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2010 年 2 月 碩士學位論文
고성능 액체 크로마토그래피에서 다당유도체로부터 유도된 키랄
컬럼을 이용한 광학분할
朝鮮大學校 大學院
藥 學 科
黄 虎
고성능 액체 크로마토그래피에서 다당유도체로부터 유도된 키랄
컬럼을 이용한 광학분할
Enantiomer separation using chiral columns derived from polysaccharides by HPLC
2009 年 11 月 24 日
朝鮮大學校 大學院
藥 學 科
黄 虎
고성능 액체 크로마토그래피에서 다당유도체로부터 유도된 키랄
컬럼을 이용한 광학분할
指導敎授 李 元 宰
이 論文을 藥學 碩士學位申請 論文으로 提出함.
2009 年 11 月 24 日
朝鮮大學校 大學院
藥 學 科
黄 虎
黄虎의 碩士學位論文을 認准함
委員長 朝鮮大學校 敎 授 白 采 善 印 委 員 朝鮮大學校 敎 授 洪 俊 憙 印 委 員 朝鮮大學校 敎 授 李 元 宰 印
2009 年 11 月 24 日
朝鮮大學校 大學院
제1 장
다당유도체로 공유결합된 키랄 컬럼에서 이동상과 분석 물질의 용매가 거울상 이성질체의 광학분할에 미치는 영향
1.1 요약································································1
1.2 ABSTRACT····················································2
1.3 서론································································3
1.4 실험································································5
1.4.1 기기 및 시약··········································5
1.5 결과 및 고찰··················································7
1.6 결론······························································23
1.7 참고논문························································24
제2 장
다당유도체를 기초로 한 키랄 컬럼에서 이동상에서의 산 또는 염기 첨가제가 아미노 알코올의 광학분리에 미치는 영향
2.1 요약····························································26
2.2 ABSTRACT················································27
2.3 서론····························································28
2.4 실험····························································30
2.4.1 기기시약
··················································30
2.5 결과및고찰···················································31
2.6 결론····························································42
2.7 참고논문······················································43
LIST OF TABLES
제 1 장
Table 1. Effect of mobile phase on enantiomer separation of N-BOC α-amino acids on Chiralpak IC···10 Table 2. Effect of mobile phase on enantiomer separation of N-BOC
α-amino acid ethyl esters···11 Table 3. Effect of solute solvent on enantiomer separation of N-BOC α-amino acid ethyl esters using 5 % IPA/hexane as a mobile phase···15 Table 4. Effect of solute solvent on enantiomer separation of N-BOC α-amino acid ethyl esters using 2 % IPA/hexane as a mobile phase···17
LIST OF TABLES
제 2 장
Table 5. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile phase with acid or base additive on Chiralcel OD···36 Table 6. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile
phase with acid or base additive on Chiralpak AD···37 Table 7. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile
phase with acid or base additive on Chiralpak AS···38 Table 8. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile
phase with acid or base additive on Chiralcel OF···39
LIST OF FIGURES
제 1 장
Figure 1. Preparation of racemic and (L)-N-BOC protected α-amino acid and its ethyl ester···6 Figure 2. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N-BOC methionine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: IPA, middle: EtOH, right: THF) using 5%IPA/hexane (V/V) as a mobile phase···16 Figure 3. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N-BOC
alanine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: IPA, middle: EtOH, right: THF) using 2%IPA/hexane (V/V) as a mobile phase···18 Figure 4. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N- BOC methionine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: IPA, middle: EtOH, right:
THF) using 2%IPA/hexane (V/V) as a mobile pha···19 Figure 5. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N- BOC phenylalanine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: IPA, middle: EtOH, right:
THF) using 2%IPA/hexane (V/V) as a mobile phase···20
Figure 6. Chromatograms of preparative enantiomer separation of racemic N-BOC methionine ethyl ester [injected amount:
5μg(the bottom), 25μg, 50μg, 75μg, 100μg(the top)]
dissolved in solute solvent of IPA using 2% IPA/hexane
(V/V) as a mobile
phase···22
LIST OF FIGURES
제 2 장
Figure 7. Typical chromatograms of enantiomer separation of propranolol on Chiralcel OD using EtOH/hexane/TFA=30/70/
0.1(V/V/V)(the top), EtOH/ hexane/Et3N=30/70/0.1(V/V/V) (the middle) and EtOH/hexane/TFA/Et3N= 30/70/0.05/0.05 (V/V/V/V) (the bottom) as the mobile phase (injection amount 10 μg).···41
1
1.1 요약
공유결합된 다당유도체에서 유도된 키랄 컬럼인 Chiralpak IC 을 사용하여 N- BOC α-amino acid 와 그들의 ethyl ester 유도체의 액체크로마토그래피 거울상 이성질체의 분리를 수행하였다. 다양한 이동상에서 공유결합 된 키랄 컬럼인 Chiralpak IC 에서 거울상 이성질체가 분리된 실험결과를 나타내었으며, 광학분할의 선택성과 분리인자가 이동상에 따라 크게 영향을 받았다. 또한 동일한 이동상에서 분석물질의 녹이는 용매에 따라 거울상 이성질체의 분리에 미치는 영향과 분석용 컬럼에서 거울상 이성질체의 분리의 여러 예를 나타내었다.
2
1.2 ABSTRACT
Liquid chromatographic enantiomer separation of N-tert-butoxycarbonyl (BOC) α-amino acids and their ethyl esters was performed on covalently immobilized chiral column (Chiralpak IC) derived from polysaccharide derivative. The solvent versatility of the covalently immobilized Chiralpak IC in enantiomer separation of N-BOC α-amino acid ethyl ester derivatives was shown and the chromatographic parameters of their enantioselectivities and resolution factors were greatly influenced by the nature of the mobile phase. Also the effect on the dissolving solvent for these analytes on the enantiomer separation using the same mobile phase and the examples of preparative enantiomer separation on analytical column were shown.
3
1.3 서론
고성능 액체 크로마토그래피에서 다당류(셀루로스와 아밀로오스)에서 유도된 키랄 컬럼을 이용하여 많은 거울상 이성질체 화합물이 효과적으로 분리될 수 있음이 보고되어 왔다.1-3 이러한 다당류에서 유도된 키랄 컬럼은 키랄 선택자로 사용되는 다당류 유도체가 실리카 모체에 코팅되었기 때문에, 컬럼의 안정성 측면에서 본질적인 약점을 갖고 있어 이동상이나 사용하는 용매에 제한이 있다. 그러므로 키랄 선택자가 코팅된 이러한 유형의 키랄 컬럼은 다당유도체의 키랄 선택자를 부분적으로 혹은 전부 녹이는 할로겐화 용매(디클로로메탄과 클로로포름), 테트라히드로푸란, 에틸 아세테이트 및 아세톤 등 용매는 이동상 뿐만 아니라 소량의 분석물의 용매라도 사용이 제한되며 이러한 분석조건에 따르지 않을 경우 컬럼 자체를 망가뜨릴 수 있다.4-
5 대표적으로 순상 크로마토그래피(normal phase chromatography)에서 코팅 형태의 다당류 유도체를 사용한 키랄 컬럼에서 표준 이동상으로 알코올(주로 2- propanol 사용)과 hydrocarbon(주로 hexane 사용)이 혼합용매로 국한되어 사용된다.3 코팅 형태의 키랄 컬럼에서 이동상 용매의 제한은 in-situ 상태의 반응분석이나 분석물질의 용해도와 관련된 측면에서, 그리고 preparative separation 에서는 매우 큰 단점으로 부각되게 된다.
이러한 이유로 최근 들어 다당 유도체인 키랄 선택자의 코팅 형태의 키랄 컬럼 대신 공유결합시킨 키랄 컬럼이 개발되어 상품화되었고 범용적인 용매를 사용할 수 있는 장점들을 이용한 광학분할 결과가 보고되고 있다.4-9 아주 최근에 키랄 선택자인 cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)를 공유결합으로 고정시
4
킨 키랄 컬럼인 Chiralpak IC 가 개발되어 소개되었다.10,11 현재까지 Chiralpak IC 를 이용한 연구는 몇몇 시료를 대상으로 공유결합으로 고정시킨 키랄 컬럼끼리 비교연구한 결과가 부분적으로 몇 논문에서 보고되어 있고 11-13 N- phthaloyl 또는 fluorenylmethoxycarbonyl α-amino acids, non-steroidal anti- inflammatory drugs 같이 일련의 시료에 대한 광학분할결과는 본 연구팀에 의해서만 발표되어 있다.14,15 본 연구에서는 새롭게 개발된 다당유도체에서 유도된 공유결합 타입의 키랄컬럼인 Chiralpak IC 에서 이동상과 분석물질의 용매의 변화에 따른 광학분할의 유용성을 보기 위하여 키랄 물질의 선구물질이나 키랄 중간체로서 매우 유용하게 사용되고 있는 N-protected t- butoxycarbonyl (BOC) α-amino acid 와 그들의 ethyl ester 유도체의 광학분리를 Chiralpak IC 를 이용하여 시도하였으며 그 실험결과를 보고하고자 한다.
5
1.4 실험
1.4.1 기기 및 시약
액체 크로마토그래피 실험은 다음의 기기들로 구성된 HPLC 를 사용하여 상온에서 수행하였다. HPLC 구성 기기로 Waters model 1525 binary pump, 20 μL loop 를 가진 Rheodyne model 7125 주입기, dual absorbance detector (Waters 2487 detector)를 사용하였다. 키랄 컬럼으로 는 Chiralpak IC (250 mm L x 4.6 mm I.D. 일본 Daicel Chemical 회사）컬럼을 사용하였다. HPLC 용매로 사용하는 hexane, 2-propanol, ethanol (EtOH), tetrahydrofuran (THF)와 methyl t-butyl ether (MTBE)들은 J. T Baker 에서 dioxane 은 Fluka 회사에서 구입하였다. Trifluoroacetic acid (TFA)와 실험에 사용된 α-amino acid 등 시약들은 모두 Aldrich 또는 Sigma 회사로부터 구입하였다. 분석물질로서 라세미(racemic)와 L-form 의 N-BOC protected α-amino acid 와 ethyl ester 유도체들을 다음과 같은 방법으로 합성하였다.16,17 각각의 α-amino acid 10 mmol 을 dioxane 수용액 과 1 N NaOH 용액에 녹인 다음 (BOC)2O 11 mmol 을 가하여 5 시간 동안 상온에서 교반시킨 후, 반응액을 dichloromethane 로 추출하여 각각의 N-BOC α-amino acid 를 합성하였다. N-BOC α-amino acid 0.5 mmol 을 ethanol 10 ml 에 녹인 다음 DCC 를 0.6 mmol 을 가한 후 상온에서 15 시간 동안 반응시킨 후 dichloromethane 로 추출하여 N-BOC α-amino acid ethyl ester 를 합성하였다. (Fig. 1)
6
Fig. 1. Preparation of racemic and (L)-N-BOC protected α-amino acid and
its ethyl ester.
7
1.5 결과 및 고찰
Table 1 과 2 는 키랄 선택자가 공유결합으로 지지된 Chiralpak IC 컬럼을
이용하여 여러 가지의 N-BOC α-amino acid 와 N-BOC α-amino acid ethyl
ester 들의 분리가 이동상의 종류에 따른 효과에 대한 실험결과를 나타내고
있다. N-BOC α-amino acid 와 이들의 ethyl ester 유도체의 광학분할의 선택
성과 머무름 시간 등 HPLC 파라미터가 이동상의 종류에 따라 영향을 많이
받고 있음을 보여주고 있다.11 Table 1 의 N-BOC α-amino acid 거울상
이성질체 분리의 경우, 2-proPanol 와 hexane 을 사용하는 표준 이동상에서
보다 도 코팅 형태의 컬럼에서 사용할 수 없는 MTBE, dioxane, THF 를 사용하
는 비표준 이동상에서 더 좋은 분리 결과를 보여주고 있다. 일반적으로는 비
표준 이동상보다도 표준 이동상에서 더 좋은 광학분리 결과를 보여준 것으로
보고되어 왔다.4-5 특히 0.1% TFA 를 포함한 MTBE/ hexane 의 이동상에서
N-BOC leucine 을 제외하고는 상당히 높은 분리의 선택성과 (α=1.10~2.05)
좋은 분리인자 (Rs=0.83~7.50)를 보여주었다.
이에 반해, Table 2 의 N-BOC α-amino acid ethyl ester 거울상 이성질체
분리의 경우, 일반적인 경향으로 2% 2-propanol/hexane 과 50% MTBE/
hexane 를 이동상으로 사용했을 때 좋은 광학분할 결과를 나타내었고, 5% THF
8
/hexane 를 이동상으로 사용했을 때 가장 낮은 광학분할 결과를 주고
있다. 특히 표준 이동상인 2% 2-propanol/hexane 을 사용할 경우, 좋은
선택인자(α=1.12~1.58)와 분리인자 (Rs=0.81~5.47)를 보여주었다. 비표준
이동상으로는 50% MTBE/hexane 를 이동상으로 사용했을 때 상당히 좋은
결과를 가져왔는데 그 가운데 N-BOC alanine ethyl ester 와 N-BOC valine
ethyl ester 의 광학분할에서 각각 가장 큰 선택성과 (α=1.87, 1.58) 가장 높은
분리인자를 (Rs=3.50, 1.79) 보여주었다. 본 연구의 N-BOC α-amino acid 와
이들의 ethyl ester 분석을 위해 UV 220nm 조건하에서 검출하였는데 표 1,
2 에서 사용한 이들 용매 이외에 ethylene chloride, ethyl acetate, dibutyl
ether 등을 이동상의 용매로 사용할 때에는 용매의 cut-off 와 분석물질의 낮은
UV 감도로 인해 검출되지 않았다. 또한 N-BOC α-amino acid 의 분리에는
이동상에서 dioxane/hexane 을 사용시 UV 220nm 조건하에서 검출이
가능하였으나 N-BOC α-amino acid ethyl ester 의 분리에는 가능하지
않았다. 이동상의 변화 시 광학 분할한N-BOC α-amino acid 와 이들의 ethyl
ester 의 용출순서를 비교하여 보면 각각 이동상에서의 용출순서들이 이동상의
변화에 따라 항상 동일하게 나타나지 않는 것으로 보아 각각의 이동상에서의
chiral recognition 메커니즘이 동일한 유형으로 진행되지 않는 것으로 여겨
진다.5 N-BOC 으로 보호된 alanine, valine, leucine 의 α-amino acid 로
9
제한시켰을 때 (이들 시료의 키랄 중심에 간단한 알킬 그룹만 존재하므로),
이들이 광학분리 될 경우 늦게 용출되어 나오는 것은 D-이성질체로 일관성이
있으나 광학분할 선택성에서는 일정한 경향을 찾아보기 어려웠으며 이들 ethyl
ester 화합물의 경우에는 더욱더 뚜렷한 일관성을 보이지 않았다.
10
Table 1. Effect of mobile phase on the enantiomer separation of N-BOC α-amino acids on Chiralpak IC.
Mobile phase
5% 2-propanol/hexane (V/V) with 0.1% TFA
5% THF/hexane (V/V) with 0.1% TFA
10% Dioxane/hexane (V/V) with 0.1% TFA
45% MTBE/hexane (V/V)with 0.1% TFA Analyte αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d
Ala 1.11 2.35 0.97 D 1.47 6.92 3.81 D 1.56 7.00 6.69 D 2.05 3.41 7.50 D Leu 1.27 1.45 1.58 D 1.00 4.91 - - 1.00 3.57 - - 1.00 2.67 - - Met 1.08 3.72 0.98 L 1.16 10.35 1.95 D 1.16 9.93 2.22 D 1.11 5.09 1.35 D PG 1.13 3.41 1.84 L 1.04 10.75 0.46 L 1.04 9.41 0.29 L 1.42 2.61 3.86 L Phe 1.06 3.14 0.80 D 1.05 10.42 0.76 L 1.15 8.78 1.72 L 1.42 4.57 3.81 L Val 1.00 1.47 - - 1.29 3.28 4.34 D 1.16 3.51 2.06 D 1.10 1.88 0.83 D
Chromatographic conditions: Flow rate=1mL/min; Detection UV 220 nm; a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer. c Resolution factor. d The absolute configuration of the second eluted enantiomer.
11
Table 2. Effect of mobile phase on enantiomer separation of N-BOC α-amino acid ethyl esters.
Mobile phase
5% 2-propanol/hexane (V/V)
2% 2-propanol/hexane (V/V)
5% THF/hexane (V/V) 50% MTBE/hexane (V/V)
Analyte αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d Ala 1.08 1.16 0.48 D 1.12 2.97 0.94 D 1.38 2.48 1.07 L 1.87 1.92 3.50 D Leu 1.32 0.31 1.24 L 1.35 0.72 1.63 L 1.37 0.87 1.49 L 1.37 0.86 1.49 D Met 1.42 0.90 2.11 L 1.58 2.36 3.15 L 1.13 1.36 0.86 L 1.50 2.44 2.48 D PG 1.39 2.27 4.88 L 1.35 4.20 5.47 L 1.77 1.67 3.03 L 1.41 2.04 3.38 L Phe 1.35 0.96 1.59 L 1.47 2.45 2.51 L 1.00 1.27 - - 1.12 2.81 0.54 L Val 1.11 0.40 0.17 L 1.15 0.82 0.81 L 1.10 1.12 0.24 L 1.58 0.74 1.79 D
Chromatographic conditions: Flow rate=1mL/min; Detection UV 220 nm; a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer. c Resolution factor. d The absolute configuration of the second eluted enantiomer.
12
Table 3 과 Fig. 2, 그리고 Table 4 와 Fig. 3~5 는 2-propanol/hexane 을
이용하는 표준 이동상에서 분석물질을 녹이는 용매의 종류에 따라 N-BOC α-
amino acid ethyl ester 들의 광학적 분리에 영향을 주는 실험결과와
이것들을 보여주는 대표적인 분리의 크로마토그램이다. Table 3 에서
보여주는 것처럼, 5% 2-propanol/hexane 을 이용하는 이동상에서 분석물질을
이동상의 용매로 쓰이는 2-propanol 대신 EtOH 이나 THF 에 녹여 시료를
주입할 경우, 분석물질을 녹이는 용매의 종류가 광학적 분리에 상당히 영향을
미치는 것을 보여주고 있다. 2-propanol/hexane 을 이용하는 표준 이동상에서
일반적으로 시료용매로 2-propanol 대신 다른 용매를 사용시, 광학적인 분리가
감소하거나 분리 봉우리 모양에 영향을 미치거나 꼬리 끌기 봉우리로 인해
바탕선 분리가 되지 않는 등 부정적인 영향을 나타내었다. 한 예로 Fig. 2 의
BOC-methionine ethyl ester 경우, 5% 2-propanol/hexane 을 이용하는
이동상에서 THF 를 시료의 용매로 사용할 때가 2-propanol 를 사용하는 때보다
분리의 선택성은 가 1.42 에서 1.84 로 증가하여 외형적인 분리는 더 잘 되는
것처럼 보이나 첫 번째 피크의 꼬리 끌기로 인해 바탕선 분리가 되지 않아
분리인자(Rs)는 계산할 수 없는 결과를 보여주고 있다. 또한 2% 2-
propanol/hexane 을 이용하는 이동상을 사용하는 Table 4 와 Fig. 3~5 에서
보는 바와 같이 2-propanol/hexane 의 이동상에서 분석물질 용매가 2-
13
propanol 에서 THF 로 바뀔 때 보다는 EtOH 로 바뀌었을 때 분석결과에 더 큰
영향을 주고 있다. 그 예로Fig. 3 에서 N-BOC alanine ethyl ester 분리를 위해
분석물질 용매로 2-propanol 를 사용할 때 어느 정도 분리가 되었지만 (α =
1.12, Rs = 0.94), EtOH 을 사용할 경우에는 전혀 분리가 되지 않았다. 특히 Fig.
4 와 Fig. 5 에서 보여주는 것같이 N-BOC methionine ethyl ester 와 N-BOC
phenylalanine ethyl ester 광학적 분리를 위해 분석물질 용매로 이동상에서
사용된 2-propanol 대신 EtOH 을 사용할 때, 첫 번째로 용출되는 피크는 매우
예리하게 나타나지만 두 번째로 용출되는 피크는 매우 완만하게 나타난다.
이러한 현상은 시료 용매로 사용되는 강한 극성의 양성자성 용매인 EtOH 에
의한 광학이성질체와의 강한 solvation 효과가 chiral recognition 메커니즘에
직접적인 영향을 주는 것으로 설명되어 진다. 실제로 chiral 컬럼의 chiral
selector 와 분석하고자 하는 분석물질 사이에 일어나는 chiral recognition
과정은 분석물질이 주입될 때 분석물질이 녹이는 용매에 의해 solvation 되어
있다가 chiral recognition 메커니즘이 진행되기 전 desolvation 되는 것과
동시에 chiral selector 와 chiral recognition interaction 이 일어나게 되며, 그
이후 각각의 분리된 거울상 이성질체는 다시 용매에 의해 solvation 되는 순서로
진행되기 때문에 분석물질 용매로 더 극성인 EtOH 의 강한 solvation 효과가
광학분할에 직접적인 영향을 준 것이라 설명된다. 결과적으로 분석물질을
14
녹이는 용매로 이동상에서 사용되는 용매가 아닌 다른 용매를 사용할 경우,
분석물질과 함께 매우 작은 용매의 양이 주입된다 해도 분석물질을 녹이는
용매가 광학적 분리에 상당히 직접적인 영향을 줄 수 있음을 고려해야 할
것이다. 특히 순상 크로마토그래피의 경우 본 실험의 경우와 같이 이동상이
2~5% 2-propanol/hexane 같이 비극성 성질이 매우 강한 경우에 이러한
현상이 더욱 크게 나타날 것으로 생각된다. 분석물질을 녹이는 용매가
광학적인 분리에 미치는 영향을 최소화 하기 위해서는 가능하면 분리에서
사용하는 이동상을 분석물질을 녹이는 용매로 쓰는 것이 가장
이상적이다. 그러나 시료의 용해도의 한계 때문에 실제적인 상황에서 그렇게
되기는 어렵기 때문에 이동상에서 사용하는 alcohol 같은 용해도가 좋은 극성
용매를 사용하되 주입하는 용매의 양을 최소한으로 하도록 하는 것이
바람직하다. 이러한 측면은 asymmetric synthesis 의 in-situ 상태의
반응분석이나 on-line 상의 반응분석의 사용되는 용매가 이동상에서 사용하는
용매와 많이 다르기 때문에 in-situ 나 on-line 상의 반응에서 직접 분리분석을
하는 경우에는 상당히 유의할 필요가 있다.5,15
15
Table 3. Effect of solute solvent on enantiomer separation of N-BOC α-amino acid ethyl esters using 5 % 2- propanol/hexane as a mobile phase.
Solute solvent
2-propanol EtOH THF
Analyte αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d
Ala 1.08 1.16 0.48 D 1.00 1.18 - - 1.00 1.14 - - Met 1.42 0.90 2.11 L 1.16 0.92 1.70 L 1.84 0.69 n.c.e L Phe 1.35 0.96 1.59 L 1.13 1.01 1.08 L 1.84 0.70 n.c.e L
Chromatographic conditions: Flow rate=1mL/min; Detection UV 220 nm; a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer. c Resolution factor. d The absolute configuration of the second eluted enantiomer. e Not calculable.
16
Time. min Time. min Time. min
Fig. 2. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N-BOC methionine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: 2-propanol, middle: EtOH, right: THF) using 5% 2-propanol/hexane (V/V) as a mobile phase. See Table 3 for chromatographic conditions and results.
17
Table 4. Effect of solute solvent on enantiomer separation of N-BOC α-amino acid ethyl esters using 2 % 2- propanol/hexane as a mobile phase.
Solute solvent
2-propanol EtOH THF
Analyte αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d
Ala 1.12 2.97 0.94 D 1.00 2.13 - - 1.11 2.96 0.76 D Met 1.58 2.36 3.15 L 1.12 2.18 0.91 L 1.58 2.50 3.01 L Phe 1.47 2.45 2.51 L 1.19 2.17 0.78 L 1.47 2.61 2.44 L
Chromatographic conditions: Flow rate=1mL/min; Detection UV 220 nm a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer. c Resolution factor. dThe absolute configuration of the second eluted enantiomer.
18
Time. min Time. min Time. min
Fig. 3. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N-BOC alanine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: 2-propanol, middle: EtOH, right: THF) using 2% 2-propanol/hexane (V/V) as a mobile phase. See Table 4 for chromatographic conditions and results.
19
Time. min Time. min Time. min
Fig. 4. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N-BOC methionine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: 2-propanol, middle: EtOH, right: THF) using 2% 2-propanol/hexane (V/V) as a mobile phase. See Table 4 for chromatographic conditions and results.
20
Time. min Time. min Time. min
Fig. 5. Chromatograms of enantiomer separation of racemic N-BOC phenylalanine ethyl ester (injected amount: 5μg) dissolved in solute solvent (left: 2-propanol, middle: EtOH, right: THF) using 2% 2-propanol/hexane (V/V) as a mobile phase. See Table 4 for chromatographic conditions and results.
21
Fig. 6 은 2% 2-propanol/hexane 이동상에서 라세미 혼합물인 N-BOC methionine acid ethyl ester 시료를 녹이는 용매로서 2-propanol 를 이용하여 Chiralpak IC 분석용 컬럼에서(250 mm L x 4.6 mm I.D.) 실험한 분취형 광학분할 크로마토그램(preparative type enantiomer separation chromategram )이다. 5 μg, 25 μg, 50 μg, 75 μg, 100 μg 의 시료의 양에 따른 각각의 분취형 크로마토그램에서 보는 바와 같이 분석용 컬럼에서 1 회 주입으로 75 μg 까지는 어느 정도 광학순도가 높은 물질을 얻을 수 있으리라 기대한다.
그러나 위의 분석조건과 다르게 2-propanol 대신 EtOH 이나 THF 를 시료의 용매로 사용하거나 5% 2-propanol/hexane 이동상에서는 위에서의 광학적 분리보다는 좋지 못한 제조용 분리를 보여주었다. 키랄 미량시료를 분석하는 경우보다 분취목적의 키랄 제조용 분리의 경우가 시료의 양이 더욱 증가되므로 이동상에서 사용되는 용매의 조건 또는 이동상과 다른 용매의 사용 여부, 시료 농도에 따른 영향 등으로 시료용 용매의 역할이 분리에 더 크게 작용 되어 질것으로 예상되므로 이러한 점들을 고려해야 할 것이다.
22 Time. min
Fig. 6. Chromatograms of preparative enantiomer separation of racemic N-BOC methionine ethyl ester [injected amount: 5μg(the bottom), 25μg, 50μg, 75μg, 100μg(the top)] dissolved in solute solvent of 2-propanol using 2% 2- propanol/hexane (V/V) as a mobile phase.
23 1.6 결론
본 연구에서는 최근 소개된 다당유도체에서 유도된 공유결합 형태의 키랄
컬럼인 Chiralpak IC 에서 N-BOC α-amino acid 와 이들의 ethyl ester 유도체의
광학이성질체의 분리에 관한 액체크로마토그래피 연구를 수행하였다. Chiralpak
IC 는 공유결합 형태의 키랄 컬럼이므로 이동상 용매의 제한을 받지 않기
때문에 in-situ 상태 또는 on-line 상의 반응에서 광학순도를 측정하는 직접적인
분리 분석이 가능하므로 코팅 형태의 키랄 컬럼보다 훨씬 유용한 것을 알 수
있다.4,5,15 표준 이동상인 2-propanol/hexane 과 다른 이동상들이 분리에
미치는 결과를 비교하였으며, 2-propanol/hexane 의 이동상에서 분석물질을
녹이는 용매가 분리에 미치는 영향과 분석용 컬럼에서 분취분석에 관련된
결과에 대해서도 논의하였다.
24
1.7 참고문헌
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25
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New York, 1984.
26
2.1 요약
다당유도체를 기초로 하는 키랄 컬럼들을 사용하여 여러 amino alcohol 의 거울상 이성질체를 산 또는 염기 등의 첨가제가 각각 포함된 이동상뿐만 아니라 사용한 키랄 컬럼에 따라 광학 분리된 선택성과 분리인자가 크게 영향을 받았다.
특히 Chiralcel OD 컬럼에서 이동상에 0.1% trifluoroacetic acid 를 산 첨가제로 사용했을 경우 0.1% triethylamine 을 염기 첨가제로 사용했을 경우보다 머무름인자 값은 더 작게 나타났지만 광학분리의 선택성과 분리인자는 크게 증가됨을 보여주었다. 또한 Chiralcel OD 컬럼에서 이동상에 0.05%
trifluoroacetic acid 와 0.05% triethylamine 을 함께 사용했을 때 광학분리의 선택성과 분리인자가 어느 이동상 조건보다도 가장 좋은 광학분할 결과를 보여주었다.
27
2.2 ABSTRACT
Liquid chromatographic enantiomer separation of amino alcohols was performed on several chiral columns based on polysaccharide derivatives under the mobile phase conditions containing acid or base additive. The chromatographic parameters were greatly influenced by the nature of the mobile phase containing acid or base additive as well as the used chiral columns. Compared to chromatographic results obtained in the mobile phase containing base additive (0.1% triethylamine), especially, Chiralcel OD showed dramatically enhanced separation factors and resolution factors with reduced capacity factors under the mobile phase condition containing acidic additive (0.1% trifluoroacetic acid). When the mobile phase containing 0.05%
trifluoroacetic acid and 0.05% triethylamine was used on Chiralcel OD, the greatest separation factors and resolution factors among all other mobile phase conditions in this study were observed.
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2.3 서론
고성능 액체 크로마토그래피에서 셀루로오스와 아밀로오스의 다당류 유도체를 키랄 선택자로 사용하여 만들어진 키랄 컬럼을 이용하여 많은 거울상 이성질체 화합물을 성공적으로 분리해 왔다.1,2 특히 키랄 아민을 HPLC 컬럼을 이용하여 광학분리하고 자 할 때 소량의 아민을 염기 첨가제로 이동상에 사용하여 효과적으로 수행하여 왔다.3 키랄 아민 화합물을 광학분리 하는데 있어서 소량의 아민을 이동상에 첨가하는 이유는 분석물질인 아민과 실리카와의 non-specific interaction 을 최소화하여 분석물질의 머무름 시간을 줄여주거나 또는 피크가 꼬리 끌기를 보이면서 용리 되는 것을 막아주는 효과를 가지고 있기 때문이다.4 그러나 키랄 아민을 광학분리 할 때 소량의 아민을 염기 첨가제로 이동상에 가하여 분석하는 일반적인 광학분리의 분석법대신에 산을 첨가제로 사용한 광학분리 결과가 최근까지 아주 소수의 연구그룹에 의해 보고되었다.4-7 최초의 연구로 Tang 그룹에서 Chiralcel OJ 에서 여러 키랄 acid 들을 광학분할 하는 중에 betaxolol 아민시료에 대해서 trifluoroacetic acid (TFA)를 산 첨가물로 사용한 광학분리를 아주 예외적인 경우로 특별한 설명 없이 단순히 분리결과만 보고한 적이 있다(α=1.25, 1.42, Rs=1.05, 2.23).5 또한 Chiralcel OJ 와 Chiralcel OD 에서 nicotine 과 nornicotine 두 물질의 광학분리가 TFA 를 산 첨가물로 하는 이동상 조건에서 수행된 보고가 있고 Chiralpak AD-H 에서 여러 종류의 키랄 아민을 광학분리하기 위하여 methanesulfonic acid 또는 ethanesulfonic acid 를 산 첨가물로 이동상에 사용한 연구결과를 보고되었다.4,6 최근에 Chiralcel OD-H 와 Chiralpak AD 에서 N-benzyl-α-methyl-
29
benzylamine, phenylalaninol 같은 5 개의 키랄 아민화합물을 대상으로 TFA 를 산 첨가물로 사용한 광학분리 연구가 발표되었다.7 그러나 앞선 연구에서 키랄 아민화합물을 광학분리 할 때 염기를 첨가제로 사용하는 전통적 분석법대신 새로운 방법으로 산을 첨가하여 얻은 분석결과만을 단순보고 하는 경우가 대부분이어서 산 또는 염기 등의 첨가제를 각각 함유한 이동상에서의 광학분리를 비교하는 체계적인 연구가 진행되지 아니하였다. 그러므로 본 연구에서는 다당유도체를 모체로 하는 대표적인 키랄 컬럼인 Chiralpak AD, Chiralcel OD, Chiralpak AS, Chiralcel OF 을 사용하여 산 또는 염기 등의 첨가제를 각각 함유한 이동상에서 amino alcohol 을 광학분리 하는 크로마토그래피 연구결과를 비교하여 보고하고자 한다. 분석물질로 사용하는 amino alcohol 은 염기성 물질이기 때문에 이들을 대상으로 하는 광학분리의 전통적인 분석방법으로 (propanol)-hexane 용매에 0.1% diethylamine 염기를 첨가제로 사용하여 이를 표준이동상처럼 사용하여 왔다.3 본 연구에서는 산 또는 염기 등의 첨가제 사용이 광학분리에 미치는 영향을 살펴보고자 했기 때문에 ethanol-hexane 의 기준 이동상 용매에 0.1% TFA, 0.1% triethylamine, 혹은 0.05% TFA/0.05% triethylamine 을 산 또는 염기 첨가제로 사용하였고 그 광학분리 결과를 비교하였다. (기준 이동상 용매로 2-propanol-hexane 용매를 사용할 경우 매우 완만한 꼬리 끌기 피크를 보여주기 때문에 효과적인 비교를 위해 ethanol-hexane 용매를 사용하였다. 단 Chiralcel OF 컬럼에서는 ethanol 을 이동상 용매로 사용하는 것이 허용되지 않기 때문에 컬럼의 안정성을 위해 2-propanol-hexane 을 기준 이동상 용매로 사용하였다).
30
2.4 실 험
2.4.1 실험 기기 및 시약
액체크로마토그래피 실험은 다음의 기기들로 구성된 HPLC 를 사용하여 상온에서 수행하였다. HPLC 구성 기기로 Waters model 1525 binary pump, 20 μL loop 를 가진 Rheodyne model 7125 주입기, dual absorbance detector (Waters 2487 detector)를 사용하였다. HPLC 용 column 으로 Chiralcel OD, Chiralpak AD, Chiralpak AS, Chiralcel OF (250 mm L×4.6 mm I.D. 일본 Daicel Chemical 회사)을 사용하였다. HPLC 용매로 사용하는 hexane, ethanol (EtOH), (2-propanol)은 J. T Baker (Phillipsburg, NJ)로부터 trifluoroacetic acid (TFA), triethylamine 및 amino alcohol 분석물질은 모두 Aldrich (Milwaukee, WI) 혹은 Sigma (St. Louis, Missouri) 회사로부터 구입하였다.
31
2.5 결과 및 고찰
Table 5~8 는 다당유도체를 키랄 선택자로 이용하는 키랄 Chiralcel OD, Chiralpak AD, Chiralpak AS, Chiralcel OF 에서 여러 amino alcohol 의 광학분리를 위해 이동상에 산 또는 염기 등을 각각 첨가하여 얻은 연구결과를 보여주고 있다. Table 5~8 에서 보여주는 것처럼 광학분리의 선택성과 머무름 시간은 산 또는 염기 등의 첨가제가 포함된 이동상의 성질에 크게 영향을 받는 것으로 나타나는데 이러한 실험결과는 사용하는 키랄 컬럼의 종류에 따라 매우 다르게 나타난다. Table 5 은 Chiralcel OD 에서의 광학분리 결과를 보여주는데 분리되지 않은 두 물질을(acebutolol) 제외하고는 0.1% TFA 를 산 첨가제로 얻은 광학분리 결과가(α=2.83~13.90, Rs=5.07~8.84) 0.1% triethylamine 을 염기 첨가제로 얻은 광학분리 결과보다(α=1.24-3.02, Rs=0.64-4.77) 현저하게 높게 나타난다. 주목할 부분은 Table 5 의 Chiralcel OD 의 경우, 다른 키랄 컬럼과 달리 산 첨가제를 사용시 염기 첨가제를 사용하는 것보다 선택성과 분리인자는 매우 커졌지만 머무름 인자가 현저하게 작아지게 된다. 예를 들어, metoprolol 은 염기 첨가제를 사용했을 때의 선택성(α)과 분리인자(Rs)는 각각 1.64 와 1.80 이나 산 첨가제를 사용하면 머무름 인자가 매우 작아지면서 각각 7.33 과 6.40 으로 매우 크게 증가한다. Pindolol 도 염기 첨가제를 사용했을 때 선택성(α)과 분리인자(Rs)는 각각 3.02 와 4.77 이나 산 첨가제를 사용하면 각각 13.90 과 8.84 로 크게 증가되었음을 알 수 있다.
이와 반면에 Table 6 의 Chiralpak AD 경우에는 산 첨가제를 사용할 때 염기 첨가제를 사용하는 것에 비해 모두 머무름 인자 값이 작아졌지만 선택성과
32
분리인자도 대체적으로 함께 작아지는 경향을 보여주고 있다. Table 7 의 Chiralpak AS 경우에는 산 첨가제를 사용할 경우가 염기 첨가제를 사용할 때 보다 머무름 인자 값이 더 크게 증가하는 경향을 보였으며 또한 산 첨가제를 사용할 경우에만 metoprolol 이 부분 광학분리를 보였고 나머지는 광학분리 되지 않았다. Table8 의 Chiralcel OF 경우에는 Table 7 의 Chiralpak AS 경우와 같이 산 첨가제 사용시 염기 첨가제 사용에 비해 머무름 인자 값이 증가하여 대체적으로 2 배 이상 커지는 경향을 보였다. 그러나 선택성과 분리인자의 측면에서는 산 첨가제를 사용할 때는 atenolol 이, 염기 첨가제를 사용할 때는 pindolol 과 propranolol 이 더 좋은 광학분리를 보여 일정한 경향을 보이지 않았다.
전체적인 Table 5~8 결과를 살펴보았을 때, alcoholhexane 의 기준 이동상에 산 첨가제로 0.1% TFA 를 사용했을 때와 염기 첨가제로 0.1% triethylamine 을 사용했을 때 의 머무름 인자를 비교할 경우, Chiralcel OD 와 Chiralpak AD 에서 는 산 첨가제를 사용한 경우가 염기 첨가제를 사용한 경우보다 더 짧아졌음이 관찰되고 Chiralpak AS 와 Chiralcel OF 에서는 더 길어졌음이 관찰된다. 더욱 흥미로운 것은 Chiralcel OD 와 Chiralpak AD 경우 특이하게 서로 상반적으로 다른 광학분리 경향을 보여주고 있다. Chiralcel OD 경우에는 산 첨가제를 사용했을 때의 머무름 인자 값이 염기 첨가제 경우보다 더 작게 나타났지만 선택성과 분리인자는 현저하게 증가한 결과를 보여준다. 그러나 Chiralpak AD 경우에는 산 첨가제를 사용했을 때, Chiralcel OD 경우와 같이 염기 첨가제보다 머무름 인자는 더 작게 나타나지만 선택성과 분리인자는 Chiralcel OD 경우와 반대로 더 작게 나타나는 경향을 보여주고 있다. 또한 동일한 컬럼에서 라도
33
염기 또는 산 첨가제를 사용할 때 광학분리에 큰 차이를 보이는 이유는 각각의 이동상 조건에서 작용되는 chiral recognition mechanism
이 서로 다르기 때문이라 보아진다.
34
이동상에 TFA 의 산 첨가제를 사용하게 될 때 amino alcohol 분석물질 (I)은 ammonium salt (II)를 형성한 후 광학분리가 진행될 것이라 예상되는데 Chiralcel OD 의 키랄 선택자인 cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) 와 ammonium salt (II) 분석물질 사이의 수소결합으로 인한 상호작용이 chiral recognition 에 직접적으로 관련된 것으로 보아 지나 염기 첨가제를 사용할 때에는 (I)구조를 가진 분석물질의 광학분리가 진행되므로 그러한 수소결합으로 인한 상호작용이 없으리라 예상한다. Chiralcel OD 에서 이동상에 산 첨가제를 사용하게 될 때 키랄 선택자와 ammonium salt (II)와의 수소결합으로 인한 상호작용이 chiral recognition 에 매우 효과적으로 작용하여 염기 첨가제를 사용할 때보다 광학분할이 더 크게 나타나는 것으로 보아진다. 이에 반해 Chiralpak AD 의 키랄 선택자인 amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate) 은 이동상에 산 첨가제를 사용하게 될 때, 분석물질의 ammonium salt (II)와의 상호작용이 오히려 chiral recognition 을 방해하므로 염기 첨가제를 사용할 때보다 광학분리가 잘되지 않은 것으로 보아진다. 또한 Table 5, 6 에서 보여주는 것과 같이, 이동상에 0.05% TFA (6.7 mM)와 0.05% triethylamine (3.6 mM)를 동시에 사용할 경우 화학량론 적인(stoichiometric) 관점에서 acidic 한 조건을 유지하므로 그 경우 광학분리의 선택성과 머무름 인자, 분자인 자를 산 또는 염기첨가제만을 넣었을 때 결과와 각각 비교해 보면 그 경향이 뚜렷해진다. Table 5 에서 나타난 바와 같이 산이 첨가된 이동상 조건하에서 키랄 선택자와 ammonium salt (II)와의 수소결합으로 인한 상호작용 chiral recognition 이 더 효과적으로 작용하는 Chiralcel OD 의 경우, 이동상에 첨가제로 0.05% TFA 와 0.05% triethylamine 을 함께 사용할 때가 0.1%
35
TFA 를 사용할 때보다 머무름 인자는 약간 더 큰 값을 나타내지만 (세가지 이동상 조건 중에서 염기 첨가제를 사용한 용액의 머무름 인자 값이 가장 크게 나타나는데 전자가 후자에 비해 상대적으로 염기성 성질을 띄는 조건이므로) sharp 피크를 보여주면서 선택성과 분리인자로 표현되는 광학분할 결과는 가장 좋게 나타난다. 이에 반해 Chiralpak AD 에서는 Table 6 에서와 같이 산이 첨가된 이동상 조건하에서 ammonium salt (II)와의 수소결합으로 인한 상호작용 이 chiral recognition 에 부정적으로 작용하고 그 대신 amino alcohol (I) 구조와의 광학분할이 상대적으로 더 효과적으로 나타나기 때문에, 이동상에 0.05% TFA 와 0.05% triethylamine 를 함께 사용했을 때의 광학분할 결과는 0.1% TFA 를 사용할 때에 비해 머무름 인자, 선택성은 거의 비슷하나 분리인자는 일반적으로 약간 커지는 경향을 보인다. Table 7 의 Chiralpak AS 경우, 이동상에 0.05% TFA 와 0.05% triethylamine 를 함께 사용했을 때의 광학분할 결과가 각각 산 또는 염기 첨가제 사용할 때의 경우보다 미미하나마 조금 더 좋게 나타났고 Table 8 의 Chiralcel OF 경우에는 어떤 일정한 경향이 있다고 하기는 어려웠다.
36
Table 5. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile phase with acid or base additive on Chiralcel OD.
EtOH/hexane/TFA=
30/70/0.1(V/V/V)
EtOH/hexane/Et3N=
30/70/0.1(V/V/V)
EtOH/hexane/TFA/Et3N=
30/70/0.05/0.05(V/V/V/V) Analyte
αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d Acebutolol 1.00 1.52 - 1.00 3.80 - 1.16 0.56 0.39
Atenolol 2.83 1.30 5.07 S 1.24 2.88 0.64 S 3.27 1.34 6.50 S Metoprolol 7.33 0.30 6.40 1.64 1.13 1.80 7.54 0.37 10.36
Pindolol 13.90 0.88 8.84 3.02 2.44 4.77 17.80 1.22 14.91
Propranolol 4.23 0.56 7.27 S 1.28 1.41 0.94 S 4.66 0.62 8.44 S
Flow rate=1mL/min; Detection UV 254 nm a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer.
c Resolution factor. dThe absolute configuration of the second retained enantiomer.
37
Table 6. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile phase with acid or base additive on Chiralpak AD.
EtOH/hexane/TFA=
10/90/0.1(V/V/V)
EtOH/hexane/Et3N=
10/90/0.1(V/V/V)
EtOH/hexane/TFA/Et3N=
10/90/0.05/0.05(V/V/V/V) Analyte
αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d Acebutolol 1.29 3.61 1.84 1.31 6.02 2.32 1.28 3.62 1.80
Atenolol 1.00 10.18 - 1.05 13.01 0.23 S 1.00 10.86 - Metoprolol 1.00 1.92 - 1.44 2.00 3.43 1.00 2.21 - Pindolol 1.22 3.84 1.61 1.37 4.19 2.44 1.25 3.89 1.90
Propranolol 1.10 1.05 0.64 S 1.53 1.23 3.46 S 1.11 1.15 0.73 S
Flow rate=1mL/min; Detection UV 254 nm a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer.
c Resolution factor. dThe absolute configuration of the second retained enantiomer.
38
Table 7. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile phase with acid or base additive on Chiralpak AS.
EtOH/hexane/TFA=
20/80/0.1(V/V/V)
EtOH/hexane/Et3N=
20/80/0.1(V/V/V)
EtOH/hexane/TFA/Et3N=
20/80/0.05/0.05(V/V/V/V) Analyte
αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d
Acebutolol 1.00 1.89 - 1.00 0.75 - 1.00 0.51 -
Atenolol 1.00 10.60 - 1.00 8.70 - 1.00 7.24 -
Metoprolol 1.36 0.74 0.70 1.00 0.35 - 1.45 0.38 0.78
Pindolol 1.00 2.45 - 1.00 0.77 - 1.10 0.73 0.06
Propranolol 1.00 0.83 - 1.00 0.32 - 1.00 0.37 -
Flow rate=1mL/min; Detection UV 254 nm a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer.
c Resolution factor. dThe absolute configuration of the second retained enantiomer.
39
Table 8. Enantiomer separation of amino alcohols using the mobile phase with acid or base additive on Chiralcel OF.
2-propanol/hexane/TFA=
30/70/0.1(V/V/V)
2-propanol/hexane/Et3N=
30/70/0.1(V/V/V)
2-Propanol/hexane/TFA/Et3N=
30/70/0.05/0.05(V/V/V/V) Analyte
αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d αa k1b Rsc Conf.d
Acebutolol 1.00 33.21 - 1.00 6.76 - 1.00 22.49 -
Atenolol 1.27 22.00 0.45 S 1.00 11.34 - nee
Metoprolol 1.00 8.67 1.00 2.40 - 1.00 7.46 -
Pindolol 1.28 9.79 0.69 1.55 1.97 1.43 1.33 7.27 0.86
Propranolol 1.00 4.36 - 1.26 0.70 0.50 S 1.00 3.56 -
Flow rate=1mL/min; Detection UV 254 nm a Selectivity factor. b Capacity factor of the first eluted enantiomer.
c Resolution factor. dThe absolute configuration of the second retained enantiomer.eno elution within 120 min.
40
Fig. 7 은 Chiralcel OD 에서 propranolol 의 광학분리 할때 산 또는 염기 또는 산/염기 첨가제를 사용한 이동상에서의 대표적인 크로마토그램을 비교하여 보여 주고 있다. 앞에서 언급한 바와 같이 이동상에 산 또는 염기 또는 산/염기가 함께 첨가된 이동상 조건에서 chiral recognition mechanism 에 상당한 영향을 주어 광학분할결과에 큰 차이를 준다 할지라도 각각의 조건에서 모두 광학분리 된 물질의 경우 용출된 용리 순서(elution order)는 모두 일관되게 동일하게 나타났다. 대표적인 예로, Chiralcel OD 에서 atenolol 과 propranolol 분석물질의 경우, 산 또는 염기 또는 산/염기가 첨가된 이동상의 조건과 관계없 이 S-이성질체가 나중에 용출되어 나온다(Table 5). 이러한 결과는 산 또는 염기 또는 산/염기가 첨가된 이동상 조건이 chiral recognition mechanism 에 상당한 영향을 주기는 하지만 본질적 변화를 주는 것은 아니기 때문이라 보아진다.
41
Fig. 7. Typical chromatograms of enantiomer separation of propranolol on Chiralcel OD using EtOH/hexane/TFA=30/70/0.1(V/V/V) (the top), EtOH/hexane/Et3N=30/70/0.1(V/V/V) (the middle) And EtOH/hexane/TFA/Et3N=30/70/0.05/0.05(V/V/V/V) (the bottom) as the mobile phase (injection amount 10 μg).
See Table 5 for chromatographic conditions.
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2.6. 결론
고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 amino alcohol 광학분리를 시도하였는 데 다당류 유도체를 키랄 선택자로 이용한 여러 키랄 컬럼을(Chiralcel OD, Chiralpak AD, Chiralpak AS, Chiralcel OF) 사용하였고 trifluoroacetic acid 과/또는 triethylamine 첨가제 등을 이동상에 사용하여 얻은 광학분리 결과를 비교하였다. 키랄 선택자로 cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarba ma te)로 부터 유도된 Chiralcel OD 의 경우, 염기 첨가제를 사용할 때 보다 산 첨가제를 사용할 때 머무름 인자는 짧아지면서 더 좋은 광학분리를 보이나 amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)로 부터 유도된 Chiralpak AD 의 경우, 머무름 인자는 마찬가지로 짧아지지만 더 낮은 광학분리를 보여주었다.
이와 반대로 Chiralpak AS, Chiralcel OF 의 경우 머무름 인자는 염기 첨가제를 사용할 때 보다 산 첨가제를 사용할 때 훨씬 증가되는 것이 관찰되었다. 특히 Chiralcel OD 컬럼에서 이동상에 0.05% trifluoroacetic acid 와 0.05%
triethylamine 을 함께 사용할 경우 어느 이동상 조건보다도 가장 좋은 광학분할 결과를 보여주었다. 다당류 유도체를 모체로 하는 키랄 컬럼에서 amino alcohol 을 광학분리 하는데 이동상에 포함된 산, 염기 등의 첨가제에 따라 광학분리에 관련된 chiral recognition mechanism 이 어떻게 달라지는지에 대한 심층적인 연구가 앞으로 계속 진행될 필요가 있으리라 보아진다.
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2.7 참고문헌
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저작물 이용 허락서
학 과 약학과 학 번 20087750 과 정 석사
성 명 한글 황 호 한문 黄 虎 영문 huanghu 주 소 광주광역시 동구 서석동 375 번지 조선대학교 약학대학 공용기기실 연락처 E-mail : [email protected]
한글:고성능 액체 크로마토그래피에서 다당유도체로부터 유도된 키랄 컬럼을 이용한 광학분할
논문제목
영문:Enantiomer separation using chiral columns derived from polysaccharides by HPLC
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동의여부 : 동의( O ) 반대( ) 2010 년 2 월
저작자: (인)
