STEAM R&E 연구결과보고서
(물 부족 국가를 위한 양칫물이 필요 없는 플루오린이 제거된 검 제형 치약 연구)
2016. 11. 30.
성보고등학교
37
15 경험자
미경험자
<그림 1> 실태 조사 자료
< 연구 결과보고서 >
1. 개요
□ 연구목적
◇ 연구 동기
○ 충치 경험 실태 조사
성보고등학교의 학생들뿐 아니라 일반인들도 상당한 수가 충치를 가지고 있거나 치료 한 경험이 있었다. 그 사실은 성보고 학생들을 대상으로 진행한 설문조사에서 알 수 있었다. 설문조사 내용에 의하면 전체 52명중 충치를 앓았거나 충치를 현재 앓고 있는 사람은 37명이었고, 주변 지인 중 충치를 앓고 있는 사람을 아는 사람은 37명으로 1인당 평균 9명을 알고 있었다.
○ 플루오린화 물질의 위험성 인식
충치를 예방하기 위하여 치약에 플루오린 성분을 넣는다고 한다. 이는 충치균의 증식을 억제하고 치아에 직접 작용하여 충치균이 만들어낸 산으로 미세하게 손상된 치질을 재석회화 시키는 역할을 하는데 그럼에도 불구하고 충치가 많은 사람들이 있고, 또한 일정량 이상의 불소는 인체에 해롭고 어린이가 튜브 하나 분량의 치약을 다 먹을 경우 사망할 수도 있다는 기사를 보게 되었다. 치약을 뱉어내지 못하는 유아의 치약에는 불소가 들어있지 않다고 한다. 그 말은 불소가 든 치약을 삼켜서는 안 된다는 것이다.
자세히 조사 해보니 불소는 신경 세포의 필수 기능에 이상을 일으켜 알츠하이머, 죽상 동맥 경화증 (atherosclerosis), 불임 기형아, 당뇨병, 암, 지능 저하 등을 일으킬 수 있다는 것이 연구를 통해 입증 되었다고 한다. 아무리 치약에 플루오르화물로 들어 있어서 사용 시 인체에 거의 무해하더라도 치약에 들어가는 플루오르화소듐, 플루오르화주석 등 은 이온결합 물질로 체내에서 양이온과 음이온으로 분리가 될 것이고, 결국에는
<그림 2> 성보고등학교 주변의 치과 (A~H)
체내에 해로운 영향을 미칠 것이다. 그렇다면 인체에 해롭지 않으면서도 플루오린과 마찬가지로 충치를 예방할 수 있는 다른 물질은 없는 것일까 하는 생각을 하게 되어서 플루오린을 대체할 수 있는 천연 추출물로 치약을 만들자는 계획을 생각하게 되었다.
성보고등학교에서는 중식, 석식 후 양치를 많은 수의 학생들이 하는 편이다. 이 학생들 이 사용하는 치약에도 플루오르화물이 들어가 있었고, 우리의 연구 내용이 이들에게도 영향을 미칠 수 있음을 알게 되었다.
○ 연구하기 적절한 성보고등학교의 위치
또한 성보고등학교 주변에는 7곳의 치과가 있다. 따라서 우리 팀원들이 연구를 하는 도중에 모르는 것이 생기거나 물품이 필요할 때 자문 역할을 해줄 수 있는 환경이 충분히 형성되었다고 보았다.1)
○ 제 3세계 물 부족 국가에 대한 인식
아프리카에 속하는 국가뿐만 아니라 세계 각지에서 새로운 물 부족 국가들이 생겨나면서 물 부족 국가에 대한 우려가 한층 더 심해지고 있다. 그런 제 3세계 물 부족 국가에서는 양치질을 하는 과정 중 입을 헹굴 때 사용되는 양치 물 조차 귀중한 자원으로 여겨질 것이다. 따라서 양칫물을 사용하지 않는 치약 개발에 대해 탐구하고 싶은 마음이 생겼다.
◇ 연구 목적
○ 플루오린을 대체 할 수 있는 물질이 충치를 예방하는데 플루오린과 비슷한 효과를 내면서도, 플루오린과는 반대로 몸에 쌓이지 않거나 쌓여도 해롭지 않은 물질을 찾아낸 다면 인체에 안전한 치약을 생산해 낼 수 있을 것이다. 현재 우리와 유사한 생각을 한사람들로 인하여 시중에 출품된 물질들, 화살나무 추출액, 감태나무 추출액 등에서의
1)네이버 지도 -
http://map.naver.com/?query=%EC%B9%98%EA%B3%BC+%EC%9C%84%EC%B9%98&type=SITE_1&siteOrder=
공통된 성분을 찾아내고 그 공통된 성분을 포함한 천연 추출물을 이용하여 양칫물이 필요 없는 검 형태의 치약을 만든다. 즉, 치약성분 중 플루오린 화합물을 대체하여 새롭게 발견한 천연 추출물을 넣어 새로운 검 형태의 치약을 만드는 것이 우리 팀의 주요 목적이다.
□ 연구범위
○ 살균정도를 파악하기 위한 효율적인 뮤탄스 균 배양에 대해 연구하고 뮤탄스 균의 배양정도를 파악하기 위한 방법에 관한 연구
1. 배지에 관한 기본원리를 이해하고, 배지의 종류에 따른 장단점을 이해함 2. 배지 종류 중 액체배지를 선택하고 뮤탄스 균의 물질대사 특성인 생성을 이용해
뮤탄스 균 존재 정도를 파악함
○ 치약을 대신하기 위한 물질의 선택에 관한 연구
1. 뮤탄스 균을 제거하기 위한 방법에 관한 연구를 진행함
2. 뮤탄스 균 직접 죽이는 방법을 선택하고 살균 물질을 어디서 추출할지 조사함.
3. 물부족 국가를 위하여 물이 필요없는 검으로 치약을 만들기로 결정하고 검 제조법에 대하여 연구함
○ 뮤탄스 균 살균을 위한 추출물 추출에 관한 연구
1. 추출물을 추출하기 위해 적합한 용매가 무엇일지에 대한 연구를 진행함
2. 용매로써 에탄올을 선정하고 에탄올 추출물을 만들어 살균정도를 파악하는 실험을 진행함
3. 인체에 무해한 추출물을 만들기 위해 용매로 발효주정을 사용하기로 결정하고 특허
‘감초로부터 항충치 물질을 추출하는 법’(등록특서 10-0937511, 김형준)을 참조하 여 발효주정 추출물을 만들고 살균정도를 파악하는 실험을 진행함
2. 연구 수행 내용
□ 이론적 배경 및 선행 연구
○ 사회적 측면 – 물 부족 제 3세계 국가 증가
- 제 3세계에서는 물이 다른 나라에 비해 지리적으로 적게 분포하고 효과적으로 관리 및 공급할 수 있는 시스템이 미흡하여 물 부족으로 이어지게 되고 자연스럽게 사람들은 근처 흙탕물을 정수하여 이용하는 데 오염된 물질이 포함되어 있어 건강에 해로 울
<그림 3> 아프리카의 물 공급과 위생
2000년에 62%의 아프리카 사람들은 개선된 물 공급 혜택을 받을 수 없었고, 60%가 위생시설을 갖추지 못했다. 그러나 대륙의 대부분 지역에서 상황은 좋지 않다.
<그림 4> 아시아․태평양 지역의 개선된 물 공급과 위생시설
2000년에 아시아의 81%가 개선된 물 공급 혜택을 받았으나 세계에서 가장 낮은 비율인
48%만이 위생시설을 갖추고 있다.
<그림 5> 2000년의 물 이용가능량 (1인당 1,000m3/년)
수 있으며 물 부족으로 인해 깨끗한 물은 귀한 가치를 가지게 된다. 글로벌 사회적 기업인 베스터가드 프랑센 그룹이 개발한 라이프스트로가 공급되어 오염된 물을 먹을 수밖에 없는 사람들이 휴대하면서 미생물과 기생충을 거른 물을 먹을 수 있도록 하였다.
- 아프리카나 아시아, 남아메리카 일부국가는 물 공급과 위생설비가 미비하여 회충증, 콜레라, 설사 등 수인성 질병들이 성행하다. 또한 아태 지역에서는 생활하수와 산업 폐수, 화학물질과 고형폐기물 등으로 심하게 오염되어 있으며 대장균 철, 암모니아 등으 로 오염되어 있다. 남미에서, 특히 카리브해 소제도에서는 강우가 담수의 유일한 공급원 이다. 이외에도 많은 국가들은 강우 이외 지하수를 이용하는데 얻은 담수는 대부분 관개 농업에 사용되어 1인당 물 이용량이 적은 표지를 갖는다.2)
<그림 6 > 스테판 곡선
○ 치아 우식증
- 스테판 곡선에 따르면 pH 5.0 이하로 떨어지면 치아의 표면층이 산화되어 이가 썩게 된다. 충치는 치아 우식증의 또 다른 말로 입안에 서식하는 스트렙토코커스 뮤탄스균이 입안에 남아있는 이물질을 분해해 글루칸을 형성하여 프라그를 만들어 그 안에서 서식하 게 된다. 혐기성 세균인 뮤탄스균은 공기와 차단된 프라그 내에서 당을 발효시켜 산성 물질을 생성한다. 만들어진 산성 물질에 의해 치아의 겉표면을 이루는 에나멜질이 녹아 이가 썩게 된다.
치아 에나멜 성분은 수산화인산석회( 라는 무기물로 뮤탄스 균에 의해 당을 발효시키면서 락트산을 내놓게 되어 치아 에나멜은 수산화 이온을 잃어 물에 녹는 상태로 변한다.
→
<수식 1> 치아 부식 과정
양치 시 플루오린 이온의 성분이 수산화이온의 작용기와 치환되면 hydroxfluorapatite [ ]나 fluorapatite[ ]이 생성되어 산에 잘 녹지 않게 된다.3)
프라그와 치석은 겉모양은 비슷하지만 다른 것이다. 프라그는 세균 덩어리로 치아
2) ‘세계 물의 해’ 자료집, 환경부, 2003
3)http://kin.naver.com/qna/detail.nhn?d1id=11&dirId=1115&docId=170389016&qb=666k7YOE7Iqk6regIOuwmO ydkeyLnQ==&enc=utf8§ion=kin&rank=1&search_sort=0&spq=0&pid=TufzYloRR10ssvF96MhssssssuZ-15 3698&sid=PaZgQ%2BT2oUzy%2BuW0uu9omQ%3D%3D
를 손톱으로 문지르면 노랗게 묻어나오는 것으로 음식물 찌꺼기와 화학작용을 일으 켜 입 냄새를 유발하는 것이다. 치석은 프라그가 오래도록 쌓여 돌처럼 굳어진 것으 로 치석 자체로 입 냄새를 유발하는 것이다. 치석과 프라그는 입 냄새 유발 궁극적 원천이 다르며 치석이 프라그보다 더 큰 것이라고 말할 수 있다.
입 냄새를 제거하기 위해서
① 물을 자주 마셔 촉촉한 환경으로 만들어 균의 증식을 방지한다.
② 프라그나 치석을 제거해주는 섬유질이 있는 과일을 먹으면 침의 분비를 활성화시 켜준다.
③ 커피와 담배, 인스턴트 음식, 패스트푸드 섭취를 자제한다.
④ 꾸준한 양치가 필요하며 혀에서 생기는 백태를 제거해준다.4)
- 스트렙토코커스 뮤탄스균은 당분을 주식으로 하고 산을 만든 뒤 치아의 표면을 분 해시켜서 손상을 입힌다. 이러한 뮤탄스균은 혐기성 세균이기 때문에 프라그를 형성 한 뒤 산소가 차단되면 프라그 안쪽과 치아 사이에서 번식하여 치아를 손상시킨다.
이 때 치아의 겉을 둘러싸고 있는 법랑질, 즉 에나멜을 공격하면서 녹이게 되고 심 해지면 상아질까지 녹게 하여 심각한 치통이나 치아 우식증을 유발한다.
○ 플루오린이 없는 검 형태의 천연 치약 제조
- 플루오린은 17족 원소로 최외각 전자가 7개로 음이온이 되려는 성질이 강하기 때문에 인체에 유입된 플루오린이라면 인체를 이루는 원소의 전자를 뺏어 안정한 배치를 이루려 고 한다. 또한 이것은 발암물질로 확인되어 인체에 유해한 물질이고 독성이 강해 기체흡입 이나 접촉에 유의해야하는 하나의 원소이다. 식물이나 농작물 등의 잎에서 흡수 축적되며 다량 섭취 시 골연화증이 발생할 수 있는 위험성을 갖고 있다.
- 츄잉 검의 검베이스 원료는 치클 등의 천연 수지로 타액과의 친화성이 있고, 적당한 점탄성을 띠우며 점성을 주기 위하여 검 베이스에 글리세린 1.62g, 시트르산 1g을 넣어 가열하여 섞어준다.
- 검 베이스의 식품 첨가물에는 향, 맛, 감미료, 유화제, 보존제가 포함되어있다.
감미료 : 자일리톨, 아스파르탐과 같은 감미료는 설탕과 같은 탄수화물이지만 산 으 로 발효되지 않아 충치를 일으키지 않는다.
4) ‘입냄새가 심해요~ 입냄새 없애는 법 6가지’, http://rakeduck.tistory.com/443
향료 : 대부분 카르본 형태의 스피어민트와 멘톨이 주성분인 페퍼민트를사용하며 씹는 20분 동안 향기가 유지되게 만든다.
보존제 : BHT가 사용되는데 고분자 사슬의 이중결합은 산소의 화학적인 공격을 받기 쉬워 교차결합이 생기고 단단해져 강력한 항산화제로 검이 산소로부터 공격 받는 것을 막는다.
맛 : 구강 산을 중화시키기 위해 넣은 탄산수소나트륨의 맛을 감추기 위해 다양한 향과 맛을 첨가하여 제조한다.
유화제 : 대부분 레시틴과 글리세릴-일스테아르산이 사용되며 부드럽게 하고 여러 성분을 섞어 균일한 혼합물을 만들 수 있게 한다. 레시틴은 친수성 부분에 친유성기가 붙어 있는 평면상에서 직사각형 분자 구조를 가지고 있어 물에 분산시키면 이분자 막을 형성한다. 왜냐하면 두 지방산 사슬이 너무 커서 미셀의 내부에 끼어 들어갈 수 없기 때문이다.
습윤제 : 검이 말라서 단단해지는 것을 예방하는 것으로 대표적으로 글리세롤이 있다. 분자 가 지닌 3개의 OH기 때문에 글리세롤은 물에 잘 녹고 물을 잘 흡수한다.
- 탄산수소나트륨은 나트륨이 풍부하게 들어있어 가벼운 보습 효과를 주며 살충제, pH 조정제로서 사용된다. 산성 물질을 중화할 경우 이산화탄소를 발생시키고 거품을 발생시 킨다.
→
<수식 2> 탄산수소나트륨의 작용
이산화탄소는 매우 약한 산으로 거의 모든 산에 의해 가스를 발생시켜 분해시킨다.
- 자일리톨 검은 시중에서 많이 판매되는 검의 형태로 이며 구조는 5탄당 당알코올 이다. 비발효성이어서 젖산으로 분해되기가 어렵다는 점이 장점이다. 또한 단맛이 나지만 설탕의 75%에 불과한 저칼로리 감미료이기도 하다. 먼저 단맛이 나는 자일리톨을 뮤탄스 연쇄구균이 먹이로 착각하고 흡수한다. 하지만 자일리톨은 구조상 젖산으로 분해되기 어렵기 때문에 다시 토해낸다.
입 안에 다른 이물질이 없을 경우 이 과정을 반복하면서 뮤탄스 연쇄구균은 불필요하게 에너지를 소모하게 되고, 그 결과 약화되어 숫자가 줄어든다. 뿐만 아니라 자일리톨은 프라그를 만들지 않는 유익한 세균에는 적용되지 않기 때문에 상대적으로 유익한 세균이 많아지게 된다.
식사를 하게 되면 유해한 세균의 활동에 의해 pH가 내려가서 구강 내부가 산성화되어
치아 표면에서 인산과 칼슘이 녹게 된다. 하지만 30분 정도 뒤에는 타액 때문에 탈회가 억제되고, 양치 후 플루오린에 의해 pH가 원래대로 돌아온 뒤 치아 표면에서 ‘재석회 화’가 일어난다. 이 때, 자일리톨 검은 인산과 칼슘을 운반하는 역할을 하여 재석회화를 촉진시키고, 다시 칼슘과 인산이 쌓여 초기 충치를 치료한다.5)
- 하지만 자일리톨 검은 검베이스, 자일리톨, 과당 등의 원재료 가격이 상승하고 열에 쉽게 녹는 것을 막기 위해 코팅제를 얇으면서 강화하는데 이것은 제 3세계 사람들에게 부적합 한 공정 가격이다.
또한 자일리톨 검 1~2개 정도 씹어주면 입 냄새 제거 등 약간의 양치의 효과를 줄 수 있지만 잇몸과 치아에 낀 치태를 물리적인 행동을 통해서만 제거가 가능하므로 양치 없이 자일리톨 검을 씹어 대처하는 것은 좋지 않다.
- 칫솔을 이용하여 치석과 프라그를 제거하되, 앞니 쪽은 치실을, 어금니 쪽은 치간 칫솔을 사용해 닦아준다. 남은 찌꺼기는 물이나 식염수로 자주 입을 헹구어주어 플라그의 당분을
제거할 수 있다.6)
○ 살균 성분이 있어 여러 가지 약에 사용되는 물질을 선택한 네 가지 물질은 측백나무, 감태나무, 화살나무, 삼릉이다. 우리가 네 가지 물질을 선택한 이유는 다음과 같은 효능을 가지고 있기 때문이다.
- 측백나무는 측백나무 잎의 메탄올 추출물에서 추출 수율, 폴리페놀 화합물 및 플라보노이드 함량이 높으며 DPPH free radical scavenging 활성, Cu/Fe-환원력에 의한 항산화 활성 또한 좋은 것으로 보아 항산화는 물론 균을 제거할 수 있는 근본적 원인인 페놀의 함량이 많다고 알려져 있다.7)
- 감태나무는 항암작용, 중풍으로 인한 언어 장애, 가슴과 배가 차서 생긴 통증, 어혈, 관절염 등에 좋은 효과를 주며 우유보다 6배 많은 칼슘이 있어 치아 건강에 좋으며 염증, 진통을 완화시켜주는 데에 도움이 되는 물질이다.
- 화살나무는 뱃속의 기생충을 제거하는 구충제 역할을 하고, 어혈을 풀어주고, 염증이 악화되 는 것을 막아주며, 균을 제거하는 기능이 있어 염증치료에 좋은 효과가 있다. 살균뿐만 아니라 종양 세포의 증식을 억제하는 동시에 면역계를 활성화시켜 생리 활성에 도움을 준다.
5) 책 읽는 엄마들의 보물 창고, http://egloos.zum.com/jungsu19/v/1760431, 자일리톨 검은 왜 치아 건강에 좋을 까?
6) ‘풍치와 충치의 원인 ‘플라그’ 제거하려면‘, ‘탈모닷컴‘,
http://www.talmo.com/home/bbs/board.php?bo_table=inform_health&wr_id=26455
7) ‘측백나무 잎 · 열매 추출물의 이화학적 특성 및 항산화 효과’의 초록, 안희영 외 5인, 한국생명과학회, 2011
<그림 7> 페놀은 비공유 전자쌍이 있 고 극성이 있다.
<그림 8> 페놀의 공명 현상
- 흑삼릉은 덩이 줄기에는 0.05% 정유, 베타 시토스테롤, 소르보스, 페닐프로파노이드가 함유되어 있으며 기운순환을 촉진하고 어혈을 없애며 통증을 완화시킨다. 쓴맛은 간에 작용하여 어혈을 제거하고 종양이나 종기가 단단하게 부은 상태를 소실시킨다.
○ 충치 발생 원리를 참고하여 균 생장 억제에 대해 연구해본다.
- 페놀은 벤젠에 하이드록시기(-OH)가 치환된 것인데 이 하이드록시기가 2개 이상이 있으면 폴리페놀이 된다. 페놀은 독성이 있고 극성이므로 물에 녹고 약한 산성을 띠는데 페놀에서 떨어져 나와 물에 분해된 수소이온이 산성을 띠기 때문이다. 페놀은 공명하는 구조를 가져 페놀 음이온이 되기도 한다.
- 이에 비해 폴리페놀이 항산화작용을 하는 이유는 하이드록시기, 즉 수산기가 많기 때문에 결합에 참여하지 않은 전자들이 많다. (환원되기 쉽다.) 폴리페놀은 자신의 전자를 희생하여 활성 산소를 제거하기 때문이다.8)
이 페놀을 포함하고 있는지를 확인하기 위해 페놀정색반응을 실험하였다. 이 반응은 페놀을 포함하고 있는 물질이 과 반응하여 색을 띄는 것을 말한다.
페놀의 OH기에서 수소 이온이 조금 떨어져 나가기 때문에 약산에 해당된다. 그림 2와 같이 수소 이온이 떼어지면 페놀은 1가 음이온이 되어 다음과 같은 형태로 존재하게 되어 보라색 계열의 색을 띠게 된다.
8) ‘항산화 작용과 폴리페놀’, applepop블로그,
http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=applepop&logNo=220591831467
<그림 9> 철 3가 양이온과 결 합한 페놀
<그림 10> pH 도표
<그림 11> pH에 따라 달라지는 양배추 지시약의 색 깔 (좌에서 우로 갈수록 pH 증가)
○ pH와 양배추지시약을 이용한 액성 구분
- 수소이온의 값이 정해지면 수산화이온의 값은 자동적으로 정해 지며 액성의 판정이나 산성, 알칼리성의 강도는 수소이온의 값을 통해 알 수 있다. 즉 수소 이온 농도를 나타내기 위해 수소 이온 농도의 역수의 상용대수, 즉 수소 이온 지수를 표시하 여 pH의 기호를 사용한다.
log
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<수식 3>산도 산출 공식
산성은 대체로 신맛을 가지며 약산성물질은 소독과 살균에도 효과적이다. 하지만 산성이 높아지면 부식을 촉진시키고 토양 등 다양한 환경을 파괴시킬 수 있다. 알칼리, 즉 염기성 물질은 피부에 닿으면 미끈미끈한 성질이 나는 것들로 표백 및 살균 작용을 한다.9)
- 식물들은 다양한 색소를 포함하는데 식물의 색을 결정하는 색소는 안토시아닌이다. 안토시 아닌은 보라색을 띠고 있어 적양배추와 같은 보라색을 띠는 열매나 꽃은 안토시아닌이 많다. 하지만 안토시아닌이 보라색이라는 것은 절대적인 사실이 아니다.
안토시아닌은 산성에서 붉은색으로 염기성에서 푸른색이나 녹색으로 변해 식물이 가진 산도에 따라 색깔이 발현된다.
9) ‘pH상식 얼마나 알고 있나? 산성 VS 알칼리’, 전지원 블로그, http://blog.daum.net/6758878/112
산성 중성 염기성
<표 1> 안토시아닌 구조식과 pH에 따라 변화하는 안토시아닌 구조
1단계 crystal violet 염색
자주색의 염기성 색소인 crystal violet으로 염색을 하면 그람 양성균과 그람 음 성균 모두 자주색으로 염색된다.
- 적양배추가 지닌 안토시아닌은 ‘시아니딘’으로 화학식의 상단부를 보면 수소이온과 결합 여부에 따라 구조가 달라져 색깔이 변한다.10)
○그람 염색
- 세균을 crystal violet의 염료로 염색시킨 후 알코올이나 아세톤으로 탈색시켜 crystal violet의 색인 자주색이 탈색되면 Gram-negative(그람 음성), 자주색이 남아있으면 Gram-positive(그 람 양성)으로 정의한다. 그람 양성균의 경우 세포벽이 두꺼운 peptidoglycan layer와 풍부한 teichoic acid로 이루어져 있어 탈색제로 탈색을 해도 쉽게 탈색되지 않아 crystal violet이 계속 세균 세포 내에 남아 자주색으로 염색된 채로 남아 있는다. 하지만 그람 음성균은 peptidoglycan layer이 단일층으로 되어있고 세포벽이 phospholipid, lipopolysaccharate, lipoprotein 등으로 이루어져 있어 탈색제에 의해 crystal violet와 Iodine 복합체가 쉽게 탈색되 며 대조 염색약인 Safranin O로 염색, 붉은색을 나타낸다.
10) ‘적양배추가 산-염기 지시약이 되는 이유’, COOKpq 블로그,
http://cookpq.blogspot.kr/2016/02/red-cabbage-indicator.html, 2016.02.25.
2단계 착색 단계
1단계에서 염색된 세균에 아이오딘 용액을 처리하면 crystal violet과 아이오딘 이 반응하여 세포 내에 불용성의 복합체를 형성한다. 그람 양성균 및 음성균 모두 여전히 자주색으로 보인다.
3단계 탈색
착색된 세균에 탈색제인 알코올 시약을 처리하면 착색된 복합물이 용해된다.
그람 양성균은 복합물이 남아 자주색으로 보이고, 그람 음성균은 탈색되어 백 색으로 보인다.
4단계 대조염색
분홍색의 염기성 색소인 사프라닌으로 대비염색 시 백색으로 탈색되었던 그람 음성균은 분홍색으로 염색된다. 하지만 그람 양성균은 영향을 받지 않고 그대 로 자주색을 보인다.
<표 2> 염색 단계별 변화 과정
- 그람 음성균은 그람염색법으로 염색하였을 때 자주색은 탈색되고 Safranin으로 붉게 염색되 는 세균이다. 그 종류로는 살모네라균, 이질균, 티푸스균, 대장균, 콜레라균, 페스트균, 임균, 수막염균, 스피로헤타 등이 포함된다. 일반적으로 트리페닐메탄계나 아크리플라빈 색소에 대한 저항력이 강하고 계면활성제에도 내성이 강하다. 또 생존에 필요한 영양요구가 간단하 여 단순한 구성의 배양액에서도 잘 자라며, 독소는 균체내 독소로 가열에 의해서도 잘 파괴되지 않는다. 균체 항원의 주체가 되지만 면역성은 약하다.
- 그람 양성균은 그람 염색법에 의하여 자주색으로 변하는 세균이다. 즉, 포도상구균, 연쇄상 구균, 폐렴균, 나병균, 디프테리아균, 파상풍균, 탄저균, 방선균 등이 여기에 속한다.
색소나 약제에 대한 감수성이 높으며, 대사 작용에는 아미노산과 비타민을 필요로 한다.
균체외 독소를 방출하는데 이 독소의 독작용은 균종에는 강력하지만 가열하게 되면 쉽게 파괴된다.
이 독소는 생체내에서 항원성이 높고, 생성된 항체는 독소와 결합하여 그 독성을 중화시키는 특이성을 가지고 있다. 그 밖에 외독소에 포르말린을 작용시키게 되면 독성은 없어지고 항체만 남게 되므로 면역원으로 이용할 수 있다.11)
◇ 사후 활용 및 홍보
○ 뮤탄스균 생성 과정과 프라그 제거 과정, 치약 검 제조 방법을 시뮬레이션을 통해 보여줌 으로써 사람들이 자신의 치아와 충치에 대한 인식을 넓힐 수 있도록 교육용 자료로 충분히 사용할 수 있다.
○ 연구 과정 및 결과를 성보고등학교 학생들에게 소개함으로써 STEAM 융합 교육에 대해 소개하며 학생들의 STEAM 활동에 적극적으로 참여하도록 유도한다.
11) ‘그람 염색법’, Chemisty블로그,
http://joonyoungsun.tistory.com/entry/%EA%B7%B8%EB%9E%8C-%EC%97%BC%EC%83%89%EB%B2%95-G ram-staning-Method
○ 후속 연구 추진
① 인공 검 베이스가 아닌 천연 물질로 제조한 검 베이스를 바탕으로 한 치약 검 제조
② 검증이 필요한 과학 실험 추가 진행 뒤 소논문으로 발간
□ 연구주제의 선정
○ 우리 학교의 친구들에게 자신이 충치를 가지고 있었는지에 대한 여부를 설문조사한 결과 상당수가 충치를 가졌었고, 충치를 치료한 경험이 많았다고 한다. 또한 1학년 때 진행되었던 진로의 달 동문초청 때 치과의사의 강의를 참석하였는데 충치의 실상에 대해서 강조하셔서 충치의 원인인 뮤탄스균 제거를 위한 치약을 만들고자 하는 동기가 형성되었다. 시간이 나는 대로 팀원들과 네이버 클라우드를 형성하여 서로의 아이디어 나 논문을 담은 자료를 공유하며 적정기술을 중심으로 한 주제를 선정하기 시작했다.
○ 우리학교의 ‘과제연구’ 시간, 즉 자율 탐구 시간뿐만 아니라 방과후에 시간을 조율하며 서로 모여 틈틈이 실험을 하였다. 첫 모임에서 1년치 실험 계획표를 작성했으며 필요한 선행 연구 사례를 조사하고 자문위원을 구하는 과정을 분담하여 진행하였다.
○ 팀 내에서 가족이 치과에서 근무하고 있는 팀원의 도움으로 연세이존치과의 임경란 원장님께 자문을 구할 수 있었다. 자문 과정에서 그 시점까지의 실험이 잘못되었음을 깨닫고 개선 방안을 찾을 수 있었으며 실험 도중에 발생하는 여러 가지 궁금한 점들을 해결할 수 있었다.
○ 현 연구를 진행하기 위해 선행 연구의 초록을 읽어본 결과, 감태나무나 측백나무, 화살나 무 등 항산화, 항염증 및 진통 작용, 생장억제력에 대한 연구내용이 많았다.
○ ‘측백나무에 들어 있는 생장억제물질의 작용’에서는 측백나무의 화학물질이 다른 식물 에 미치는 독성작용을 알아보기 위해 추출뒤 식물을 재배한 결과 발아나 신장 실험의 결과에서 억제효과가 일어났다. 또 측백나무의 휘발성 물질에 의한 수용체 식물의 유식물 신장생장은 차이는 있었지만 대부분 심하게 억제되어 생장 억제 물질로 작용하였다는 결과이다.
○ ‘감태나무의 약리 활성’에서는 쥐의 복강 대식세포에서 IFN과 LPS의 자극에 의해 생성되는 NO를 효과적으로 억제하며 iNOS 효소의 활성 저해와 함께 염증관련 매개효소 인 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 감소에 기인하였다. 이를 통해 감태나무는 항염증이나 진통 작용을 가지고 있는 것을 알 수 있으며 높은 환원력을 지닌다는 연구 결과를 보였다.
○ 우리의 실험이 선행 연구와 다른 점은 측백나무, 화살나무, 감태나무, 흑삼릉의 화학적 구성 성분을 파악한 뒤 섭취 가능 여부를 확인하고 식용 주정으로 추출한 뒤 배지와 혼합하여 뮤탄스균 배양 여부를 산도 측정과 당도 측정으로 확인하여 균 활동 억제 능력의 유무를 판단한다는 점이다.
○ 뮤탄스균 배양을 억제하는 능력을 가진 추출물을 찾아내었을 시에 이것을 치약과 어떻게 혼합시키는가에 대한 고찰 끝에 치약의 형태보다는 껌의 형태로 제조하는 것이 추출물을 넣기 용이하다고 생각하여 껌 형태의 치약 제조에 대한 설계를 하게 되었다.
○ 상품의 화학 (존 앰슬리 저, 고문주 역, 이치 간) 이라는 서적을 구매하여 윤독하며 껌의 기본적인 성분과 제조법에 대한 정보를 얻었다. 또한 껌 만들기 실험에서 필요하다 고 여겨지는 것들을 생각해 보게 되었다.
□ 연구 방법
○ 본 연구는 크게 3가지 부분으로 나뉜다.
① 추출액 만들기
② 균 배양 및 추출물들의 살균 작용 확인 ③ 검 만들기
각자 연구 내용을 분담하여 진행하였다.
○ 추출액 만들기
- 참여 인원 : 3명 (김민준, 정원준, 황승현)
살균 물질이 있을 법한 천연 물질을 조사하여 대표적으로 4종을 선정 하였다. (삼릉, 측백, 감태, 화살) 에탄올과 추출할 천연 물질 삼투압 차이로 인해 추출되는 원리를 이용하여 추출물을 만든다.
○ 균 배양 및 추출물들의 살균 작용 확인 - 참여 인원 : 3명 (김민준, 정원준, 황승현)
- 조작 변인 : 배지에 넣는 추출액의 종류 (삼릉, 측백, 감태, 화살)
- 통제 변인 : 배지의 양, 배지에 넣는 추출액의 양, 배양하는 균의 양, 균 배양 상태
○ 검 만들기
- 참여 인원 : 4명 (김민준, 정원준, 황승현, 한준호)
◇ 1차 – 식품첨가물의 종류와 검의 합성에 따른 검의 질감과 맛의 변화를 알아본다.
- 조작 변인 : 검에 넣는 식품 첨가물의 양과 종류 - 혼합할 식품 첨가물의 종류는 다음과 같다.
글리세린, 멘톨, BHT(디부틸히드록시톨루엔), 레시틴, 슈가 파우더
- 통제 변인 : 각각의 검을 제작하는데 사용되는 검 베이스의 양과 검 베이스를 녹일 때 설정된 온도.
◇ 2차 – pH에 따라 달라지는 양배추 지시약을 이용한 검의 다양한 색 구현 - 조작 변인 – 검에 바르는 산성 식품과 염기성 식품의 종류
- 통제 변인 – 검에 혼합된 각 식품 첨가물들의 종류와 배합 비율
□ 연구 활동 및 과정
○연구 방향 모식도
<그림 12> 연구 흐름도
<그림 13> 전체 연구 방향 설정 흐름도
○살균작용이 있는 천연물질 4종 (감태, 삼릉 ,측백, 화살) 추출물 만들기
천연물질이 스트렙토코커스 뮤탄스균의 생장을 억제하는 효과를 보이는가를 확인하기 위해서는 뮤탄스균 배지에 넣을 천연물질 추출물이 있어야 하였다. 추출 과정에 대해 생각을 하다가 에탄올에 넣고 가열시켜 추출액을 만들면, 삼투압 차이에 의해 추출해 낼 수 있다는 의견이 있어서 천연물질 – 에탄올 추출액을 만들기로 하였다.
①각 천연물질 4종을 50g 씩 측정한다.
②에탄올(94%) 150ml에 각 천연물질들을 넣고 약 15분간 가열시켰다.
③가열 후 증발을 최소화 하기 위해 파라필름으로 감쌌다.
만일 살균효과를 보인다고 해도 에탄올의 살균작용이 조금이나마 작용하지 않았을까 라는 의문점을 가졌었지만 에탄올로 살균효과를 보기 위해서는 농도가 70% 정도로 묽혀야 한다 는 사실을 알게 되었다.
이 추출액들은 우리의 최종 연구목적인 구강 살균 검 만들기에도 사용되므로 사람이 섭취 가능해야 한다. 따라서 에탄올을 대체할 용매로 식용주정, 식용 에탄올을 선정하였다. 농도 도 96%로 우리 실험에 적당한 용매였다.
‘등록특허 10-0937511’ 는 항충치 물질을 식용주정 감초 추출액으로부터 분리해내는 방법에 대한 특허이다. 이 특허에서는 용매는 용질의 중량에 대해 2~4배량을 사용하고 식용주정을 이용한 추출물은 상온에서 12~36시간 동안 행하는 것을 특징으로 한다고 언급되 어있었다. 이를 바탕으로 우리 실험에서는 용질은 125g 사용하고 용매는 1000ml 사용하였으 며 실온에서 25시간이 지난 후 감압기와 거름 장치를 사용하여 걸러내었다.
<그림 14> 거름장치 사용 <그림 15> 감압기 사용
그 후 약간의 천연물질 추출액들을 성분 분석 의뢰를 위해 바이알 병에 담았고, 나머지 추출물들은 냉장보관 하였다.
○페놀류 정색반응
각종 천연물질 추출액 (감태나무, 삼릉나무, 화살나무, 측백나무)에서 살균 효과를 내는 성분들을 분석하여 공통적으로 포함된 물질들을 알아내려는 실험을 진행했었다. 따라서 우리는 대표적인 살균물질들을 조사한 뒤 그 물질들의 유무를 판단하여 역추적 하는 방법으 로 탐구하였다.
약품 장점 단점
하이포아염소산 표백제 모든 미생물을 죽임, 장기간 보관 가능
강한 염소 냄새 다른 산-염기 청소제와
혼합하면 위험 과산화수소 대부분의 미생물을 죽임,
환경친화적임
장기간 보관이 어려움 통상적인 효소에 의해 파괴됨
오존 모든 미생물을 죽임
효과가 오래 지속되지 않음 일반적 용도에 적용하기
어려움
유기 페놀류 박테리아를 죽임
오래 지속됨 환경단체가 제조를 반대함
쿼트 박테리아를 죽임
오래 지속됨
바이러스와 균류에 대해서는 별로 효과적이지 못함 알코올 (70% 수용액) 모든 미생물을 죽임 가연성이며 독성이 있음
<표 3> 소독용 약품의 장점과 단점 – 출처 : 상품의 화학 (존 앰슬리 저, 이치 간) p.206
소독제 효과
박테리아 바이러스 균류 포자 작용방식
하이포아염소
산 살균함 살균함 살균함 살균함
중요한 분자를 산화시킴
클로로페놀류 살균함 대부분
살균함 살균함 내성 있음
중요한 단백질을 산화시킴
쿼트 일부를
살균함
몇 가지 종류를 살균함
살균함 내성 있음 세포막에 구멍을 냄
과산화수소수 살균함 많은 종류를 살균함
몇 가지 종류를 살균함
진한 농도에서
살균이 가능함
DNA같은 중요한 분자를 공격
<표 4> 소독제와 미생물 유형에 따른 효과 – 출처 : 상품의 화학 (존 앰슬리 저, 이치 간) p.212
삼릉 감태 화살 측백
X X X O (흑자색)
<표 5> 염화철 (Ⅲ) 정색반응 결과
그 후 페놀류를 먼저 검출하기로 하였다. 페놀류 검출은 염화철 (Ⅲ) 수용액을 이용한 페놀류 정색반응으로 알아보았다.
①염화철 (Ⅲ) 5.0g을 증류수 10ml에 녹인다.
②시험관 4개에 감태나무, 삼릉나무, 측백나무, 화살나무 4가지의 추출액을 시험관 4개에 500㎕만큼 옮긴다.
③염화철 (Ⅲ) 수용액을 2ml 씩 4개의 시험관에 각각 넣어준다.
보이는 바와 같이 측백나무에서만 페놀류가 검출되었다. 그러나 페놀류를 검출하고 난 다음 페놀류만 따로 분리해낼 기술이 우리에겐 너무 어려운 과제였고 그다음으로 추출할 살균물질인 과산화수소수는 전기화학검출기로 Micro – LC법을 사용해야 했는데, 그런 기구 를 마음대로 사용할 수 있는 환경이 우리에게 주어지지 않았고 제시된 과정조차 이해하기 어려워 추출물을 분석해 역추적하는 과정 대신 추출물의 모든 성분을 검에 사용하는 것으로 실험 방향을 바꾸었고, 성분 분석은 ‘안전모니터봉사단중앙회 친환경시험원’이라는 기 관에 의뢰하기로 하였다.
○ 스트렙토코커스 뮤탄스균 배양
연구를 위해 가장 먼저 해결해야 할 문제는 스트렙토코커스 뮤탄스균을 어떻게 배양하는 가에 관한 것이었다. 이미 언급되었듯이 뮤탄스균은 혐기성 세균으로 공기중에 노출되면 배양이 되지 않는다. 따라서 뮤탄스균을 배양하는 방법에 대해서 조사해 보았다. 뮤탄스균을 Mitis Salivarius agar을 사용하여 만든 배지에 배양을 하게 되는 방법이 있다는 것을 알게 되었는데, 산소 대신에 질소와 이산화탄소가 차 있는 환경에서 배양해야 한다는 까다로운 조건이 있었다. 이때 사용되는 질소 기체는 멸균 되어있는 것을 사용해야 했으므로 우리가 직접 사용하기에는 큰 어려움이 있었다. 그리하여 여러 가지 배양법에 대해 회의를 하였고 다음과 같은 장치들을 고안하게 되었다.
<이중관 실험장치>
‘파스퇴르의 생물속생설 확인 실험’에서 영감 을 얻은 것으로, 한쪽에 분압이 강한 질소 기체를 주입하면 산소기체는 다른 쪽으로 빠 져 나갈 것이고 이때 균이 자라기 위한 환경 조성을 위해 이산화탄소 기체를 전체의 10%
가 되도록 넣어준다. 기체 성분 비율은 MBL 장치로 측정한다. 최적의 환경이 만들어 진 후 A 부분에 멸균된 증류수를 넣어 외부와 차단시킨다.
<표 6> 이중관 시험장치
<이중층 배지 배양법>
고체 배지 두층을 쌓는 방법으로, 각 고체 배지 사이에 균을 넣어 배양하는 방법이다.
이때 균과 함께 질소 기체와 이산화탄소 기 체를 포집하여 두 배지 사이에 가두어 놓아 야 한다.
<표 7> 이중층 배지 배양법
<폐쇄형 압력 분별장치>
기체의 밀도 차이를 이용한 것으로 펌프 A 에서 공기를 빼주면 공기는 고기압에서 저기 압으로 이동하기 때문에 산소기체와 이산화 탄소 기체와 질소기체는 콕 쪽으로 이동한 다. 이때 펌프 B로 공기를 빼준다. 그리고 고 기압에서 저기압으로 이동하는 공기에 의해 콕을 열어주면 이산화탄소와 질소 기체는 원 통 안으로 들어갈 수 있게 된다.
<표 8> 폐쇠형 압력 분별장치
<액체 배지 배양법>
뮤탄스균의 특성을 이용한 배지다. 뮤탄스균은 자당 (Sucrose)를 소비하여 글루칸이라는 것을 만드는데, 이 글루칸은 뮤탄스균으로 하여금 HCl 즉, 산성 물질을 만들어 내도록 한다. 따라서 배 지의 산도가 증가하고 당도가 감소하면 뮤탄스균 이 배양 되었다는 것을 알 수 있다.
<표 9> 액체 배지 배양법
이 중에서 적절한 것에 대해 논의 한 결과 액체 배지에 배양을 하는 것이 쉽고 확실하게 배양될 수 있기 때문에 액체 배지 배양이 가장 적절하다고 생각되었다.. 액체 배지에 배양을 하면, 공기 중에 노출 될 위험도 적고 또 배양이 되었는지의 여부는 뮤탄스균이 자당을 분해하여 산을 만들어낸다는 특성을 이용해 배지의 산도와 당도로 알 수 있을 것이라 생각했 다. 그래서 우리는 액체 배지에 배양하는 방법을 선정하였다.
우선 쉽게 구할 수 있는 LB broth 로 액체 배지를 만들어 보았다.
①증류수 1000ml에 LB borth를 25g 넣는다.
이 과정에서 1000ml의 증류수와 LB both를 섞기가 힘들었기 때문에 증류수 500ml에 LB broth 12.5g을 넣어 각각 2개씩 만든 다음 섞은후 다시 합쳐서 만들었다.
②피펫으로 각 시험관 마다 배지를 10ml 씩 넣는다.
50개의 시험관에 배지들을 나누어 담았다.
③은박지로 시험관 위쪽을 막아준다.
④고압멸균기로 40분 멸균시켜 준다.
고압멸균기에서 배지를 꺼내는 과정에서 외부 물질을 차단해 주는 역할을 가진 은박지가 벗겨진 시험관들이 몇 있었기 때문에 다시 멸균시켜야 했다.
한국 미생물 자원 센터에서 구매한 스트렙토코커스 뮤탄스균 (S. Mutans)은 동결 건조된 상태로 앰플에 보관되어 왔다. 따라서 동결 건조 앰플 재생법으로 0.4ml의 뮤탄스균 현탁액을 만들었다.
균 배양은 클린 벤치에서 시행하는 것이 원칙이지만 부득이하게 클린 벤치에서 배양을 하지 못하게 되었다. 그러나 무균실과 흡사한 환경을 만들기 위해 알코올 램프를 이용하여 상승기류 를 만들고, 그 상승기류가 공기 중의 외부 물질이 배양중인 배지로 떨어지지 못하도록 하였다.
그렇게 총 20개의 배지에 배양을 완료하였다. 배양된 배지들은 모두 항온기에 넣고 뮤탄스 균은 입안에서, 즉 체내에서 활동한다는 것을 감안하여 체온과 같은 36.5°C로 설정하였다.
추출물만 감태 삼릉 화살 측백
pH(최솟값 ~
최댓값) 5.08 ~ 5.50 5.02 ~ 5.45 5.07 ~ 5.54 4.55 ~ 5.11
추출물 +
배지 감태 흑삼릉 화살 측백
pH(최솟값 ~
최댓값) 5.14 ~ 7.62 5.45 ~ 6.41 5.20 ~ 6｡27 5｡26 ~ 5｡58
<표 11> 추출물의 산도와 추출물과 배지를 섞은 용액의 산도 배지
배지의 산도를 pH 시험지로 측정해본 결과 중성으로 검출되었는데, 시간이 지나고 보니 뮤탄스균의 물질 생성에 따라 약간 산성을 띠기 시작했다. 하지만 점점 시간이 지날수록 산도는 증가하여 중성을 넘어 약염기성으로 측정되기 시작하였다.
<표 10> 배지만 pH를 측정했을 때의 결과
<그림 16> 균 배양 중인 모습
2주가 지난 뒤 배지들을 다시 가져와 배양여부를 확인하였다. 배양여부는 산도 측정을 통해 하였다. 뮤탄스균 배양이 가장 잘된 배지 (시험관) 1개를 골라 4개의 홈판에 각각 300㎕씩 넣어두었다. 각각의 홈판에 pH 측정기를 넣고 100초간 측정하였다.
우선 배지를 먼저 측정해 보았다.
추출물이 강염기라 이러한 결과가 나왔을지도 모른다는 생각으로 추출물의 산도도 측정해 보았다.
산도 측정 결과 모든 추출물이 약산을 띤다는 것을 알게되었다. 또한 균을 배양한 추출물과 섞은 배지의 pH값이 산성으로 측정되었다는 것은 균 배양이 잘 되었다는 것을 의미하는데, 추출물의 pH값과 얼마 차이가 나지 않는다는 점을 감안하자면 추출물의 영향이 무시할 수 없을만큼 미쳤다는 것을 의미하기도 한다. 또한 LB액체배지를 만드는 과정에서 Sucrose 를 넣지 않아서 뮤탄스균이 산성 물질을 만들 물질이 없는데 배지가 산성으로 변했다는 사실은 결코 균 때문이 아니라고 판단하였다.
그래서 균 배양을 한번 더 하게 되었다. 이번에는 LB액체배지가 아닌 KCTC (한국생물자원 센터)에서 추천하는 Brain Heart Infusion Broth를 이용한 액체배지를 만들기로 했다.
①1000ml 의 증류수에 Brain Heart Infusion Broth (Difco 0037) 를 37.0g 넣고 녹인다.
②원래 Brain Heart Infusion 액체배지와는 달리 Sucrose를 1g 씩 넣었다.
Sucrose를 넣는 것은 배합 비율에는 없었지만 뮤탄스균이 산을 만들기 위한 환경을 조성하 고 증식을 돕기 위함이다.
③외부 물질을 차단하기 위해 은박지로 싸서 40분간 고압멸균기로 멸균시킨다.
그 후 전과 같은 방식으로 균을 배양하였다.
○균 관찰 실험
우리 연구팀이 배양한 스트렙토코커스 뮤탄스균을 직접 눈으로 확인해보자는 의견이 나오 게 되었다. 그리하여 배양이 잘 된 대조군 시험관에서 가져온 균을 전자 현미경으로 관찰하 기로 하였다.
액체 배지라 균을 슬라이드 글라스 위로 가져오는 작업은 그리 어렵지 않았다.
①멸균된 피펫 팁을 장착한 마이크로 피펫을 이용하여 액체 배지를 슬라이드 글라스 위에 몇 방울 떨어뜨렸다.
②그 후 그람 염색을 하기 위해 사프라닌 용액을 사용하여 고정시켰다.
③전자현미경으로 관찰을 하기 위해 이멀젼 오일을 발랐다.
④1000배 확대하여 관찰하였다.
○검 (Gum) 형태 만들기
모식도에서 언급한 바와 같이 연구 방향을 치약 만들기에서 검 만들기로 바꾸었다. 검 형태로 만들기 위해서는 우선 기본적인 검의 원료인 검베이스가 필요하다. 따라서 쟁탄검 파우더로 우선 기본적인 검 형태의 물질을 만들어 보았다.
◇ 1차 실험
1차 실험은 쟁탄검 파우더의 물에 대한 용해성을 확인하고 물에 녹았을 때에 어떤 변화가 생기는지 확인하는 실험이었다.
▲핫플레이트 위에서 가열하고 있다 ▲페트리 접시 위에서 식히고 있다.
<표 12> 핫플레이트에서 가열한 뒤 식히는 모습
증류수 100ml에 쟁탄검 파우더를 1g 넣고 가열시켰다. 그 중 50ml은 페트리 접시에 부어놓고 나머지 50ml에는 젤라틴을 섞어서 페트리 접시에 부어놓았다. 그 후 냉장고에 넣어놓고 3시간 후에 결과를 확인하였다.
젤라틴을 넣은 것은 검 보다는 젤리처럼 굳었고 젤라틴을 넣지 않은 것은 굳지 않고 흘러내 렸다. 따라서 농도를 높여 보기로 했다.
◇ 2차 실험
2차 실험은 씹기 편한 검을 만들기 위한 쟁탄검의 농도를 찾는 실험이었다.
<그림 17> 임의의 포화상태 그래프
위의 그래프에는 실험한 값과 포화상태를 임의로 지정하여 그래프를 그려 보았다. 그렇다 면 우리가 찾는 적당한 배합 량은 저 두 그래프 사이에 존재하는 것으로 추정이 된다.
그래프의 기울기가 저 두 그래프의 기울기 사이에 있으려면,
<그림 19> 기구 후면 사진
<그림 18> 기구 전면 사진
검가루 4g 5g 5g 6g
증류수 10mL 5mL 6mL 7mL
추의 무게 측정 불가 측정 불가 측정 불가 측정 불가
<표 13> 기구를 사용하여 알아낸 껌의 굳기 빨간색 그래프:
남 색 그래프: (m은 미정계수)
m보다는 기울기가 크고 100 보다는 기울기가 작은 그래프가 그려져야 한다. 기울기 m의 값을 확실히 알기 위해 m의 값을 찾아내는 실험을 하였다.
주사기 안에 임의의 농도의 쟁탄검과 물을 섞은 것을 넣고 컵에 추를 넣어 쟁탄검의 경도를 측정하는 장치를 만들었다. 쟁탄검의 농도를 달리하며 쟁탄검이 주사기 밖으로 나올 때까지 의 무게를 측정하였다.
대략 네 가지 농도의 껌을 제조했지만 네 가지 껌 모두 3kg 가까이 되어도 주사기 밖으로 껌이 모두 나오지 않았다.
<그림 20> m값을 알아내기 위해 실험한 실제 값
검 가루 15g 15g 15g 15g
증류수 20㎖ 30㎖ 40㎖ 50㎖
<표 14> 실험 설정 값
<그림 21> 증류수의 양을 다르게 하여 실험한 모습
20㎖ 30㎖ 40㎖ 50㎖
<표 15> 그림 19 부연설명
따라서 이 실험값들의 기울기들이 m값에 가장 가까운 것들이라고 생각했다. 그리하여 최적 의 점성과 굳기를 알아내기 위해 다음과 같은 값들을 설정하여 실험하였다.
배합 비율은 증류수가 20ml 일 때, 쟁탄 검 파우더가 15g 일때가 가장 적당하였다. 그러나 이렇게 만든 검에는 시간이 지나면 굳어버린다는 치명적인 단점이 있었다. 또한 추출물과 섞어야 하는데, 식용주정에 검 파우더를 녹이면 식용주정은 짧은 시간 내에 모두 증발해 버리고, 남은 검 파우더는 쉽게 부서져 버렸다. 따라서 쟁탄검 파우더는 검 베이스로 사용하기 에 부적합하다는 판단을 내렸다.
검 베이스에 대해 조사를 하다가 천연 검 베이스의 존재를 알게 되었다. 치클, 치퀴볼, 펠리로, 투누, 젤루통, 소브 등이 그 예이다. 또한 이 천연 검 베이스에 공통적으로 포함되어있 는 핵심 물질은 이소프렌으로 고무를 합성할 때 사용되는 것이다. 이 검 베이스는 쉽게 구할 수 있는것들이 아니므로 구하는데 많은 시간이 걸릴 것이라 판단하였고, 일단 시판되고 있는 검 베이스를 가져다가 검 형태를 만들었다.
검 베이스에 우선 추출액을 혼합하여 만들어 보았다.
◇혼합 방법
검베이스를 녹이는 과정에서 천연물질 - 에탄올 추출액을 글리세린과 함께 넣은 다음 유리 막대로 섞어주었다.
측백나무 화살나무
삼릉나무 감태나무
<표 16> 각 추출액을 넣어 완성시킨 검
아래의 4개의 사진은 천연물질 추출액을 섞은 검의 모습이다. 완성되었다고 생각했지만 추출 액으로 추정되는 액체들이 껌에서부터 뚝뚝 떨어졌다. 이렇게 되면 껌에 추출물을 뭍힌 것과 다를 것이 없다는 생각을 하게 되어 추출물과 검을 혼합할 방법들에 대해 회의를 해 보았다.
그 결과 다음과 같은 방법들에 대한 의견이 나오게 되었다.
고안한 방법 문제점
① 당질로 코팅하는 것
당 성분의 물질을 녹여 검 표면에 바르고 다시 굳히면 검에 당질 층이 생기는데, 이 층을 당 성분으로 만드는 대신에 추출액에서 결정을 만들어 층을 만들어 본다.
또는 결정을 껌에 알갱이 형태로 넣어서 반 죽해 본다.
추출물에서 결정을 얻으려면 포화 상태여야 한다. 그러나 우리가 만든 추출액은 포화 상 태인지 아닌지 조차도 확실치가 않았기 때문 에 이 방법은 결정을 만드는 것에 있어서 어 려울 것이라고 판단하였다.
② 가루를 겉에 바르는 것
쟁탄 검 파우더에 추출액을 넣고 반죽한 다 음 낮은 온도에서 가열하면, 식용주정은 증 발하고 반죽은 분쇄가 가능한데, 분쇄된 반 죽은 가루가 된다. 이 가루를 검을 만드는 과정이나 검이 완성된 후 표면에 묻혀본다.
쟁탄 검 파우더는 물과 혼합되면 물에 걸쭉 한 느낌을 추가시킨다. 즉 삼키고 싶지 않은 느낌이 든다. 따라서 사람들이 이런 껌을 씹 으면 침과 쟁탄 검 파우더가 섞여서 매우 좋 지 않은 느낌이 들 수 도 있을 것이다.
<표 17> 검 보존을 위해 고안한 방법들
<그림 22> 분말로 만들어 주고 있는 모습
<그림 23> 완성된 분말의 모습
방법 ②가 문제점도 가장 적고 만들기도 쉽다고 여겨져서 방법 ②로 추진하였다. 우선 천연물질의 살균 작용 성분이 들어간 쟁탄 검 파우더 분말을 만들어 보았다.
①쟁탄 검 가루 15g에 감태나무 추출액을 20ml 넣는다.
감태나무 추출액을 사용하는 이유는 배지의 산도 및 당도 측정 결과 감태나무 추출액의 살균 효과가 가장 뛰어났기 때문이다. 제작이 가능한 방법인지 시도 해 보는 과정이라서 살균 효과가 가장 뛰어난 추출액을 택하고 싶었다.
②낮은 온도에서 식용주정을 모두 증발시킨다.
빠른 증발을 위해 헤어 드라이기의 뜨거운 바람을 이용했다. 드라이기 가동 시작으로부터 10분 정도가 지나고 나니 식용주정이 모두 증발되었음을 확인되었다.
식용주정과 검 파우더가 뭉쳐져서 덩어리를 형성하였다.
③유리 막대로 덩어리를 풀어주어서 분말로 만들었다.
④만들어진 검에 분말을 뿌린다.
과정 ④에서 ‘만들어진 검’ 이라고 했는데, 이것을 만들기 위해 매우 많은 시도를 해 보았다. 검을 씹는 존재는 사람들이기 때문에 미적인 요소가 많이 들어가야 한다고 생각되어 하얗던 검에 색을 입혀 보기로 하였다.
그러나 단순히 색을 입히는 행위보다는 과학적인 원리에 의한 것이 더 낫다고 생각하여 pH값에 따라 색이 달라지는 지시약으로 서로 다른 색들을 입혀 보기로 하였다. 우선 그 발상이 실현 가능한지의 여부에 대해 실험해 보았다. 또한 그 뿐만 아니라 검에 들어가는 식품 첨가물의 차이에 따른 색의 변화에 대해서도 실험해 보았다.
본 연구에 사용될 식품 첨가물은 레시틴 (유화제), 글리세린 (습윤제), BHT (보존제), 멘톨 (감미료), 시트르산 (감미료) 등이 있다. 습윤제는 검이 굳는 것을 방지해 주고 유화제는 검과 습윤제가 잘 섞이고 부드러워 지도록 한다. 보존제는 검을 오랫동안 상하지 않고 보존시 켜주는 역할을 하고 감미료는 청량감을 더해준다.
<그림 24> 검을 만들고 있다.
①껌베이스와 글리세린 (2.96 : 1 의 비율로 혼합)을 핫플레이트 위에서 녹여준다.
②시트르산을 (시트르산 : 글리세린 = 1 :1 .62 의 비율로 혼합)넣은것과 넣지 않은 것을 구분하여 만든다.
③레시틴을 넣은 것과 넣지 않은 것을 구분하여 만든다.
④BHT (디부틸히드록시톨루엔) (전체 성분 중 0.01%)를 넣은것과 넣지 않은 것을 구분하여 만든다.
⑤그 후 만능지시약을 검 위에 부리고 붓으로 대표적인 산성 염기성 식품첨가물 (다시마, 알긴산 나트륨)을 섞어준다.
⑥지시약 색의 변화가 잘 일어나지 않을 수도 있다는 점을 감안하여 식용 색소도 농도를 높여 검에 발라본다.
실제 우리가 만든 검에는 BHT가 사용되지 않았다. BHT는 식품 첨가물로는 인정이 되나12) 미국 FDA에서 광범위하고 심도있는 조사를 시행하였는데, 항산화작용은 우수하며, 건강에 미치는 작용은 복합적이라는 결론을 내렸다고 한다. 뿐만 아니라 콜레스테롤 상승, 호르몬 제에서 발암성 유발, 유전자 손상, 염색채 이동, 신생아 무뇌증 사례 보도, 실험 시 흰쥐의 체중이 저하되는 등 여러 가지 부작용이 있다는 사실을 알게 되어 건강상의 문제로 BHT 사용은 적절하지 않다고 판단한 것이다. 13)
검을 다 만들고 난 후 가장 큰 문제점은 어떻게 보관하고 유통시키는가에 관한 것이었다.
다 완성된 검은 빠르게 굳어서 씹기에 불편해 보았다. 이를 방지하기 위해 습윤제를 사용하였 고, 습윤제와 검이 잘 섞이게 하기 위해 유화제를 사용한 것이다.
12) http://www.vitamincall.com/2012/06/bha-bht.html
13)http://www.cgol.co.kr/m/board.html?code=cgol_board1&page=1&type=v&num1=999954&num2=00000&number=
26&lock=N
빨리 굳어 버리는
것을 방지 습윤제 사용 유화제 사용
<그림 25> 유화제를 사용하기까지의 과정
그러나 습윤제와 유화제도 그리 오래 유지시켜주지 못했다. 습윤제와 유화제는 10분정도 연장 시켜 줄 뿐이지 시판되고 있는 검처럼 몇 개월 동안은 무리인 듯하였다. 그러다 문득 든 생각이 유통 과정에서 굳은 상태로 유통하는 것이 가능하지 않을까 하는 것이었다.
굳은 상태의 검은 입안, 즉 체온에서도 다시 녹았고 90°C온도에서 5~7분 가열하여도 다시 녹았다. 즉 굳은 상태로 유통을 해도 섭취가 가능한 것이었다.
이는 제 3세계 물 부족 국가에서도 충분히 화덕을 만들면 가능하다. 실제로 빈곤국가나 제 3세계 물 부족 국가에서도 집집마다 조리용 화덕은 있을 가능성이 높았기 때문에 유통과정 으로 적당한 방법을 찾은 듯하다.
두 번째 문제점은 바로 맛이었다. 여러 가지 맛을 내는 감미료로는 멘톨, 자일리톨, 시트르산 등이 있었다. 자일리톨보다 단가를 낮추는 검을 만드는 것이 목적이었고 시트르산은 신맛이 너무 강해서 결국에는 멘톨만을 사용할 수밖에 없었다.
멘톨, 레시틴, 글리세린, 검 베이스, 살균물질을 포함한 쟁탄 검 파우더를 혼합한 검을 시험삼 아 10명이 섭취해 보았다. 문제는 쟁탄 검 파우더였다. 쟁탄검 파우더가 침에 녹으면서 가루약 을 먹는 듯한 느낌을 주었기 때문이다.
이 문제를 해결하기 위해서 검을 다 만든 뒤 표면에 쟁탄검 파우더를 묻히는 방법 대신 검 베이스를 녹인 후 파우더를 넣어서 함께 굳히는 방법을 사용하였다. 그 결과 쟁탄 검 파우더가 침에 한 번에 다 녹지 않고 소량이 지속적으로 녹아 살균효과 및 효과 지속성 부분에서 큰 발전이 있었다.
날짜 활동내용
4월 ~ 5월 연구 팀 형성 및 연구 주제 선정
6월 살균 작용이 있을 법한 천연 물질 조사 및 추출액 만들기 7월 LB 배지에 스트렙토코커스 뮤탄스 균 배양 및 배양법 선정 8월 배지 산도 측정 및 균 배양 상태 확인
9월 Brain Heaert Infusion Broth 에 스트렙토코커스 뮤탄스 균 배양 및 기본적인 검 제작
10월 추출액 – 검 혼합물 제작 / 식품 첨가물 종류 및 작용 방식 조사 11월 pH에 따라 색이 달라짐을 이용한 검으로 작품 제작
<표 18> 월별 연구 추진 실적
○ 월별 연구 추진실적
배지 종류 대조군 배양 전 대조군 배양7일후 배지A 대조군 배양7일후 배지B 대조군 배양10일후
배지C 배양 후 평균
pH 7.8 4.88 5.03 4.67 4.86
배지 종류 삼릉나무 배양 전 삼릉나무 배양7일후 배지A
삼릉나무 배양7일후 배지B
삼릉나무 배양10일후 배지C
pH 8.22 6.68 6.19 7.53 6.8
배지 종류 감태나무 배양 전 감태나무 배양7일후 배지A
감태나무 배양7일후 배지B
감태나무 배양10일후 배지C
pH 7.99 6.57 7.4 7.23 7.066667
배지 종류 측백나무 배양 전 측백나무 배양7일후
배지A 측백나무 배양7일후
배지B 측백나무
배양10일후 배지C
pH 7.71 6.1 7.6 7.02 6.906667
배지 종류 화살나무 배양 전 화살나무 배양7일후
배지A 화살나무 배양7일후
배지B 화살나무
배양10일후 배지C
pH 8 6.11 6.89 6.33 6.443333
<표 20> 산도 측정 결과 3. 연구 결과 및 시사점
□ 연구 결과
○ 뮤탄스 균 배양과 살균정도 파악
우리는 발효주정 추출물이 정말 살균효과를 가지고 있는지를 판단하기 위하여 뮤탄스 균 배지를 만든 후 뮤탄스 균의 물질대사 특성을 이용하여 pH측정 실험과 당도측정 실험을 진행하였다. 배지 속 뮤탄스 균이 배양되었다면 뮤탄스 균의 물질대사 산물인 HCl이 증가하여 pH가 낮아질 것이고 물질대사의 과정에서 수크로스가 사용되어 당도가 떨어질 것이라고 예상했다. 그 결과 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
◇ pH측정 실험 결과
4 5 6 7 8 9 10
배양전 배양 7일 후 배지 A 배양 7일 후 배지B 배양 10일 후 배지 C
7.71
6.1
7.6
7.02 7.99
6.68
6.19
7.53 8.22
6.68
6.19 7.8 7.53
4.88 5.03
4.67
대조군 삼릉나무 감태나무 측백나무 화살나무
위 표를 보면 pH는 대조군의 pH가 다른 추출물이 들어있는 배지보다 현저히 낮은 것을 볼 수 있다. 이는 추출물이 들어있지 않은 대조군의 배지에는 뮤탄스 균이 잘 배양되어
배지 종류 대조군 배양 전 배양7일후 배지A대조군 대조군 배양7일후 배지B
대조군 배양10일후
배지C
대조군 배양10일후
배지D
배양 후 평균
당도 7.3 8 8.5 8.1 8.7 8.325
배지 종류 삼릉나무 배양 전 배양7일후 배지A삼릉나무 배양7일후 배지B삼릉나무 배양10일후 삼릉나무
배지C
삼릉나무 배양10일후
배지D
당도 15.7 13.3 10.8 12.6 13.8 12.625 배지 종류 감태나무 배양 전 배양7일후 배지A감태나무 배양7일후 배지B감태나무 배양10일후 감태나무
배지C
감태나무 배양10일후
배지D
당도 14.6 13.3 13.7 12.6 12.4 13
배지 종류 측백나무 배양 전 배양7일후 배지A측백나무 배양7일후 배지B측백나무 배양10일후 측백나무
배지C
측백나무 배양10일후
배지D
당도 14.7 12.7 12.3 12.7 12.6 12.575 배지 종류 화살나무 배양 전 화살나무
배양7일후 배지A 화살나무 배양7일후 배지B
화살나무 배양10일후
배지C
화살나무 배양10일후
배지D
당도 15.6 12.8 11.7 8.3 13.5 11.575
<표 21> 당도 측정 결과
뮤탄스균의 물질대사 결과 HCl이 많이 생성되어 pH가 크게 낮아졌다고 볼 수 있다. 반대로 추출물이 있는 배지의 pH를 보면 추출물의 영향으로 뮤탄스 균이 살균되어 뮤탄스균이 물질대사를 하지 못하였 고 그 결과 pH가 낮아지는 정도가 줄어든 것이라고 할 수 있다. 따라서 우리는 발효주정 추출물에는 살균효과가 있다고 결론지었다. 또한 배양 후 pH와 배양 전의 pH변화량을 보면 측백나무 추출물이 들어있는 배지의 pH변화량이 가장 작으므로 측백나무 추출물의 살균효과가 가장 크다고 볼 수 있다.
◇ 당도 측정 실험 결과
당도 또한 추출물이 뮤탄스 균에 대한 살균효과가 있다고 결론지을 수 있는 근거가 되었다.
대조군의 당도를 보면 추출물이 있는 배지보다 당도가 현저히 낮다. 이를 보고 우리는 추출물의 영향으로 수크로스를 분해하는 뮤탄스 균이 대부분 살균되어 당도가 잘 떨어지지 않았다고 결론지었다. 배양 후 당도의 평균값을 보면 감태나무가 평균값이 가장 높고 배양 전 당도와 배양 후 당도의 변화량이 가장 적다. 따라서 감태나무가 살균능력이 가장 좋다고 볼 수 있다.
6 8.2 10.4 12.6 14.8 17
배양전 배양 7일 후 배지 A배양 7일 후 배지 B 배양 10일 후 배지
C
배양 10일 후 배지
D 14.7
12.7 12.3 12.7 12.6
14.6
13.3 13.7
12.6
12.4 15.7
13.3
10.8 12.6
13.8
7.3 8 8.5 8.1 8.7
대조군
삼릉나무
감태나무
측백나무
화살나무
<그림 26> 전자현미경 사진 – 1 <그림 27> 전자현미경 사진 - 2
◇ 균 관찰
우리는 배양된 눈을 눈으로 직접 확인하고 싶었고, 전자 현미경으로 관찰하기 까지 이르렀다.
다음에 올 사진들은 관찰한 균들의 사진이다.
균체들이 보이는 것을 알 수 있다. 이는 뮤탄스 균과 매우 흡사하게 생겼으며 뮤탄스 균이 배양 되었다는 것의 증거가 될 수 있다.
○식용주정 추출물 실험
우리는 특허 ‘감초로부터 항충치 물질을 추출하는 법’(김형준)에서 발효주정을 이용한 추출물 추출하는 방법을 참조하여 네 가지 식물인 감태, 삼릉, 측백, 화살나무에서 추출물을 추출하는 실험을 하였다.
<그림 28> 네 가지 발효주정 추출물 화살나무 추출물(왼쪽에서 첫 번째), 감태나무 추출물(왼쪽에서 두번째), 측백나무 추출물(왼쪽에 서 세번째), 삼릉나무 추출물(왼쪽에서 네 번째)
이 네 가지 추출물이 식용이 가능할 정도로 안전한 물질인지 확인하기 위하여 성분분석의뢰를 맡겼다.
무기물 (중금속 : , , , ) 유기물 (, )
삼릉
(10종류) (10종류) 검출한계 측정
결과 검출 한계 측정
결과 검출 한계 측정
결과 검출 한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 0.5 불검출 5 불검출 2 불검출 1 불검출 5 불검출 5 불검출
감태
(10종류) (10종류) 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 0.5 불검출 5 불검출 2 불검출 1 불검출 5 불검출 5 불검출
화살
(10종류) (10종류) 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 0.5 불검출 5 불검출 2 불검출 1 불검출 5 불검출 5 불검출
측백
(10종류) (10종류) 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정 결과 검출
한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 검출
한계 측정
결과 0.5 불검출 5 불검출 2 불검출 1 불검출 5 불검출 5 불검출
<표 22> 식용주정을 이용한 항충치 성분 추출물에 대한 안정성 검사 결과표(불검출 : 검출되지 않음 < 검출한계)
출처 : 안전모니터봉사단중앙회 친환경시험원 (단위 : mg/kg)
위 네 가지 추출물의 유해물질 포함여부에 대한 검사표를 보니 네 가지 추출물 모두 섭취에 안전하다는 결과를 받았다.
<그림 29> 식용주정을 이용한 항충치 성분 추출물에 대한 중금속, , 검출 방법 모식도
