Inhibition of Platelet Activation by Marine Sterols from Octocorals

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약학회지 제41권 제 5 호 547^553(1997) Yakhak Hoeji Vol. 41. No. 5

팔방산호층류에서 분리한 해양 스테롤 화합물의 혈소관 응집 억제작용

박영현* • 장성근* • 서영완** • 신종헌**

순천향대학교식품영양학과. ♦화학과, •• 한국해양연구소 (Received July 21. 1997)

Inhibition of Platelet Activation by Marine Sterols from Octocorals

Young-Hyun Park^, Sung-Keun Chang*, Youngwan Seo**

and Jongheon Shin**

D ep a rtm en t o f F ood Science a n d N u tritio n , ^ D epartm ent o f C h em istry, Soon ch un hyang U n iversity, A sa n 336-745, K orea

**Korea Ocean Research & D evelopm en t In stitu te, A n sa n 425-600, K orea

Abstract—— The purpose of this investigation was to determine the inhibition on Na*. lC-AT?ase, cyclic AMP phosphodiesterase and platelet activation by marine sterols isolated from octocorals. Three marine polyhydroxysterols. 7a. 8a-epoxy-3p, 5a. 6a-trihydroxycholestane (1). 24-methyI-7oc, 8ot-epoxy-3p. 5a.

6a-trihydroxycholest-22-ene (2), and 7a. 8a-epoxy-3p. 5a, 6a-trihydroxycholesl-22-ene (3). were iso

lated from the Gorgonian Acabaria undulata. Five marine sterols (compound 4, 5, 6,7, 8) were isolated from the soft coral Alq/onium gracillimum. Three marine polyhydroxysterols (1, 2, 3) and pregna-1, 20-diene-3- one (8) exhibit a potent inhibitory effect on rabbit platelet aggregation induced by collagen and thrombin.

Those polyhydroxysterols also exhibit a potent inhibitory effect on cyclic AMP phosphodiesterase. Com

pound 6 with an unusual cyclic enolether exhibit a inhibitory effect on Na수. K"^-ATPase.

Keywords □ Marine sterols. Platelet aggregation. Na*. fC-ATPase, cyclic AMP phosphodiesterase.

해양생물은육상생물과비교하면염농도가높은폐쇄 된환경에 살며수심에 외해높은압력과온도 변화가 비교적적고. 체표면의대부분이직접해수와접하고있 는환경으로인하여 해양생물의 대사계또는생체방어 계에서생산하는2차대사물질은득톡한화학구조로해 양천연물화학분야에서연구대상이되고있다."^^*

해양2차대사물질이 세포막수용체, 이온 channel, 세포내기능조절단백질에특이적인 작용을갖는생러활 성이발현되어 세포내정보전달기능을해명하는데크 게공헌하고있다. 예틀둘면, 설사형조개득외원인생물 Dinophysis sp.에서분리한 okadaic acid는평활근세포

* 본 논문에 관한 문의는 이 저자에게로

{전화) 0418-530-1259 ( 팩스) 0418-530-1264

외탈인산화효소를억제하여평활근수측제어계의 해석

을보다명확하게 나타내며 ciguatera 식중독외 원

인생물인 와편모조 Gambierdiscus toxicus에서 분리한 maitotoxin 또는 okadaic acid는세포막 chan- nel에특이적인작용으로세포외 Ca""" 유입을증가시켜 홍분성 또는비홍분성 세포에 수측및응집작용을나타 내고'^'®, 카리브산멍게 Eudistoma ofoaceMm에서 분러

한 eudistomin D 유도체는세포내 유리촉진작용

이 caffeine의1 0 0 0배로작용하여 caffeine 생리기능해 석에유용한생화학및약리학적도구(tod)로인식되고 있다.9■»> 현재2천종류이상이분리된해양 sterol은세 포막인지질의구성성분으로막유동성을유지하는역할

을하지만 생러적 기능은잘알려져 있지않다.^> 최근

혈소판세포의 생리작용에서세포막구성성분이세포내 547

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박 영 현 • 장성근■서 영 완 • 신중헌

정보전달에중요한역할을한다고한다,^®

그래서, 괄방산호층류에서 분리한 새로운 해양

sterol의생리적 기능을보고자, 버홍분성 세포인혈소

관 작용과 세포내 C a ^ 또는 cyclicAMP에 관련된 Na"\ iC-ATPase과 cyclicAMP phosphodiesterase 효소의활성작용을검토하였다. 한국연근해에서뿔산호 {AccAxaria unrfutoa)와 연산호04fcyo«ium gracillimum) 의괄방산호층류를채집하여, 분리. 정제한해양 sterol 화학구조에 대한혈소관 및 Na'^ iT-ATPase과 cy- clicAMP phosphodiesterase의생러활성 상관성을 검 토하여그걸과를보고하고자한다.

실험방법

십험재료 - 괄방산호류에 속하는 Acabaria undulata (Gorgonacea, 뽑산호)와 Alcyotiium gracillimum (Alcyonacea, 연산호) 2종을거문도에서 채집하였다. 뿔산호의 C H2CI2 추출물을 silica vaccum flash chromatography에서 용매 (80—100% EtOAc in hexane)로 용출하였다. 이 분획을 다시 Sephadex LH-20 colum n chromatography에서용매 (C H2C V acetone/EtOH = 2：3：0.05)로 용출한 분획을 최종적 으로 semi-prep Cie 역상 H P L C (Y M C O D S column, 1 cm x 25 cm, 60% M eO H in C H3C N))로 정제하여 polyhydroxysteroKl, 2, 3)을 분리하였다 (Fig. 1).*'* 연산호의 M eO H과 C H2CI2혼합용매추출 물을 n-B uO H로 용매분획하고, n-BuO H 분획물을 silica vaccum flash chromatography에서 용매 (10-20% EtOAc in hexane)로용출한분획을최종 적으로 silica 또는 O D S colum n을이용한 H P L C로 정제하여 s te ro lK 5, 6, 7, 8)을분리하였다(Fig. 2).'®

각시료는용매 (M eOH 또는 D M SO ) 에녹여최중농도

가 K U ig/m；되도록 조절하였고, 용매의 최중농도는

0.1%로조절하였다.

토꺼 washed platelet 활성 측정-토끼 혈액을 citrate-dextrose 용액(혈액량의 l / 6：6 5 m M citric acid, 85 m M trisodium citrate, 2% dextrose, pH 4.5)에채혈한후, 250xg로 10분간 원심분리하였다. 상등액 (platelet-rich plasm a)을 분리한 후, 다시 650Xg로 1 0분간 원심분리하였다. 침전물 (platelet- rich pellet)을 Tyrode-HEPES(pH 6.35)용액으로 두번 세척한후, 마지막에 Tyrode-HEPES(pH 7.35) 용액으로혈소관수가 5x10® cells/m/ 되도록회석하였 다. 모든 조작은 실온에서 실시하였다. Tyrode- H E P E S용액의 조성은 138.3 m M NaCl, 2.68 m M KCl, 1.048 m M MgCU 6H2O, 4.0 m M N aH C O j, 10 m M H E P E S, 0.1% dextrose, 0.35% album in 등이 다. 혈소판형태번형과응집작용은광투과도변화를이 용한흡광도측정장처 (Whole-Blood Aggregometer, Chrono-log Co.)를 사용하였다.*" 혈소판 부유액 (platelet-rich plasm a)을 250 |x/ 취하여 1200 rpm에 서 교반하면서 3TC에서 3분간 incubation 시킨 후 CaC l2 1 m M을가하였다. 다시 3분후에시료 2.5 HZ를 가하고 3분후혈소관 활성화물질로 자극하여 응집을 유도하였으며, 5분간측정한후. 최대응집점을잠아억 제되는정도를 계산하였다. 혈소판활성화물질은 collagend.O Ug/m/), throm bin(0.1 u n its/m/)을 대조 군(A)으로사용하였으며, 억제율(%)은다옴의식과같 이구했다.

Inhibition % ： A

A ： control aggregation % B ： aggregation %

3 Fig. 1 — Chemical structures of marine polyhydroxy-

sterols isolated from the Gorgonian Acabaria un - dulata.

Na*, iC-ATPase와 cyclicAMP phosphodiesterase활 성측정 -Na"^, K""-ATPase (Porcine Cerebral Cor

tex, Sigma) 는 최중농도가 0.02 u n its/m；로 하여, 130 m M NaCl, 20 m M KCl, 4 m M MgClj, 50 m M Tris-HCl 완층용액(pH 7.4) 445 n/를 넣어 5분간 37°C에서 incubation하였다. 5분후에시료 5 나;를넣 고. 다시 5분후에 2 m M ATP 50 n/를넣어 15분간반 응한후 5% trichloroacetic acid 500 나/로반응을정 지시겼다. 그러고. cyclic A M P phosphodiesterase

Pharm. Soc. Korea

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괄방산호층류에서 분리한 해양 스테롤 화합물의 혈소관 응집 억제작용

Fig. 2 — Chemical structures of marine sterols isolated from the soft Coral Alcyonium gracillimum.

S ： sam ple의흡광도 (Bovine Heart, Sigm a)는최증농도가 0.015 u nits/

m/로 하여 . 0.7 units/m / 5 -nucleotidase(Snake Venom. Sigm a), 2 m M M gC ^., 40 m M Tris-HCl 완층용액(pH 7.4) 89(Hi/를넣어 5분간 3TX]에서 in- cubation하였다. 5분 후에 시료 10M7를 넣고, 다시 5분후에 2 m M cyclicAMP 100 ^i/를넣어 20분간반 응한후 5% trichloroacetic acid 100 |i/로 반응을정 지시겼다. 정지된 각 효소반응액의 인산은 Martin- Doty법에 따라 72 0nm에서 흡광도를 측정하였다.""' 각효소활성의 inhibition %는다옴의 식과같이구했 다. Na\ I T이 없는 N a". iT-ATPase완충용액과 5분간열탕한 cyclicAMP phosphodiesterase를각각 back ground로하였다.

Inhibition%=. C -S C-B G ^{1 0 0}

C ： control 흡광도 BG ■ back ground외흡광도

결과 및 고찰

괄방산호류는강장동물로미소한유기물을 여과하여 영양분을섬취하는고착생물로태평양산호초해역에서 널리분포발달되어 있다. 한국연근해에서 채집한 caharia wnrfu/flfa는 해앙류(Gorgonacea. 뿔산호)로. Alcyonium gracillimum는 바다맨드라미류(Alcyonacea, 연산호)로분류하며모두괄방산호류에속한다/엇지금까 지해양생물에서 분리된2차대사물질들은 대부분강장 동물에서유래되고. 육상생물과다른특이한화학구조를 갖는 terpene과 ster이이 많다.^' Acabaria undulata (Gorgonacea, 뽑산호류)에서 3개의 polyhydroxy^

steroid, 2, 3)을분리하였다(Fig. 1). 화학구조는 7oc.

8ot-epoxy-3P, 5ct, 6a-trihydroxycholestane( 1). 24- meth-yl-7a, 8ot-epoxy-3P, 5a. 6oc-trihydroxycholest-2 2-ene(2) . 7a. 8ot-epoxy-3P，5ot, 6ot-trihy-

Vol. 41, No. 5, 1997

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66.5±6.6 61.1±3.5 23.8±3.5** 50.1±2.5**

50.2±3.r* 51.8±3.0**

43.1±2.0** 20.7+6.9**

66.7±4.7 51.0±4.1 56.8±2.8 48.5±6.2 67.4±1.3 72.3±2.9 64.5±6.7 53.8±49 53.9±2.4* 40.1±3.0**

11.9±10.6** 53.9±9.6*

36.5±7.9** 57.5±8.2*

Washed rabbit platelets were preincubated with DMSO(0.1%, control) or sample(M-^m/) at 37°C for 3 min before the addition of collagend.O M-g/m/) or thrombin(0.1 unit/m/). Percent aggregations are presented as mean±S.E.(n = 3).

* p<0.05, ** p<0.01 as compared with the respective control.

포내 전달물질의 번화가혈소판기능에중요한역활을 한다고 한다. 혈소판내 cyclicAMP phosphodieste

rase III형은 adenylcyclase에 의해 증가된 cy-

clicAMP를분해하여지혈및혈전외혈소판기능을조

절한다고한다,^*

헤양 sterol에 대한 혈소판 작용을 보면. polyhy- droxysterold, 2, 3) 과 pregna-1, 20-diene-3-one (8) 화학구조는 collagen 또는 throm bin외응집작용 을 억제하였지만, cyclic enolether기 (6) 화학구조는 반대로약간증가하였다(Table I). 해양 ster이외화학 구조에 따른 활성상관성은 collagen외 응집작용을 6 < 4 < 7 < 5 < 8 < 3 < 2 < 1 순서로 억제하였고, throm- b in의응집작용을 6 < 4으7으S으2< 8< 1<3 순서로억 제하였다. collagen에대한 응집 억제작용은 7a, 8a- epoxy-3(3, 5a. 6a-trihydroxycholestane(l)외 IC ^ 값이 6.7 h M이고. throm bin에대한응집 억제작용은 7a, 8<x-epoxy-3P, 5oc, 6a-trihydroxy-cholest- 22- ene(3)외 IC * 값이 15.9 나M이다(Fig. 3).

해양 sterol에대한 Na\ iC-ATPase활성억제작용 은 cyclic enolether기 (6) 화학구조에서약간증가하였 지만. 다른화학구조는유외성이 없ckTable II), Cy

clic enolether환(6)은 세포내 C a ^측적으로 인한 ouabain 강심작용®•과활성상관성을갖는 0 1 7 위처

에불포화 lactone환과비숫한 화학구조를 갖고있어

반대로응집작용이약간증가하였다고사료된다.

J. Pharm. Soc. Korea Table I —— Effects of marine sterols on the platelet aggre- _________gation induced by collagen and thrombin

Sample Concentration Aggregation {%) {\ig/ml) Collagen Thrombin droxycholest-22-ene(3) 로 밝혀졌다. ^ Alcyonium

gracillimum(Alcy-onacea, 연산호류)에서 분리한 해양 sterc)l 은 furospirostan 계열에 spiroketal71(4), hemiketal기 (5), cyclic enolether기 (6)를갖는화학구 조와 diketone기외 C^/ steroid(T), p r^andieno n e 계열 의 pr힘na-1. 2 0~diene~3~one(8)외특이한화학구조를갖 고있다(Fig. 2).'®'

해양 sterol은현재2천증류이상이 분러되었고. 그

구조의다양성때문에화학적분류도구 (chemotaxono-

mic tool)로이용되고있다. " " ' " " Goad씨^^는해앙무 척추동물에존재하는다양한 sterol의생함성대사경로 로 4가지가능성을제시하고있다. 그가능성은새로운 생함성 경로. 공생미생물(미세조류. 세균. 곰광이등)로 인한생합성경로. 섬취한 sterol의대사(식이 sterol)경

로그리고식이 sterol의이화학적변화등에 의해서존

재한다고 주장하였다. 세포막의 구성성분인 해양 ster이은 cholester이보다낮은용해도로인하여세포막 모델의 막유동성에 영향을주는역할을하지만생리적 기능은잘알려져 있지 않다. 최근세포막 구성성분이 세포내에서 및 cyclicAMP외정보전달에 중요한

역할을 한다고 한다. 해양 2차 대사물질 중에 mai-

totoxin은세포막 channel에특이적인작용으로.

eudistomin D 유도체는세포내 유리촉진작용으

로. okadaic acid는평활근세포내탈인산화효소의 억 제작용으로세포내정보전달기능을해명하는 데크게 공헌하고있다." ""

혈소관은지혈작용에 필수세포이지만내피세포외 기 능장애로인한혈관내혈전을형성하여 뇌경색또는심 근경색의 원인세포이다. 그래서. 혈전증 예방및재발 방지를 위하여 혈소관 기능을제어하는 생리활성물질 연구가활발하다. 그러나. 해양생리활성물질의 혈소관 기능에관한연구는홍분성세포(심근. 평활근)와비교 하면 미약하다고 하겠다. 비홍분성 세포인 혈소관은 collagen 또는 throm bin에외해활성화되어 . 초기반응 으로 원관형에서 구형으로의 형태번형에 이어 응집반 웅을일어난다. 이러한생러작용에 세포내 전달물질로 Ca"-' 또는 cyclicAMP가중심적인역활을한다.2^^' 세 포내 은 calmodulin과 걸합하여 myosin ligh-

chain kinase을인산화하여 혈소관외 방출과응집작

용이 일어난다. 세포내 cyclicAMP는 cyclicAMP-dependent protein kinase을활성화하여 세포내 Ca오'"

의농도를감소시켜응집반응을억제한다. 이와같이세

박 영 현 • 장성근• 서 영 완 • 신종헌

10 10 10 10 10 10 10 10

5

10

2'^123456700•2

0^ m , ^

C<C§

(5)

BG Control

1 2

3 4 5

6

7

8

Papaverine

10 10 10 1 0 10 10 10 10 10

0.0 2±0 .0 1

0.33+0.04 0.24±0.03*

0.25±0.02**

0.23±0.04**

0.31+0.05 0.26+0.04 0.28±0.07 0.29±0.04 0.28±0.08 0.24±0.06**

BG Control

1 0 1 0 1 0 10 1 0 1 0 1 0 10 10

0.09±0.04 0.45±0.08 0.41±0.03 0.44±0.02 0.43+0.04 0.43±0.05 0.40±0.06 0.36 + 0.04*

0.49±0.07 0.51±0.06 0.26±0.09*"

ICw IS the concentration of sample showing 50% in

hibition of enzyme activity estimated from the least squares regression line of the plots of the logarithm of the concentration versus remaining activity.

Absorbances are presented as mean±S. E. (n=3)

* p<0.05, ** p<0.01 as compared with the respective control.

있다고사료된다. 그러나, 해앙 polyhydroxyste-rol의 혈소관기능이 cyclicAMP phosphodiesterase III형으 로인한세포내 cyclicAMP 증가또는세포내 C a ^과의 관련성에 대하여앞으로많은연구가필요하다.

결 론

한국 연근해에서 채집한 괄방산호류 Acabaria undulata(Gorgonacea, 뿔산호)에서 분러.정제한 3개 의 polyhydroxysterols. a , 8a-epoxy-3P, 5a. 6ot- trihydroxycholestane (1). 24-methyl-7a, 8a- Absorbances are presented as mean±S.E. (n=3).

* p<0.05. ** p<0.01 as compared with the respective con

trol.

Table 3 — Inhibitory effects of marine sterols on cy

clicAMP phosphodiesterase

^ , Concentration , , Inhibition ICso Sample (^xg/mI) Absorbance (%) („m) Table II — Inhibitory effects of marine sterols on Na __________ K 수-ATPase_______________________________

^ , Concentration ^ , Inhibition Sample (^ g /m l) Absorbance (%)

1 0 1 0 0

Concentration (/ig/mi)

Fig. 3 — Effects of three polyhydroxysterols isolated

from the Gorgonian on the aggregation of washed rabbit platelets induced by collagen (A) and thrombin (B). Platelets were preincubated with various concentrations of polyhydroxy

sterols for 3 min before the addition of collagen (1.0 M-g/m/) and thrombin (0.1 unit/m/). Per

cent inhibitions are presented as mean±S.E.

(n = 3). 7a. 8a-epoxy-3p, 5a. 6a-trihydroxycholestane (1). 24-methyl-7ct, 8ot-epoxy-3p.

5a. 6a-trihydroxycholest-22-^ne (2), 7a, 8(x- epoxy-3p. 5a. 6a-trihydroxycholest-22-ene (3).

해앙 sterol에 대한 cyclicAMP phosphodiester- ase활성은 polyhydroxysterol 화학구조에서 3 < 2 < 1 순서로 억제작용을 나타내었다(Table III). 7a, 8a- epoxy-3P，5a, 6a-trihydroxycholest-2 2-ene(3)은 ICso 값이 44 나M로 papaverine(IC5o=69 |iM)보다활 성억제작용이 강하다고하겠다. Polyhydroxyster이의 혈소관응집억제작용은세포내 cyclicAMP와관련성이

Vol. 4 1 No. 5, 1997

괄방산호층류에서 분리한 해양 스테롤 화합물의 혈소관 응집 억제작용 551

94.

47.

44.

69.

8184-22695

22311110^ O 65 50 06

C P 27

1 2

1 1rD

00

Cor

B

100

80

60

40

2 0 uoluqlMCI %

(6)

박영현• 장성근• 서 영 완 • 신종헌

epoxy-3P， 5a. 6cx-trihydroxycholest-22-ene(2).

l a , 8a-epoxy-3p. 5a. 6ot-trihydroxycholest-22- ene(3)과 AJcyonium gracillimum (Alcyonacea. 연산 호)에서 분러.정제한 furospirostan 계열에 spiroke- ta l기 (4). hem iketal기 (5), cyclic enolether기 (6)를 갖는화학구조와 diketone기외 C27 steroid (7), preg- nandienone 계열의 pregna- 1. 20-diene-3-one(8) 에대한혈소관작용을비교검색하여다옴과같은걸론 을얻었다.

1) 해양 polyhydroxysteroKl, 2, 3)과 pregna-1.

20-diene-3-one (8) 화학구조둘은 collagen 또는

throm bin의응집작용을농도의존적으로억제하였다.

2) 해양 polyhydroxysteroUl, 2, 3)은 cyclicAMP phosphodiesterase 활성억제작용을나타내었다.

3) Cyclic e n o leth e r기 (6) 화학구조는 throm bin의 응집작용을 약간 증가시켰다. Polyhydroxyster이외 혈소관 응집 억제작용은 세포내 cyclicAMP와관련성 이있다고사료된다.

감사의 말씀

본 논문은 1995년도 한국과학재단 륙정기초연구비

(95-0403-21-01-3)와 1997년도 교육부 기초과학연구 소 학술연구조성비 (BSRI-97-3447)에 외하여 연구되 었으며이에감사드럽니다.

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