^MOB

배지

25 ml

을첨가하였다

^.

또한

^{, CH}

4_

TF

컨소시움

^{25 ml}

과톨페 스큐뿌리삼출물로제조한

^MOB

배지

^{25 ml}

을첨가하였 다

^.

대조군으로뿌리삼출물을첨가하지않는

^MOB

배지를 동일량첨가한혈청병을준비하였다

^{. CH}

4가스실린더로부 터

^CH

4 가스를 총

^{60 ml}

주입한 후

^{, 30}

℃에서 교반배양

(120 rpm)

하였다

^{. 3}

시간간격으로혈청병내부가스를채취

하여

^CH

4 농도를분석하였다

^{. CH}

4 분해반응이생물학적반 응임을규명하기위해 혈청병에

^CH

4 산화 세균용배지만

50 ml

주입한조건에서동일한실험을수행하였다

^.

모든실

험을

³

반복수행하였다

^.

N

₂

O

환원세균컨소시움의

^N

2

O

환원활성에미치는뿌리 삼출물의영향 실험도

CH

4 실험과유사하게 수행하였다

. 600 ml

혈청병에

^N

2

O_M

혹은

^N

2

O_TF

컨소시움배양액

40 ml

에옥수수뿌리삼출물첨가

^NRB

배지혹은톨페스큐

뿌리삼출물첨가

^NRB

배지

^{60 ml}

를넣었다

^.

대조군으로각 각의컨소시움배양액에뿌리삼출물을첨가하지않는

^NRB

배지를동일량첨가한것과

^{, NRB}

배지만

^{100 ml}

첨가한혈 청병도준비하였다

^.

혈청병내부를

^N

2 가스로치환후부틸 고무마개로밀봉한후

^{, N}

2

O

가스

^{1.2 ml}

를실린지를이용하 여첨가하였다

^.

각혈청병을

³⁰

℃에서교반배양

^{(120 rpm)}

하 면서

³

시간간격으로

^N

2

O

농도를분석하였다

^.

모든실험을

3

반복수행하였다

^.

CH

₄산화컨소시움의

^CH

4산화능평가를위해

^CH

4평균 산화속도와

^CH

4 최대산화속도를다음의방법으로계산하 였다

^{. CH}

4 산화 평균속도는 혈청병내

^CH

4의농도가 약

500 ppm

이하가될때까지의소요된총배양시간과

^CH

4 제 거량을이용하여계산하였다

^{. CH}

4최대산화속도는지연기 이후

^CH

4분해가활발하게일어나는기간동안제거된

^CH

4

량과소요시간을기준으로계산하였다

^{[29]. N}

2

O

환원컨소 시움의

^N

2

O

환원능평가도

^N

2

O

평균환원속도와

^N

2

O

최 대환원속도로계산하여비교하였다

^[30].

CH

4 및 N2

O 분석 방법

CH

₄ 농도분석을위해 혈청병의

headspace

가스를

^gas-

tight

실린지로

^{100 µl}

취하여 가스 크로마토그래피

^(GC

7890, Agilent Technologies, USA)

를이용하여

^CH

4 농도를 측정하였다

. Flame ionization detector

및

DB-624 capillary column (30 m × 320

μ

^{m × 1.8}

μ

m, J&W Scientific Inc., USA)

을사용하였고

^,

운반기체로는질소를

1.5 ml/min

의속 도로주입하였다

. Split ratio

는

^50:1

의조건에서오븐

¹⁰⁰

℃

^,

주입부

²³⁰

℃

^,

검출부

²³⁰

℃로하였다

^.

N

₂

O

농도분석을위해혈청병의

headspace

가스를

^gas- tight

실린지로

^{50 µl}

취하여가스크로마토그래피

^{(HP 6890} Series, Agilent Technologies)

를이용하여

^N

2

O

농도를측정 하였다

. Electron capture detector

및

CHP-PLOT Q column (30 m × 530

μ

^{m × 40}

μ

m, Agilent)

를사용하였고

^,

운반기체로는질소를

^{60 ml/min}

의속도로주입하였다

^{. Split} ratio

는

^5:1

로 하였고 오븐

⁵⁰

℃

^,

주입부

²³⁰

℃

^,

검출부

250

℃로하였다

^.

통계 분석

각 시료 별 세균 군집의 유사도를 비교하기 위해 문

(phylum),

속

^(genus)

기준주성분분석

(Principal Composition Analysis, PCA)

을

CANOCO 4.5 software (Microcomputer Power, USA)

를이용하여시행하였다

^.

또한

^,

각시료의

^CH

4

산화 속도 혹은

^N

2

O

환원 속도의 유의차 분석을 위해

Microsoft Excel 2016 (Microsoft Co., USA)

를 활용하여

ANOVA

분석을하였다

^.

결과 및 고찰

CH

₄산화와 N2

O

환원 컨소시움의 세균 군집 특성 세균 군집 다양성. 비근권토양

^,

근권토양

^{, CH}

4산화컨소 시움과

^N

2

O

환원컨소시움의세균군집분석결과를

^Table 1

에정리하였다

^.

모든시료의

goods coverage

는

^0.9

이상으 로본분석결과가각시료의세균군집을잘설명하고있음 을알수있다

(Table 1).

토양시료

(Non-Rhizo, M

및

^TF)

의

operational taxonomic units (OTUs)

는

^1,113

−

^1,323

이었으 나

^,

농화배양하여 얻은 컨소시움 시료

^(CH

4_

M, CH

4_

TF, N

₂

O_M, N

₂

O_TF)

의

^OTUs

는

¹⁶⁷

−

⁴¹⁸

이었다

^{. OTUs}

는간

접적으로종다양성을평가할수있는지표로

^[31],

컨소시움

에비해토양시료의종다양성이높음을알수있다

^.

종다 양성 지표인

Chao1, Shannon index

및

Inverse Simpson

index

모두근권토양에비해컨소시움시료에서낮은값을

보였다

^.

이러한결과는농화배양하여얻은컨소시움의세균 군집은접종원에비해종다양성이감소하는것을의미한다

^.

문(Phylum) 수준의 세균 군집 특성. 토양과컨소시움시료 의세균군집을문

^(phylum)

수준에서분석한결과를

^{Fig. 1A}

에도시하였다

^.

문수준에서각시료의미생물군집특성을 비교해보면

^,

비근권토양

(Non-Rhizo)

에서는

Proteobacteria

(52.66%)

가 가장 높은 우점도를 차지하였다

^{(Fig. 1A).}

N

₂

O_TF

컨소시움을제외한모두시료에서

Proteobacteria

의 상대 우점도가 가장 높았다

^{. N}

2

O_TF

컨소시움에서는

Proteobacteria

가두번째로높은우점도

^(30.71%)

를차지하 였다

. Proteobacteria

는토양과근권에서우점하는것으로보

고되었다

[32, 33]. Proteobacteria

는생리적다양성을가져탄 소

^,

질소의생리화학적순환에큰영향을미친다

^[34].

농화배양에따른세균군집변화를비교해보면

^,

농화배양 전시료

(Non-Rhizo, M

및

^TF)

에서두번째및세번째우점 종인

Acidobacteria

와

Actinobacteria

의상대우점도가농화 배양후의컨소시움시료에서각각

^5%

와

^1%

미만으로크게 감소하였다

. Acidobacteria

와

Actinobacteria

는온화한환경 뿐아니라

^,

극한환경

⁽

높은온도

^{, pH,}

염도

^,

압력

⁾

에서도서

식하는 것으로 보고되고 있다

^[35

−

^37].

일부 연구에서는

Acidobacteria

가토양의

^pH

가증가함에따라상대적인풍부 도가감소한다고밝혔다

^{[38, 39].}

본연구의농화배양컨소시

움에서이들의비율이감소하는것으로보아

Acidobacteria

와

Actinobacteria

는

^CH

4산화혹은

^N

2

O

환원에는기여하지 않는것으로추정된다

^.

모든컨소시움시료

^(CH

4_

M, CH

_{4_}

TF, N

₂

O_M, N

₂

O_TF)

에서

Proteobacteria

이외에

Bacteroidetes

가

^5.16

−

^38.91%

로높은 비율을 차지하였다

^{. CH}

4 산화 컨소시움

^(CH

4

_M, CH

₄

_TF)

에서는

Proteobacteria

와

Bacteroidetes

가

^90%

이 상의 비율을 차지하였다

^.

대부분의 메탄 산화 세균은

Proteobacteria

에 속하고

[40], Héry

등은

Bacteroidetes

가

CH

₄산화를위한잠재적인능력이있다고보고하였다

^[41].

또한

^CH

4가풍부하여메탄산화세균이상대적으로많은영 구동토층해빙호수

(permafrost thaw pond)

의미생물군집 중

Proteobacteria

와

Bacteroidetes

가절반이상을차지하였 다

^[42].

N

₂

O

환원컨소시움

^(N

2

O_M, N

₂

O_TF)

을제외한모든시

료에서

Firmicutes

의상대우점도는

^0.09

−

^4.61%

이었다

^.

그 러나

^{, N}

2

O_M

와

^N

2

O_TF

에서

Firmicutes

의상대우점도는 각각

^17.77%

와

^29.07%

로 높은 비율을 차지하였다

^{. N}

2

O reductase

인

^nosZ

는

^N

2

O

를

^N

2로환원가능하게하는효소 인데

[43], Firmicutes

에속하는세균에서이효소가많이발 견되었다

^{[44, 45].}

속(Genus) 수준의 세균 군집 특성 비교. 속수준의세균군 집특성비교를위해각시료별로상위

¹⁰

개의속을선택하 여

^{Fig. 1B}

에도시하였다

^.

토양

(Non-Rhizo, M

및

^TF)

시료 에서

⁸

개속세균

(Sphingomonas, Brevitalea, Vicinamibacter, Luteitalea, Gemmatimonas, Acidibacter, Chthoniobacter,

Unknown)

이 공통적으로 존재하였다

. Non-Rhizo

는

Sphingomonas (8.58%), M

는

Vicinamibacter (7.52%), TF

는

Sphingomonas (6.86%)

의 우점도가 가장 높았다

^{. M,} CH

₄

_M

및

^N

2

O_M

시료는옥수수근권유래임에도불구하 고상위

¹⁰

위속수준에서는공통적으로존재하는세균이없 었다

^.

톨페스큐토양유래시료

^{(TF, CH}

4

_TF, N

₂

O_TF)

에서 도상위

¹⁰

위속수준에서는공통적으로발견되는세균이없 었다

^.

이러한

^,

결과는농화배양전후세균군집구조는접종 원종류

⁽

특히식물종

⁾

보다는

^CH

4산화또는

^N

2

O

환원과같 은특정환경변화에의해더많이영향을받음을시사한다

^. CH

₄산화컨소시움

^(CH

4_

M, CH

_{4_}

TF)

의각각상위

²⁰

위속 세균중에서검출된

methanotrophs

를

^{Table 2}

에정리하였 다

^{. 7}

개속의

methanotrophs (Methylobacter, Methylococcus, Methylogaea, Methylomicrobium, Methylomonas, Table 1. Operational taxonomic units (OTUs) and alpha-diversity index of bacterial communities.

Sample No. of OTUs Chao1

^a

Shannon

^b

Inverse Simpson

^c

Goods coverage

^d

Non-Rhizo 1323 1549 8.073 0.991 0.993

M 1130 1396 8.134 0.991 0.981

TF 1113 1420 8.151 0.992 0.978

CH

₄

_M 167 270 3.776 0.895 0.998

N

₂

O_M 196 338 4.081 0.905 0.993

CH

₄

_TF 249 343 3.424 0.765 0.999

N

₂

O_TF 418 578 3.485 0.820 0.998

Non-Rhizo, non-rhizosphere soil; M, rhizosphere soil of maize; TF, rhizosphere soil of tall fescue; CH

₄

_M, CH

₄

-oxidizing consortium using rhizosphere soil of maize; N

₂

O_M, N

₂

O-reducing consortium using rhizosphere soil of maize; CH

₄

_TF, CH

₄

-oxidizing consortium using rhizosphere soil of tall fescue; N

₂

O_TF, N

₂

O-reducing consortium using rhizosphere soil of tall fescue.

a

The Chao1 index is used to assess the bacterial population richness.

b

The Shannon diversity index is used to assess the diversity of the bacterial population and it describes both species abundance and evenness. It is calculated as H = -Σ(p

_i

ln p

_i

), where p

_i

is the proportion of i

^th

species in total number of species.

c

The Inverse Simpson diversity index is calculated as 1 −D. D = Σ p

i

, where p

_i

is the proportion of i

^th

species in total number of species. Simpson’s index(D) indicates the probability of two randomly selected individuals coincide as the same species.

d

Good coverage is calculated as C = 1 −(s/n), where s is the number of unique OTUs and n is the number of individuals of each

species. The index gives a relative measure of how well the sample represents a large environment.

Methylosarcina, Methylocystis)

중

, Methylocystis

를제외한 나머지는

Group I Gamma Proteobacteria

에 해당된다

^.

Group I

은포름알데히드동화를위해리불로스일인산경로

를 가지는 반면

, Methylocystis

는

Group II alpha

Proteobacteria

에해당하며세린경로를통해포름알데히드

를동화한다

^[4].

CH

_{4_}

M

의경우

^,

군집내

^31.91%

가

methanotrophs

이었고

^,

Methylococcus (16.93%)

와

Methylosarcina (12.97%)

의 우

Fig. 1. Comparison of the bacterial community structure at the phylum (A) and genus (B) levels. The top 10 genera of each

sample were analyzed separately, and the remainders were grouped as ‘others’. Non-Rhizo, non-rhizosphere soil; M, rhizosphere soil of

maize; TF, rhizosphere soil of tall fescue; CH

₄

_M, CH

₄

-oxidizing consortium using rhizosphere soil of maize; N

₂

O_M, N

₂

O-reducing

consortium using rhizosphere soil of maize; CH

₄

_TF, CH

₄

-oxidizing consortium using rhizosphere soil of tall fescue; N

₂

O_TF, N

₂

O-

reducing consortium using rhizosphere soil of tall fescue.