<i>In Vitro</i> Anti-<i>Helicobacter pylori</i> Activity of Purified Bee Venom Collected from Honeybee (<i>Apis mellifera</i> L.) Workers

DOI 10.17480/psk.2017.61.6.350

정제봉독의 헬리코박터 파이로리에 대한 항균활성

한상미^# · 홍인표 · 우순옥 · 김세건 · 장혜리 농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부

(Received August 28, 2017; Revised December 22, 2017; Accepted December 23, 2017)

In Vitro Anti-Helicobacter pylori Activity of Purified Bee Venom Collected from Honeybee (Apis mellifera L.) Workers

Sang-Mi Han^#, In-Pyo Hong, Soon-Ok Woo, Se-Gun Kim,and Hye-Ri Jang

Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Science, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea

Abstract — This study was to investigate the antimicrobial effect of purified bee venom(PBV) against Helicobacter pylori, which is known to cause gastric ulcer and stomach cancer. Antimicrobial activity was evaluated by minimum inhibitory con- centration(MIC), minimum bactericidal concentration(MBC) and time-kill assay of PBV against H. pylori. As a result, there was no significant difference in the antibacterial activity between amoxycillin(positive control) and PBV that have MIC of 0.13±0.036µg/ml and MBC of 0.26±0.042 µg/ml. In addition, PBV treatment was found to inhibit significantly growth of H. pylori after 4 hr. In order to investigate the morphological changes of H. pylori by bee venom treatment, the morphology of H. pylori was observed by scanning electron microscope(SEM). H. pylori treated with PBV was also showed that the cell wall and cell membrane were completely destroyed, and all of the cell components were leaked out, resulting in the dis- appearance of the bacterial form. These results suggest that PBV have significant inhibitory effects on H. pylori, and there- fore, may be a potential anti-H. pylori candidate.

Keywords bee venom, Helicobacter pylori, anti-bacterial, scanning electron microscope, minmum inhibitory concentration, minimum bactericidal concentration, time-kill assay

Helicobacter pylori(H. pylori)는 그람 음성, 미호기성 간균으로 사람의 위 점막에서 분리, 배양된 이후 만성 위염, 소화성궤양, 십이지장 궤양 및 위암을 일으키는 원인균으로 알려져 왔다.^1,2) 전 세계 인구의 반수 이상, 우리나라 16세 이상 H. pylori 유병 률은 59.6%로 나타났으며, 남성이 여성보다 감염비율이 높고 50 대에서 가장 높은 유병률을 가진다고 조사되었다.³⁾보통 H. pylori 감염경로는 전염에 의한 것으로 알려져 있으며, 한국인의 경우 가족 간의 공동생활과 전통적인 식습관에 의하여 높은 보균율을 가지고 있다고 보고되고 있다.³⁾또한 한번 감염되면 수년 또는 일생동안 감염이 지속되고 자연 치유되기는 어렵다고 한다. 전

형적인 항생제 치료의 경우 항생제 노출에 따른 내성균의 출현 과 환자의 치료 약물에 대한 적응이 어려워 기존의 항생제 요법 으로는 치료에 한계가 있기 때문에, 이를 극복할 수 있는 효과적 인 제균법이 요구되고 있다.⁴⁾최근 약용식물과 우리나라 제주 자 생식물을 대상으로 H. pylori에 대한 항균 활성을 확인하고자 하는 연구들이 활발히 진행하고 있다. 마늘(Allium sativum)과 계피 (Cinnamomum cassia), 단삼(Salviae miltiorrhiza), 목단피(Paeonia suffruticosa) 등의 약용식물과 담팔수(Elaeocarpus sylvestris), 함박 꽃나무(Magnolia sieboldii), 굴피나무(Platycarya strobilacea) 등에서 우수한 항균력을 갖고 있는 것으로 보고하였다.⁵⁾

서양종꿀벌(Apis mellifera L.) 일벌의 독인 봉독은 다양한 성 분이 복합적으로 구성되어 있으며, 주성분인 멜리틴(melittin)은 항균작용,⁶⁾항염증과⁷⁾강력한 진통작용,⁸⁾면역증강⁹⁾등의 역할 을 한다고 알려져 있다. 봉독은 그람양성 세균인 Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Streptococcus agalactiae, Streptococcus iniae는 물론 그람음성 세균인 Salmonella newport,

#

Corresponding Author Sang-Mi Han

Lab. of Clinical Pharmacy, College of Pharmacy, The Catholic University of Korea, Bucheon 14662, Korea

Tel.: 063-238-2896 Fax.: 063-238-3832 E-mail: [email protected]

Short Report

Salmonella typhimurium 등에 강한 항균력을 갖고 있다.^10-14)뿐 만 아니라 항생제 내성균인 MRSA(methicillin-resistant S.

aureus)에 대해서도 우수한 항균력을 갖고 있는 것으로 보고한 바 있다.¹⁵⁾본 연구팀에서는 2005년 봉독채집장치와 채집된 봉 독으로부터 이물질을 제거할 수 있는 봉독정제법을 개발하였다.

정제봉독은 멜리틴 함량이 50~70% 범위로 꿀벌이 갖고 있는 순수 봉독으로 히스타민을 비롯하여 히알루니다아제, 포스포리 파아제 등 꿀벌의 봉독 성분을 온전히 갖고 있는 상태의 봉독이 다.¹⁶⁾이로서 국내에서도 봉독 채집과 균일한 정제봉독 생산이 가능하게 되었으며, 정제봉독은 화장품과 의약품의 원료로 사용 이 상용화되었다. 따라서 본 연구에서는 정제봉독의 H. pylori에 대한 항균력을 규명하여 천연물 유래 H. pylori 항균물질로 개발 하고자 한다.

실험 방법

공시 시료 및 성분 분석

시험물질인 정제봉독은 봉독채집장치를 사용하여 서양종꿀벌 로부터 채취한 봉독을 ‘봉독의 간이정제방법’으로¹⁷⁾정제한 정제 봉독을 구입하여 사용하였다(한국정제봉독협동조합, 한국). 구입한 정제봉독의 성분 확인을 위하여 1 mg/ml의 농도로 3차 증류수에 녹여 PTFE 0.2 μm 필터로 여과하여 UPLC(ultra performance liquid chromatography, Waters, MA, USA)를 사용하여 분석하였다.

표준품인 apamin, melittin, 그리고 phospholipase A₂는 시그마 사(Sigma-Aldrich, MO, USA)로부터 구입하여 2 mg/ml로 만들 어 시험봉독과 동일한 필터를 사용하여 여과하였다. 분석기기는 PDA(photo diode array) 검출기가 장착된 Acquity UPLC I- Class(Waters, MA, USA)를 사용하여, Table I과 같은 컬럼 및 분석 조건으로 220 nm의 검출파장에서 분석하였다.¹⁸⁾정제봉독 내 멜리틴, 아파민 그리고 포스포리파아제 A₂의 함량은 각각의 표준품 수용액 시료에 나타나는 피크와 비교하여 63.9%, 2.3%

그리고 10.9%로 확인되었다.

실험균주 및 배양조건

본 실험에 사용한 H. pylori(ATCC 43526)균주는 한국미생물

보존센터(대전, 한국)로부터 구입하여 10% sheep blood(MB cell, CA, USA)가 포함된 BHI(brain heart infusion, BD, NY, USA) 배지에 접종 후 10% CO₂가 유지되는 배양기에서 37^oC로 배양 하여 실험에 사용하였다.

항균활성 측정

H. pylori에 대한 정제봉독의 항균활성은 평판배지확산법을 이 용하여 측정하였다. H. pylori를 평판배지에 도말 접종한 다음 정 제봉독이 집적된 직경 8 mm의 paper disk(Advantec, Japan)를 평판배지에 올린 후 48시간 배양하면서 생성된 투명한 지지환의 크기를 측정하였다.

최소성장억제농도(Minimun Inhibitory Concentration, MIC) 측정

액체배지 희석법을 사용하여 H. pylori에 대한 최소성장억제농 도를 구하였다. 정제봉독은 멸균 증류수로 희석한 후 무균 여과 하여 액체배지희석법에 준하여 단계적으로 희석하였다.¹⁹⁾ H.

pylori를 액체배지에서 전 배양한 후 접종 균의 2 × 10⁶ CFU/well 이 되도록 조절하여 봉독 시료와 함께 18시간 동안 10% CO₂배 양기에서 37^oC로 배양한 후, 육안 및 현미경으로 균의 성장을 관 찰하였고, 흡수파장 540 nm에서 흡광도(Molecular device spectramax M2e, CA, USA)를 측정하여 순수배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 최소억제농도로 결정하였다.²⁰⁾

최소살균농도(Minimum Bactericidal Concentration, MBC) 정제봉독은 각각의 시험균주에서 사용하는 액체배지로 희석한 후 액체배지희석법에¹⁹⁾따라 단계적으로 희석 한 후 2 × 10⁶ CFU/

well이 되도록 조절한 각각의 균주에 접종하여 24시간 동안 10%

Fig. 1 − Ultra performance liquid chromatography spectrum of the PBV.

Table I − UPLC conditions for melittin, apamin and phospholipase A2 analysis in purified bee vemon.

Items Conditions

Column Halo ES-C18(2.1 × 100 mm, 2.7

^m, Advanced materials technology, USA)

Flow rate 0.8 mL/min

Column temperature 50

C Injection volume 2 µl

Wavelength 220 nm

Mobile phase

Time (min)

20 mM TFA

/MeCN(%)

20 mM TFA/

H

O(%)

0 10 90

3 31 69

5 40 60

10 45 55

*

TFA: trifluoroacetic acid

CO₂배양기에서 37^oC로 배양하였다. 각각의 배양액 100 μl를 새 로운 배지에 접종하여 24시간 동안 배양한 다음 흡광도(540 nm) 를 측정하여 증식이 일어나지 않은 농도를 최소살균농도로 나타 내었다.²⁰⁾

생육저해 효과(Time-kill assay)

시험균주에 대한 정제봉독의 살균력 지속시간을 측정하기 위 하여 1 × 10⁸ CFU/ml 조절한 균주에 각각 MIC, 2× MIC, 그리 고 10× MIC값 농도의 정제봉독과 함께 10% CO₂배양기에서 37^oC로 배양하였다. 배양 후 2시간 간격으로 0.5 ml을 취하여 4.5 ml의 새로운 액체배지와 함께 10% CO₂배양기에서 37^oC에 서 배양하였다. 각각 24시간 배양 후 평판배지에 접종하여 균수 를 측정하였다.²¹⁾

봉독에 의한 H. pylori의 형태 변화 관찰

정제봉독에 의한 H. pylori 균체의 형태적 변화를 주사전자현 미경(emission-scanning electron microscope, SEM, S-2460N, Hitachi, Japan)로 관찰하였다. 주사전자현미경에 사용한 시료는 평판배지확산법에서 정제봉독에 의한 저지환이 선명하게 발생한 H. pylori를 사용하였다.

실험결과 및 고찰

정제봉독의 H. pylori 대한 항균력

H. pylori에 대한 정제봉독의 항균활성을 Fig. 2와 Table II에 나타내었다. 정제봉독은 매우 낮은 농도에서도 저지환을 나타냈 으며, 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 것을 알 수 있었다.

정제봉독 10, 1, 0.1 그리고 0.01 μg/disk의 농도에서 저지환이 각 각 13.5, 10.5, 9.0 그리고 8.3 mm의 농도의존적인 항균효과를 보 였다(Fig. 2). H. pylori에 대한 정제봉독의 최소성장억제농도(MIC) 는 0.13±0.036 μg/ml, 최소살균농도(MBC)는 0.26±0.042 μg/ml 이였으며, 양성 대조군으로 사용한 amoxycillin과는 항균력에 있 어 유의한 차이(MIC α=0.05, p 값=0.203)를 보이지 않았다. 따 라서 정제봉독은 천연항생제로써 가능성이 높은 것으로 확인되 었다(Table II).

H. pylori 생육저해 효과(time kill assay)

1× MIC(0.13 μg/ml), 2× MIC(0.26 μg/ml) 그리고 10× MIC (1.3μg/ml)의 봉독을 24시간동안 배양하면서 0, 1, 4, 18, 24시 간에 봉독이 H. pylori의 생장에 미치는 영향을 시험한 결과 모 든 농도에서 균의 생장이 저해되는 것으로 확인되었다(Fig. 3).

그러나 10× MIC 농도인 1.3 µg/ml로 처리한 경우에서만 4시간 배양으로도 H. pylori의 생장이 유의적으로 저해되는 효과를 확 인 할 수 있었다(p<0.05). 봉독을 처리하지 않은 대조구에서는 4시간 이후 균의 생장이 급격히 증가하는 것으로 확인되었으며, 봉독을 처리한 시험구에서는 4시간 이후 H. pylori의 생장이 효 과적으로 생육이 현저히 저해되는 것으로 볼 수 있었다.

정제봉독에 의한 H. pylori 형태적 변화

주사전자현미경의 시료로는 정제봉독 처리에 의한 H. pylori의 형태 변화는 Fig. 2의 정제봉독 1 μg/disk를 처리한 저지환 경계

Fig. 2 − Inhibitory effect of PBV on the growth of H. pylori. The disks were immersed in the purified bee venom at concentrations of (a) 10 µg/disc, (b) 1 µg/disc, (c) 0.1 µg/disc, and (d) 0.01 µg/disc.

Table II − The MIC and MBC values (µg/ml) of purified bee venom against H. pylori.

MIC MBC

Purified bee venom 0.13±0.036

0.26±0.042

Amoxycillin 0.10±0.037 0.20±0.037

* MIC p value = 0.203 ** MBC, p value = 0.053

Fig. 3 − Bactericidal activity of PBV against H. pylori. *p<0.05,

**<0.01, significant compared with the control.

를 사용하였다. 그 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같이 저지환과 경 계선을 기점으로 H. pylori는 증식이 정상적으로 이루어진 반면 봉독 처리 면에 가까워질수록 H. pylori 증식이 억제되었던 것으 로 관찰되었다. 또한 봉독에 의해 H. pylori가 증식이 억제되는 동시에 사멸을 유도하는 것으로 사료되었다. 5,000배와 10,000 배로 확대하여 H. pylori의 형태를 관찰한 결과 정제봉독의 영향 을 받지 않은 균체의 표면은 깨끗하고 완전한 모양의 형태를 갖 고 증식하였다(Fig. 5A, B). 그러나 정제봉독을 처리한 H. pylori 는 균체가 허물어져 형태를 알 수 없이 뭉그러져 있었으며 간혹 보이는 균체도 정상적인 형태가 아닌 팽창되고 짧아져 온전한 형 태를 갖고 있지 않았다(Fig. 5C, D). 이들 결과로부터 정제봉독 은 H. pylori의 세포벽 및 세포막의 기능을 약화시키거나 파괴하 여 균체 성분을 노출시킴으로써 균의 성장을 저해하고 사멸시키 는 것으로 사료되었다.

최근 임상에서 항생제 내성 세균의 증가와 화학 약제에 대한 환자의 부적응 등으로 H. pylori 균 치료에 어려움을 겪고 있어 새로운 치료법이 절실히 요구되고 있다. 이러한 대안으로 천연 물로부터 항 H. pylori의 효과를 갖는 물질을 개발하고자 하는 연 구가 활발히 이루어지고 있다. H. pylori 감염에 의하여 유발되는

위염은 일반적으로 선조직의 염증으로 점막의 염증 중 가장 중 요한 변화로 알려져 있으나, 실질적으로 선조직 뿐만 아니라 점 막하층, 근층, 장막에까지 염증이 미치고 있는 것을 포괄적으로 위염이라고 한다.^22,23)만성 위염에 대한 최근 연구에서 종양억제 유전자의 촉진자 메틸화에 대한 다양한 보고가 이루어지고 있으 며, 이러한 종양억제 유전자 촉진자의 메틸화는 최근 주요 발암 기전으로 대두되고 있는 실정이다.²³⁾

본 연구에서 사용한 정제봉독은 H. pylori 항균효과 뿐만 아니 라 염증 억제에도 효과가 우수한 것으로 알려져 관절염을 비롯 하여 여드름, 유방염 치료에 사용되고 있다. 따라서 정제봉독은 H. pylori의 증식과 사멸을 유도하고 H. pylori에 기인한 위염 및 위궤양 등의 치료제로서 개발 가능이 충분할 것으로 보여진다.

결 론

위궤양 및 위암 등 위 질환의 원인균으로 알려진 H. pylori에 대한 정제봉독의 항균효과를 알아보고자 하였다. H. pylori에 대 한 정제봉독의 최소성장억제농도(MIC), 최소살균농도(MBC) 그 리고 생육저해효과(Time-kill assay)를 시험하였다. 그 결과 MIC 값은 0.13±0.036 μg/ml, MBC 값은 0.26±0.042 μg/ml로 양성대 조구로 사용한 Amoxycillin과는 항균력에 있어 유의한 차이(MIC α=0.05, p 값=0.203)를 보이지 않았다. 봉독을 처리한 시험구에 서는 4시간 이후 H. pylori 균의 생장이 효과적으로 생육이 현저 히 저해되는 것으로 볼 수 있었다. 또한 정제봉독 처리에 의한 H. pylori의 형태변화를 조사하기 위하여 주사전자현미경으로 균 의 형태를 관찰하였다. 주사전자현미경 관찰 시 대조구는 균체 표면이 깨끗하고 완전한 간선의 모양을 갖고 있는 반면 정제봉

Fig. 4 − The small picture is shown the inhibition zone of H. pylori

treated with bee venom concentration of 1 µg/disc. Scanning electron microscope analysis of the interface between the inhibition zone and H. pylori was analyzed that H. pylori was killed as shown in the figure. (magnification: ×80).

Fig. 5 − Field Emission-Scanning Electron Microscope of H. pylori

cells not-treated (A, B) and treated with purified bee

venom (C, D). (magnification: A, C ×5,000; B, D ×10,000).

독 처리구는 균체 표층 구조가 심하게 허물고 떨어져 나간 것을 볼 수 있었고 세포가 수축되었으며 잘려 나간 것으로 확인되었 다. 또한 세포벽과 세포막이 완전히 파괴되어 균체 내 성분이 모 두 유출되어 균 형태가 없어져 버린 것도 관찰되었다. 따라서 정 제봉독은 H. pylori의 세포벽과 세포막을 파괴함으로서 성장을 억제하고 사멸을 유도하는 것으로 확인되었다.

감사의 말씀

본 연구는 농촌진흥청 차세대바이오그린 21 사업(과제번호:

PJ01221902)의 지원에 의해 이루어진 것입니다

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