STEAM R&E 연구결과보고서
(Monoamine Oxidase 바이오센서 제작에 의한 식품 부패 및 오염 판별)
2015. 11. 16.
경남과학고등학교
< 연구결과 요약 >
과 제 명 Monoamine Oxidase 바이오센서 제작에 의한 식품 부패 및 오염 판별
연구목표
가. 부패 식품에서 발견되는 티라민을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 바이오센서를 직접 고안하고 제작함으로서 기존 검출 기술의 단점 을 보완하고, 부패 식품으로 인한 피해 및 손실을 최소화하는데 기 여한다.
연구방법
가. 문헌 조사와 자문을 통해 바이오센서에 대해 조사한 뒤, 티라민의 검출에 적절한 바이오센서의 형태를 구상한다. 또, 검출에 활용될 적합한 검출 기술을 고안 및 선택한다.
나. 티라민 검출을 위해 고안한 바이오센서를 직접 제작한다. 이 때, 전 자 이동 매체(ferrocene)의 농도, 완충용액의 pH, 미네랄 오일의 비 율 등 여러 변인들을 변화시켜가며 제작한다.
다. 1차 실험에서 유리관 흑연 전극을 사용하였고, 1차 실험의 실패 원 인과 개선방안을 수립하여 이를 적용한 2차 실험을 실시하였다. 2 차 실험에서는 주사기 흑연 전극을 사용하였다.
라. CV 그래프를 작성하여 전극의 활성 여부를 판단한다.
마. 작성한 CV 그래프를 바탕으로 추가연구 계획을 수립하고 이후 실 용화 방안을 수립한다.
연구성과
가. 1차 유리관 전극으로 CV 그래프를 작성할 수 없었다.
나. 1차 유리관 전극으로 CV 그래프를 작성할 수 없었기 때문에 전극이 작동하지 않았던 원인을 분석하고 개선 방안과 2차 실험 계획을 탐색했 다.
다. 2차 실험의 전극은 주사기 형태로 개선하여 피스톤을 이용해 표면을 계속 노출시킬 수 있도록 하였다.
라. 주사기 흑연 전극에서 ferrocene의 함량을 다르게 하였을 때 ferrocene 함량이 0.2g이고 10%의 미네랄 오일이 첨가되었을 때에 CV그래프가 나타났으며, 다른 조건의 전극에 대해서는 측정 실패하였다.
마. 따라서 pH에 따른 전극의 활성 여부를 확인하기 위해서는 10-1 M pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5의 인산완충용액을 용매로 한 티라민을 10-3 M 티라민 용액을 사용하여 전극의 CV 그래프를 작성하여 여러 pH 조건에서의 바이오센서 활성 여부를 확인하였다. 세 pH 모두에서 바이오센서의 활성이 나타남을 확인할 수 있었다.
바. 본 연구를 통하여 부패 식품 및 오염 판별을 위한 새로운 방식을 제안하 였고, 티라민 정량 분석을 위해 티라민과 반응하는 효소인 MAO 효소를 바이오센서 시스템에 이용할 수 있음을 새롭게 제시하였다.
주요어 (Key words)
티라민, MAO 효소 (Monoamine Oxidase), 바이오센서, 탄소전극, 부패 식품
1. 개요
□ 연구 동기 및 목적 ○ 연구동기
식품의 부패 초기에서 우리는 쉽게 식품의 부패여부를 판단할 수 없다. 특히 가정에서 직접 조리한 식품은 가공식품의 유통기한과 같 이 안전성이 보장되는 특별한 기한도 없어 자칫 잘못하면 부패된 식 품을 섭취하여 각종 질병 및 증상이 나타날 수 있다. 사전 조사를 하던 중 바이오제닉 아민이 부패 미생물에 의해 생성되는 유해화학 물질임을 알 수 있었다. 식품의 부패미생물은 아미노산의 탈탄산 작 용을 통해 질소화합물인 바이오제닉 아민을 생성한다. 대표적인 바 이오제닉 아민으로는 히스타민, 티라민 등이 있다.
또한, MSG 등 식품에 인위적으로 첨가함으로써 포함되어 우리의 신체에 질병을 일으킬 수 있는 식품첨가물에 대해서는 여러 매체를 통해 논란거리가 되어왔기 때문에 많은 연구가 진행되었다. 반면 부 패 미생물에 의해 자연적으로 생성될 수 있는 바이오제닉 아민에 대 해서는 진행된 연구가 적었다. 게다가 바이오제닉 아민의 정량 분석 기법에는 상용화된 방법이 없어 고가 및 고성능의 장비와 기술이 필 요함을 알 수 있었으며, 바이오제닉 아민이 실생활에 영향을 미칠 수 있음에도 불구하고 간단한 검출 기술이 개발되지 않아 이를 실생 활에 적용하기가 어렵다는 것이 현 실정이었다. 이에, 적은 비용과 간단한 방법으로 바이오제닉 아민을 정량 분석하여 부패 식품의 섭 취로 인한 각종 질병을 예방할 수 있는 방법에 대한 탐구가 필요하 다고 느끼게 되었다.
○ 연구목적
본 연구에서는 대표적인 바이오제닉 아민 중 하나인 티라민을 대상으로 검출 기술을 개발하고 이의 실생활 적용 가능성을 타진할 것이다. 바이오제닉 아민의 검출 기술로는 효소 및 항체 등 기질 특 이성 등 생물이 지닌 장점을 통해 물질을 검출하는 기술인 바이오센 서를 이용할 수 있을 것이라고 판단하였다. 따라서 부패 식품에서
발견되는 티라민을 신속, 정확하게 검출할 수 있는 바이오센서를 직 접 고안하고 제작함으로서 기존 검출 기술의 단점을 보완하고, 부패 식품으로 인한 질병 및 피해를 최소화함으로서 국민 건강 증진에 이 바지하는 것이 우리의 궁극적 목표이다. 구체적인 연구 목적은 다음 과 같다.
가. 문헌 조사와 자문을 통해 바이오센서에 대해 조사한 뒤, 티라민의 검출에 적절한 바이오센서의 형태를 구상한다. 또, 검출에 활용될 나. 티라민 검출을 위해 고안한 바이오센서를 직접 제작한다. 이 때,
전자 이동 매체(ferrocene)의 농도, 완충용액의 pH, 미네랄 오일의 비율 등 여러 변인들을 변화시켜가며 제작한다.
다. CV 그래프를 작성하여 전극의 활성 여부를 판단한다.
라. 작성한 CV 그래프를 바탕으로 추가연구 계획을 수립하고 이후 실용화 방안을 수립한다.
□ 연구범위
○ 연구 범위 및 진행단계
바이오센서는 물리, 화학, 생명과학, 공학, 디자인 등을 융합한 분야로 실생활에서 신속한 검출 및 정량이 요구되는 분야에서 소변검사지, 혈당 측정기 등과 같이 활발히 이용되고 있다. 본 연구에서는 식품 부패 및 오염 판별을 위한 바이오센서를 개발하기 위해 다음과 같이 연구 범위와 진행 단계를 설정하고 실험에 임하였다.
가. 물리, 화학, 생명과학을 융합한 바이오센서 시스템 설계 나. 효율성 및 실용성 높은 바이오센서 전극의 디자인 및 제작 다. 바이오센서의 CV 그래프 작성 및 활성 여부 판단
라. 추가 연구 계획 및 실용화 방안 수립
2. 연구 수행 내용
□ 이론적 배경 및 선행 연구 ○ 이론적 배경
1. 티라민 (Tyramine)
티라민은 바이오제닉 아민의 일종이다. 바이오제닉 아민은 단백 질을 함유한 식품의 부패 또는 발효·숙성 과정에서 미생물이 유 리아미노산의 탈탄산작용으로 생성하는 생물 기원 물질이다. 식 품과 음료 중의 바이오제닉 아민은 주로 원재료의 효소작용과 미 생물의 아미노산 탈탄산 작용으로 생성된다. 일반적으로 인체에 는 바이오제닉 아민을 분해하는 아민 산화효소가 소장에 존재하 여 무독화 하는 시스템을 갖추고 있지만 과잉의 아민이 섭취되는 경우 또는 우울증 치료제인 phenelzine과 같은 모노아민 산화효소 억제제를 복용하고 있는 환자의 경우 등에는 소량을 섭취하게 되 어도 효소의 작용이 이루어지지 않아 인체에 유해할 수 있다.
<그림 1> 티라민의 구조식과 티라민의 실제 모습
<그림 1>과 같은 구조식을 가진 티라민은 전구체인 티로신으로 부터 만들어진다. 티라민은 체내로 흡수되어 직·간접적인 신경 전달물질로 작용한다. 노르에피네프린의 분비에 관여하여 과량 섭취 시 편두통과 혈관 질환을 유발하고 ‘치즈 반응’과 같은 고혈압 위기를 일으키기도 한다. ‘치즈 반응’이란 티라민 산화 효소의 작용을 억제하는 물질이 함유된 우울증 치료제를 복용한 사람이 티라민이 과량 함유된 치즈를 섭취한 후 사망한 사건을 말한다. 바이오제닉 아민의 생성은 식품의 위생적 측면 뿐 만 아 니라 발효기술 등의 제조방법에 따라 좌우되기 때문에 최근의 국 내·외의 연구들은 각종 식품 중의 이들 함량조사와 함께 이들 성분을 최소화하는 방향으로 진행되고 있다.
티라민은 주로 발효식품에 함유되어 있으며 국내 유통식품의 경
우 김치에서 평균 42.3ppm, 된장에서 평균 363ppm 등으로 나타 났다. 우울증 치료제를 복용하는 사람에 대한 티라민의 섭취제한 량은 조건에 따라 다양하게 변화할 수 있으나, 대부분 혈압상승 이 나타나는 6ppm으로 제한하고 있다. 포도주, 맥주 등의 주류 발효에 관여하는 효모는 티라민 생성능이 없기 때문에 주류에서 티라민이 검출될 경우 세균 오염의 척도로 활용될 수 있다.
2. 바이오센서(Biosensor)
바이오센서는 다음과 같은 넓은 의미를 가진다. 첫째, 생체물질 을 이용한 센서이고 둘째, 생체에 적용할 수 있는 센서이며 셋째, 생체 기능의 메커니즘을 모방한 센서이다. 생체물질을 이용하여 만들어진 화학센서가 좁은 뜻의 바이오센서라고 할 수 있다.
바이오센서의 대부분이 분자인식 기능이 뛰어난 효소 또는 항원 항체 반응을 통해 물질을 검출한다. 생체물질은 고분자막 등에 고정되어 전극으로 사용되고 특정 물질의 식별은 여러 기기에 의 해 신호로 변환 표시된다.
바이오센서는 생체물질을 사용하기 때문에 여러 장점이 있다.
첫째, 측정 대상에 대한 선택성이 탁월하다. 둘째, 상온, 상압 등 매우 온화한 조건에서 작동한다. 셋째, 감도가 매우 예민하다. 혈 당측정기, 소변검사지 등과 같은 일부 효소 센서나 미생물 센서 는 이미 실용단계에 도달해 있다. 바이오센서의 자세한 원리는
<그림 2>와 같다.
<그림 2> 바이오센서의 구조와 원리 모식도
본 연구에서는 티라민을 정량 분석하기 위해 티라민과 반응하는 효소를 이용해 전극을 제작하고 전극에서의 산화 환원 반응에서 발생하는 전류를 측정하는 방법을 사용하기로 하였다.
3. 모노아민 산화효소(Monoamine oxidase)
모노아민 산화효소(이하 MAO 효소)는 모노아민을 분해하는 효소 이다. 모노아민이란 아민 중 질소 원자의 수가 1개인 물질이다.
MAO 효소는 티라민과 산화 반응을 일으켜 분해하는 반응을 하기 때문에 바이오센서에 이용되는 효소로써 사용될 수 있을 것으로 판단되었다. 다음은 MAO 효소가 촉매 하는 반응의 반응식이다.
RCH2NH2 + O2 + H2O → RCHO + NH3 + H2O2
MAO 효소는 기질 선호도에 따라 크게 MAO-A와 MAO-B 두 종 류로 나눈다. MAO-A는 생체 내 아민류를 주로 대사시키며 MAO-B는 생체 외 아민류를 주로 대사시킨다. 황금희(1999)의『한 성 및 열성한약재가 모노아민 산화효소의 활성에 미치는 영향』에 따르면 쥐의 뇌에 MAO-A가 존재하고 쥐의 간에 MAO-B가 존재한 다. 본 연구에서는 1차 실험에서는 MAO-A, MAO-B를 추출하여 활 용하였고, 2차 실험에서는 MAO-B를 구입하여 바이오센서를 개발하 였다.
□ 연구주제의 선정
티라민 등과 같은 바이오제닉 아민이 식품 부패 및 오염의 지표로 활용될 수 있다는 점과 현재 신속 검출 기술이 비경제적이라는 점에 착안하여 티라민을 분석하기 위한 기술의 필요성을 느끼고 문제 해 결 방법을 구상하였다. 바이오센서는 생체물질을 사용했기 때문에 탁월한 선택적 작용을 통해 측정하고자 하는 기질을 판별할 수 있으 며, 상온 및 상압 등에서 작동하여 실용성이 높다는 장점에 착안하 여 바이오센서로 티라민을 측정하기로 하였다.
바이오센서 연구에는 분석화학 기법에 대한 지식이 많이 필요하다.
산화 환원 반응에 대한 기본적인 이해, CV 그래프 작성을 위해 Three Electrode System을 사용하는 이유와 전기 회로의 원리의 이해가 필 요하다. 화학 분석기기를 다루는 법과 측정을 위해 소프트웨어의 사 용법을 익혀야한다. 또한 생물학적 지식으로는 효소와 기질의 반응에 대한 이해가 필요하다.
□ 연구 방법
○ 바이오센서 전극 유형 조사
바이오센서의 제작을 위해 효소를 고정시키기 위한 전극이 필요하 다. 어떤 유형의 전극이 MAO 효소를 이용한 전극에 적합한지 알아 보기 위해서 바이오센서 전극의 유형에 대해 조사하였다. 전극의 유 형에는 크게 원판전극, 매달린 수은방울전극, 미소전극, 샌드위치형 흐름 전극이 있다.
원판전극은 가장 간단한 형태의 전극으로 관의 끝부분에 효소 Paste를 넣은 형태이다. 매달린 수은방울전극은 수은 저장소에 연결 된 매우 미세한 모세관으로 되어있다. 금속수은이 마이크로미터 나 사로 작동되는 피스톤에 의해 모세관 밖으로 밀려나온다. 미소전극 은 작은 직경의 금속선이나 섬유 등을 유리몸체에 붙인 것으로 효소 를 고정시킨 막 또는 생체 조직을 그대로 끝에 입힌 형태로 사용되 기도 한다. 샌드위치형 흐름 전극은 몇 가지 모양의 다른 크기의 전 극과 여러 가지 배열이 가능하다. 여러 층의 고분자 화합물을 결합 하여 전기화학적 사이클 또는 전기전도성 면에서 성능을 상승시킬 수 있다.
○ 바이오센서 시스템 조사 1. Three Electrode System
바이오센서에서 미세 전류를 측정하기 위한 장치로 Three electrode system을 사용하기로 하였다. Three electrode system은 측정한 기질이 들어있는 Cell 내부에 작업 전극, 상대 전극, 기준 전극의 세 개의 전극을 사용하는 방법이다. 효소가 있는 전극이
작업 전극에 해당한다.
2. 순환 전압전류법(Cyclic Voltammetry)
바이오센서를 사용하기 위한 방법으로는 순환 전압전류법을 사 용하기로 하였다. 순환 전압전류법에서는 <그림 3>와 같은 형태 의 전압이 작업 전극에 가해진다. 한 번 순환이 일어나는 동안
<그림 4>과 같은 형태의 CV 그래프로 전류 변화를 측정할 수 있 다. 전압을 선형으로 감소시키는 동안은 처음 윗부분으로 환원파 를 나타낸다. 전극 근처에서 분석물질이 급감하기 때문에 확산 속도가 느려져 전극 근처에 분석물질이 보충되는 속도가 느려진 다. 이 때문에 전압이 (-)로 진행하면서 전류가 작아진다. 다시 전 압이 (+)로 진행하면서 산화파를 만들어낸다. 이 때 각각 봉우리 의 전류는 기질의 농도와 정비례하기 때문에 봉우리의 전압을 Three electrode system에 걸어주게 되면 측정되는 전류를 바탕으 로 기질의 농도를 측정할 수 있다.
<그림 3> 순환전압전류법에서 사용되는 파형
환원파
산화파
<그림 4> CV 그래프
□ 연구 활동 및 과정
1. 바이오센서 시스템 설계
본 연구에서는 Three electrode system을 기반으로 한 순환전압전류법 을 활용하기로 하였다.
2. 1차 바이오센서 유리관 전극 디자인 및 제작 가. 전극 디자인
본 연구에서 사용할 전극의 종류는 원판전극을 사용하기로 하였다.
원판전극은 제작이 가장 간단한 형태이고 여러 변인을 바꾸어 가며 제작하기 편리하다고 판단되었다. 또한 Paste로는 Carbon Paste를 사용 하기로 하였다.
나. 전극 제작 과정 (1) MAO 효소 추출
1) Mouse와 Rat의 해부를 통한 MAO 효소 조제
① Mouse를 경추탈골법으로 안락사 시키고, Rat의 경우 흡입마 취법으로 절식시킨 후 적출한 조직을 각각 0.01M PBS용액 (인산 완충 식염수, pH 7.0)으로 세척한 뒤 조직을 파쇄한다.
② 간 조직에 습중량 1g당 5ml의 차가운 0.25M sucrose 용액을 가한다. 뇌 조직에 습중량 1g당 9ml의 차가운 0.25M sucrose 용 액을 가한다.
③ 파쇄액을 고속원심분리기를 이용해 4℃에서 700×g로 20분간 원심분리하고 그 상등액을 취하여 다시 18000×g로 20분간 고속 원심 분리한다. 상등액을 버리고 pellet을 중량 1g당 PBS 5ml에 현탁시켜 효소로 사용한다.
(2) 유리관 흑연 전극의 제작
1) 흑연 전극의 제작 및 흑연 반죽의 최적 묽기 탐색
① 효소 반죽 부분을 만들기 위해 흑연과 ferrocene 0.05g, 0.10g, 0.15g, 0.20g, 0.25g을 혼합해 총 1g이 되도록 한다. Three electrode system에서 작업 전극의 효소가 기질과 산화-환원 반 응을 일으킬 때 거리적으로 멀리 떨어져 있고, 단백질 분자 속 의 효소 활성 부분이 전극에 근접하지 않아 효소 자체의 반응이 이루어지는 것이 쉽지 않기 때문에 전자 이동매체로 ferrocene 을 사용한다.
② ferrocene을 용해시키기 위해 클로로포름을 약 20ml 부은 후 교반기로 가열하여 클로로포름을 모두 휘발시킨다.
③ 클로로포름이 모두 휘발된 후에 ②의 혼합물과 미네랄 오일 을 혼합한 후 효소를 MAO-A, MAO-B에 대해 각각 효소의 양을 0.05ml, 0.10ml, 0.15ml, 0.20ml, 0.25ml 첨가 및 혼합한 뒤 효소 반죽과 미네랄 오일의 비율을 6:4로 하여 혼합한다.
④ ③에서 만들어진 효소 반죽을 유리관 끝부분에 1cm만큼 채 우고, 구리선의 피복을 벗긴 후 유리관에 꽂아 전극을 완성한다.
3. 1차 CV 그래프 작성
제작한 전극으로 Electrochemical Analyzer를 이용해 티라민의 CV 그래프를 작성해본다. 소프트웨어는 CHI 1000-Multi Potentiostat을 사용하였다. 티라민을 이용한 실험에 앞서 CV 그래프의 형태를 시 험해보기 위해 기질로 지시전해질 중 하나인 0.1M KCl 용액을 이용 해 CV그래프를 그려본다. 다음으로 Cd(NO3)2을 기질로 하여 System 이 정상적으로 작동하는 것을 확인한다.
4. 실패 원인 분석 및 2차 실험 설계
1차 실험에서는 제작한 바이오센서를 이용하여 CV 그래프를 그려 보기 위한 시도를 하는 과정에서 MAO 효소 바이오센서의 제작 과 정에서 이전에 생각했던 것보다 다양한 변인이 존재하여 쉽게 CV 그래프가 작성되지 않는 것을 깨달아 인근 경상대학교의 서무룡 교 수님께 자문을 구하였다. 그 결과 전극의 최적 조건을 재료의 비율 조절을 통한 여러 번의 실험을 통해 탐색하여야 함을 깨달았다. 또 한 전극의 형태는 유리관에 효소반죽을 채우는 방법을 사용하였는 데 반죽이 전극 사용에 따라 점점 소모되어 유리관의 끝에 반죽이 제대로 위치하지 못할 뿐 아니라, 반죽이 유리관 내부로 점점 들어 가 오염된 표면을 닦아낼 수 없다는 단점이 있었다. 이를 해결하고 더 나은 전극의 제작을 위한 개선 방안에 대해 깊이 탐구하였다.
본 연구에서는 1차 실험의 문제점을 다각도로 분석한 것을 활용하
여 개선을 통해 2차 실험에 적극적으로 적용하였다.
5. 2차 바이오센서 주사기 전극 디자인 및 제작 가. 주사기 흑연 전극의 착안점
1차 실험에서 사용하였던 유리관 전극 방식에 비교하여 주사기를 이용한 주사기 흑연전극은 다음과 같은 이점을 통해 전극의 반응성 과 정확성을 향상시킬 수 있다.
첫째, 유리관 방식의 경우 전극의 사용량이 증가함에 따라 전극의 표면이 유리관 내부로 계속해서 들어가 효과적인 반응이 일어나기 어렵게 된다. 따라서 주사기 형태로 개선하여 피스톤을 이용해 표 면을 계속 노출시킬 수 있도록 하였다. 둘째, 유리관 방식의 경우 전극의 표면이 계속 유리관 내부로 들어가 기질에 의해 오염된 표 면을 계속 사용할 수밖에 없게 되므로 피스톤 방식을 이용하면 표 면을 밀어냄으로써 이를 개선할 수 있다. 마지막으로 유리관 방식 의 경우 구리선의 안정적인 고정을 위해 효소 반죽 부분 위에 흑연 반죽을 채워 넣었다. 주사기 방식에서는 피스톤에 구리선을 고정시 킴으로서 불필요한 흑연 반죽의 낭비도 막을 수 있다.
나. 주사기 흑연 전극의 제작
① 0.0g ~ 0.4g까지 0.1g씩 늘려가며 ferrocene을 약 20ml의 클로 로포름에 용해시킨 후 1.0g의 탄소분말과 혼합한 후 교반기로 가 열 및 교반하면서 용매를 증발시킨다.
② ①의 혼합물 1g을 취하여 효소의 활성 잃음을 방지하기 위해 0.1ml의 polyethylene glycol에 용해시킨 MAO-B 0.05ml를 첨가한 뒤, 탄소반죽을 균일하게 혼합한다. 전극 성형을 위해 미네랄 오일 을 10%, 20% 질량비로 변인을 설정하여 첨가한 뒤 완전히 혼합한 다.
③ 주사기 실린더의 바늘을 제거한 뒤 끝부분을 편평하게 자르고, 끝 1cm 정도를 ②에서 제작한 탄소반죽으로 채운다. 1mm 구리선 의 피복을 벗기고 피스톨에 감아 실린더에 꽂아 전극을 완성한다.
⑤ pH 7.2 인산완충용액에 담근 뒤 효소의 변성을 막기 위해 냉장 보관한다.
6. 2차 CV 그래프 작성
1차 실험과 같은 방법으로 작성하되, 지시전해질을 인산완충용액으로 설정하여 실험한다. Cd(NO3)2을 기질로 하여 System이 정상적으로 작동 하는 것을 확인한 뒤에는, pH 7.2 10-1 M 인산완충용액을 용매로, 10-3 M 티라민 용액을 이용하여 CV 그래프를 작성한다.
7. 지시전해질 pH에 따른 바이오센서의 활성 여부 탐색
바이오센서의 전극이 기질 용액에서 제대로 작동하기 위해서는 기 질 용액이 전해질이 되어야 한다. 전해질 용액으로써 일정한 조건을 유지할 수 있고 반응에 참여하지 않는 용액을 사용하기 위해 완충용 액으로는 인산완충용액을 사용하였다. 1차 실험에서는 효소의 특성 에 맞는 지시전해질을 고려하지 않은 것이 실패의 원인 중 하나였 다. 따라서 본 실험에서는 더욱 정밀한 측정을 위해 지시전해질 pH 에 따른 바이오센서의 활성을 탐색하는 실험을 진행하였다.
① 티라민과 Monobasic, Dibasic을 이용하여 pH 6.5, 7.0, 7.5 10-1 M 인산완충용액을 용매로, 10-3 M 티라민 용액을 제조한다.
② ①에서 제조한 티라민 용액에 5.에서 ferrocene 함량, 미네랄오 일의 함량을 다르게 설정하여 제작한 주사기 흑연 전극을 이용해 CV 그래프를 작성하여 전극의 pH에 따른 활성 여부을 찾는다.
8. 추가연구 계획 및 바이오센서 실용화 계획 수립
지금까지의 탐구를 통해 바이오센서의 활성 여부를 판단하였다.
추가연구를 통해 바이오센서의 민감성과 정확성을 높일 수 있도록 계획의 수립이 필요하다. 또한, 식품의 부패 및 오염 여부를 가정에 서도 쉽게 판단할 수 있도록 하기 위해서 일반 대중의 사용도 편리 한 형태의 바이오센서를 고안하는 것이 필요하다.
9. 연구 활동 및 과정 가. 월별 연구 추진
주요 활동 시 기 비 고
참고문헌 조사 등 이론적 배경 확립 15.5월~6월
전문가 자문을 통한 연구방법 탐색 15.6월 경상대학교 환경분 석 연구실
기존 전극의 문제점 분석 및 개선 방안 추가 탐색 15.6월
바이오센서 제작법 연구 15.7월~8월
바이오센서를 이용한 CV 그래프 작성 및 개선
방안 탐색 15.7월~8월
중간 발표회 보고서 및 차트 작성 15.9월 STEAM R&E 권역별 중간 발표회 15.9월
전문가 자문을 통한 연구방법 탐색 15.6월~11월
서무룡교수(경상대학교 환경분석 연구실) 및 오세 현(경남과학고)
바이오센서를 이용한 CV 그래프 작성 및 개선
방안 탐색 15.9월~11월
본 연구에서 개발한 바이오센서 활용방안 설계
및 실생활 적용 방안 모색 15.11월
결과보고서 작성 및 발표 준비 15.11월 STEAM R&E 페스티벌 개최, 최종 보고서 제출 15.11월
다. 시설 활용
시설/기기 명 보유기관 활용 내용
E l e c t r o c h e m i c a l
Analyzer 경상대학교
CV 그래프 측정을 위한 측정 기기이고 본교에 서 구입할 수 없는 고가 장비이므로 경상대학 교 환경분석연구실을 이용
pH meter 경남과학고 pH 측정
라. 외부 전문가 활용
외부 자문이 필요한 과정 / 요소 소속기관
CV 그래프 측정을 위한 분석 기기
분석 기기와 연동되는 소프트웨어 사용 경상대학교 바이오센서 전극 제작에서의 문제점 해결
3. 연구 결과 및 시사점
□ 연구 결과
1. 1차 바이오센서 유리관 전극
본 연구에서 1차 실험을 위해 제작한 유리관 전극은 다음 <그림 5>와 같다.
<그림 5>
1차 바이오센서 유리관 전극
2. 1차 CV 그래프
기존에 제작되어 있는 탄소유리전극을 이용해 0.1M KCl 용액의 CV 그래프를 <그림 6>과 같이 작성하였다. 그리고 Cd을 기질로 이 용해 CV 그래프를 작성해보았다. 그 그래프는 <그림 7>과 같다. 이 때 산소가 환원되는 산소파를 관찰할 수 있었다.
<그림 6>
KCl 용액 CV 그래프
<그림 7>
Cd 용액 CV 그래프
직접 제작한 MAO 효소 전극을 이용해 0.1M KCl 용액의 CV 그 래프를 작성하였다. (그림 8) 그리고 Cd을 기질로 이용해 CV 그래 프를 작성해보았다. (그림 9) 그 그래프는 다음과 같다.
<그림 8>
1차 유리관전극 KCl 용액
<그림 9>
1차 유리관전극 Cd 용액
제작 시의 변인을 달리해가며 CV 그래프를 작성하고 측정 조 건을 여러 가지로 바꾸어 가며 반복 측정해보아도 <그림 8>의 그래 프와 같이 전류의 변화가 미미하였다. Cd을 기질 용액으로 하여 전 류를 측정해보았을 때 전류 변화의 경향성은 나타났으나 전류의 변 화가 미미했다. (그림 9) CV 그래프를 작성할 수 없었던 것은 전극 의 전도성과 연관이 있었을 것으로 분석하였다. 따라서 전극의 제 작 과정에서 문제점을 파악하고 개선된 전극을 만들기 위한 원인 분석을 하기로 하였다.
3. 실패 원인 분석 및 2차 실험 설계
1차 유리관 전극으로 CV 그래프를 작성할 수 없었기 때문에 전극 이 작동하지 않았던 원인을 다음과 같이 분석하고 개선 방안과 2 차 실험 계획을 탐색했다.
가. 전극을 제작하는 방식에서 더 나은 형태의 전극을 제작할 방법 이 필요하다고 느꼈다. 새로운 형태의 전극으로 주사기 형태의 전극을 구상하였다. 주사기를 이용해 기존 흑연 전극의 흑연
반죽 부분 없이 효소 반죽에 구리선을 바로 연결할 수 있을 것 이다. 또한 측정 시마다 전극의 오염을 방지하기 위해 전극의 표면을 닦아내야 한다. 이때 주사기의 피스톤을 이용해 반죽을 밀어낸다면 계속해서 새로운 효소 반죽 부분을 노출시킬 수 있 다.
나. 전극의 제작에 사용된 흑연 반죽의 흑연과 미네랄 오일의 비율 이 너무 묽었다. 이로 인해 전극의 저항이 커져 미세한 전류가 흐르기 어려웠을 것이다. 또한 반죽이 묽으면 기질 용액에 반 죽이 묻어나올 가능성이 있다. 그렇기 때문에 2차 연구에서는 흑연의 비율을 더 높이고 효소를 직접 추출하지 않고 구입하여 반죽을 제작했다. 또한 반죽이 묻어나오는 것을 방지하기 위해 전극에 효소 반죽을 밀도 높게 충진 시킬 것이다. 이를 통해 전극의 반응성과 정확성을 높일 수 있다.
다. 바이오센서의 전극이 기질 용액에서 제대로 작동하기 위해서는 기질 용액이 전해질이 되어야 한다. 전해질 용액으로써 일정한 조건을 유지할 수 있고 반응에 참여하지 않는 용액인 pH 7.2.
0.1M 인산 완충 용액을 사용하였다. 더욱 정밀한 측정을 위해 pH 6.5, 7.0, 7.5에서 전극의 활성 여부를 탐색하는 실험을 진행 하였다.
라. 시중에 판매되는 탄소유리전극을 이용해 전기전도성을 시험하 고 정제되어 있는 MAO 효소를 이용해 전극을 제작하여 전극의 반응성을 측정하였다.
4. 2차 바이오센서 주사기 전극
본 연구에서 개선 방안을 바탕으로 2차 실험을 위해 제작한 유리관 전극은 다음 <그림 10> 과 같다.
<그림 10> 2차 바이오센서 주사기 전극
5. 2차 CV 그래프
기존에 제작되어 있는 탄소유리전극을 이용해 Cd을 기질로 이용해 CV그래프를 작성해보았다. (그림 11) 다음으로는 pH 7.2 10-1 M 인 산완충용액을 용매로 한 10-3 M 티라민 용액을 이용해 CV 그래프를 작성하였다. (그림 12)
<그림 11>
Cd 기질 CV그래프
<그림 12>
티라민 용액 CV그래프
6. 전극 활성 여부 탐색 결과
주사기 흑연 전극에서 ferrocene의 함량을 다르게 하였을 때 ferrocene 함량이 0.2g이고 10%의 미네랄 오일이 첨가되었을 때에 CV그래프가 나타났으며, 다른 조건의 전극에 대해서는 측정 실패하였다.
따라서 pH에 따른 전극의 활성 여부를 확인하기 위해서는 10-1 M pH 6.5, pH 7.0, pH 7.5의 인산완충용액을 용매로 한 티라민을 10-3 M 티라민
용액을 사용하여 전극의 CV 그래프를 작성하여 여러 pH 조건에서의 바이오센서 활성 여부를 확인하였다. 세 pH 모두에서 바이오센서의 활성 이 나타남을 확인할 수 있었다.
<그림 13>
pH 6.5 CV그래프
<그림 14>
pH 7.0 CV그래프
<그림 15>
pH 7.5 CV그래프
7. 추가연구 계획 및 바이오센서 실용화 계획 수립 가. 추가연구 계획 수립
작성한 CV 그래프를 바탕으로 감응전류를 측정하여 바이오센서의 정확 도 향상을 추구할 것이다. 미지농도의 티라민 용액에서 티라민의 농도를 측정하는 실험을 진행할 것이다. 또한 바이오센서를 이용하여 부패 및 오염식품에서 티라민의 농도를 측정하여 부패 및 오염을 판별함으로서 부패 및 오염 판별 바이오센서로서의 기능을 확인할 것이다.
나. 바이오센서 실용화 계획 수립
지금까지의 탐구를 통해 바이오센서의 최적 조건을 찾았다. 추가 연구를 통해서는 바이오센서의 민감성을 높이고 바이오센서를 더욱 실용적으로 발전시키기 위해 가정 및 식품 가공업체에서 쉽게 활용 가능한 형태의 키트를 고안하고 개발할 것이다. 소변 검사지는 신 체 내의 여러 질병들을 간단한 형태의 검사지의 색변화를 통해 일 반 대중들도 쉽게 사용할 수 있도록 제작되어진 바이오센서이다.
이와 같이 식품의 부패 및 오염 여부를 가정에서도 쉽게 판단하기 위해서는 일반 대중들도 알기 쉬운 형태의 바이오센서를 고안하는 것이 필요하다.
□ 시사점
1차 탐구에서 실패하였던 실험을 철저한 개선 방안을 통해 개선하고 2차 실험이 성공함으로써 연구에 대한 열정과 끈기를 학습할 수 있었다. 뿐만 아니라 추가연구 계획과 실용화 방안을 수립하여 본 연구에 대한 책임감을 가지고 지속적으로 진행함으로써 연구자의 진정한 자세에 대해 학습할 수 있었다.
4. 홍보 및 사후 활용
□ 후속연구 추진
연구 과정 중에 수립한 추가 연구 계획을 활용하여 후속 연구를 진행할 것이다. 후속 연구의 진행을 통하여 전극의 검정 곡선을 작성한다면 전극의 정확성과 민감성을 상당히 향상시킬 수 있을 것이며, 실제 부패 및 오염식 품에 적용하여 티라민을 검출한다면 본 연구에서 고안한 바이오센서 시스 템의 센서로서의 실용성이 높아질 것이다.
□ 검출이 손쉬운 바이오센서 형태 개발
소변검사지와 같은 센서의 시각화를 통해 검출이 손쉬운 바이오센서 형태 를 개발한다면 일반 대중 및 식품 공정 과정 중에서도 손쉽게 식품 오염 및 부패 여부를 판단할 수 있을 것이다. 아두이노 등을 이용하여 검정 곡선을 통해 광학적 신호 등으로 정보를 변환한다면 일반 대중도 쉽게 확인 가능한 실용성 높은 센서를 개발할 수 있을 것이다.
□ 티라민 저감화 기술 개발에 기여
바이오센서를 제작한다면 유통되는 발효 식품에 대한 티라민을 검 출하여 식품의 위험성에 대한 평가를 할 수 있다. 시간이 흐름에 따 라 티라민의 농도가 얼마나 증가하는지를 측정하여 부패미생물이 식 품에 미치는 작용에 탐구를 진행할 수 있을 것이다. 예를 들어 재래 식 메주의 경우 세균인 고초균(Bacillus subtilis)과 곰팡이인 황국균 (Aspergillus oryzae)에 의해 발효가 이루어지고, 개량식 메주는 황국균 을 주로 이용하여 만든다. 이러한 조건에 따른 바이오제닉 아민의 농
도를 측정하면 메주 발효 공법의 비교 연구를 진행할 수 있고 바이 오제닉 아민 저감화 연구에 기여할 것이다.
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