Effects of Carbamoyl Phosphate Synthetase I against Cell Growth and Production of Recombinant Erythropoietin in Urea Cycle Enzyme Expressing CHO Cell Line

될후율학

Carbamoyl Phosphate Synthetase I

CHO

세포 주의 세포 성장과 재조합

Erythropoietin

조 수 미 • 김 나 영 * • 김 형 진 • 김 홍 진 * 중앙대학교 약학대학

•■현주소 : 경기도 평택시 모곡동 439번지 (주) 아주약품 (Received April 3, 2007; Revised April 19, 2007)

Effects of Carbamoyl Phosphate Synthetase I against Cell Growth and Production of Recombinant Ei^hropoietin in Urea Cycle Enzyme Expressing CHO Cell Line

Su-Mi Cho, Na Young Kim*, Hyoung Jin Kim and Hong-Jin Kim*

College of Pharmacy, Chung-Ang University, 221 Huksuck-dong, Dongjak-gu, Seoul 156-756, Korea

^Present address : Asia pharmaceuticals, 439 Mogok-dong, Pyeongtaek-si, Gyeonggi-do, Korea

Abstract — In the previous reports, we developed the COS by introducing genes for the first and second urea cycle enzymes, carbamoyl phosphate synthetase I (CPS I) and ornithine transcarbamoylase (OTC) into the IBE cell lines pro­

ducing erythropoietin (EPO). The COS have been found out to have 15—20% higher cell growth rate and produce 2-times more EPO than the parental cell line, IBE. To investigate the role of CPS I in COS cell line for the cell growth and amount of EPO, we knock-downed CPS I gene expression via siRNA treatment. Expression level of EPO in cell lysate of C05 was 3—5 fold higher than that of IBE. After siRNA treatment, the cell growth of C05 was decreased 8—21% and the EPO pro­

ductivity in the cell lysate was significantly decreased. Howerver, these changes of the cell growth and EPO productivity were not observed in IBE. These results indicate that CPS I gene expression is important for the increased cell growth and EPO productivity of COS cell line.

Keywords □ erythropoietin, carbamoyl phosphate synthetase I, ornithine transcarbamoylase

Erythropoietin(EPO)는당단백질 (Glycoprotein) 호르몬으로 항정상태 (Steady-state) 동안에적혈구세포(Erythrocyte)의생산 을조절하고과다출혈로인한적혈구세포의 회복을촉진하는 주요인자로치료목적의 재조합당단백질생산시장에큰버중 을차지하고있다.내인간의 erythropoietin은■ 165개의아미노산 으로구성되어었고당화된상태의분자평은 35-39 kDa 이다.4■판그

재조합당단백질의동물세포배양시, 아미노산은암모늄이 온과 carbon dioxide 등으로대사되며암모늄이온은단백질, 핵 산및지질의 생산에관여한다배지 내에일반적으로높은능 도의 glutamine(2~5 mM) 을포함허*게되는데, glutamine의화 학적분해와세포대사로인해암모늄이온이축적되고, 이로인 해세포성장의 저해, 단백질생산량감소및당쇄구조의번형

#본논문에 관한문의는 저자에게로 (전화) 02-820-5613 (팩스) 02-816-7338 (E-mail) [email protected]

을초래하게 된다.®이러한문제률개선할수었는생체내시 스템으로요소희로(Urea cycle)가있는데, 요소회로는아미노산 대사로생산되는암모니아의제거률가눙케한다. 요소회로에는 5가지효소가관여하는데, 첫번째효소인 carbamoyl phosphate synthetase I(CPS I)과 두 번째 효소인 ornithine txanscar- bamoylase(OTC)가미토콘드리아내에서제시되며, 나머지 3가지 i 소;인 argininosuccinate synthetase, argininosuccinate lyaseS}- arginase가세포내에관여한다.도®^

우리의 지난연구중 Park

et

발하였고그결과배지내암모늄이온의농도가 25-33% 감소

되고, 세포성장률이 15~30% 증가 되는것을확인 하였다.^^>

Kim 등의내연구에서는 EPO를발현하는 CHO 세포주(IBE)에 CPS I과 OTC 유견자룰형질전환시킨세포주(C05)를개발하 였고 C05가 IBE에비해세포성장률어 15-20% 증가되었고배

CPS I 이 세포 성장과 EPO 생산에 미치는 영향 215

지내 EPO 잉이 2배증가된다는것을확인하였다.효기그러나 CPS I과 OTC가세포성장률과 EPO 생산에직접적으로어떠한영향 을미처는지는확인되지 않았다.

특정 유전자의 기눙을 억제 할 수 있는 small interfering ribonucleic acid(siRNA)는이중가닥의 21—25 nucleotide 크기의

작은 RNA조각으로상보적인서열을갖는 mRNA에특이적으로

결합하여 단백질발현을억제하는것으로알려져 있다. ^ ^ 본 연구에서는 Park

et

et

세포성장률과세포내 EPO 발현의 번화률확인하였다.

실험 방법

세포 주

세포성장률과 EPO 생산률을확인하기 위해 IBE와 C05 세 포주는 Kim e； 의연구와같은방법으로준비되어졌다. IBE 세포 주는 /)//Fi?-defident CHO 세포 주에 human EPO와

DHFR

methotrexete (MTX)로선벌하였다. C05 세포주는 IBE세포주 에 CPS I과 OTC 유전자를 형질전환시켰다.

IB E 와 C05 세포 내 EPO 발현 양 측정

60 mm에 1.5 X 10® cells/mi의 IBE와 C05를 5 m/씩 seeding 한후 minimum essential alpha medium(Gibco BRL, USA) 에 10% fetal bovine serum(Gibco BRL, USA),

1%

siRNA를 이용한 CPS I의 발현 억제

CPS I에대한 siRNA(CPSl-l)는 5'-CTCCAAGAGTCTGTT- CCACTA-3'을 target sequence로 하여 sense sequence 5- CCAAGAGUCUGUUCCACUA-3'와 antisense sequence 5'-

UAGUGGAACAGACUCUUGG-3'로제작되었고 대조군으로

gene silencing 효과가 없다고 알려져 있는 control siRNA가 sense sequence 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'와 antisense sequence 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'로 제작되었다 (Qiagen, USA).

COS 세포주에서 CPS I이세포성장과세포내 EPO에미처

는영향을확인하기 위해 대조군으로 IBE 세포주가사용되었

고 CPS1-1 을 transfection한군은배양배지만첨가한군(media), transfection reagent# 첨가한 군(reagent), control siRNA#

transfection한군(control)파비교하였다. IBE와 C05 세포주는 six-well plate에 2.5X10^ cells/well로 seeding한후 24시간 동 안배양하였고 hiperfect transfection reagent(Qiagen)를사용하 여 control siRNA와 CPS1-1 을 manuscript instruction에 따라 transfection하였다. 24, 48, 72시간 후의 세포수의 번화는 hemocytometer를사용하여 죽정하였고세포내 EPO 앙의 번 화는 48시간배양후아래 기술된 Western blotting 방법을통 해확인되었다.

Western blotting

Quick freezing 방법을 사용하여 cell을 lysis 하였고 total protein을 Bradford 법으로 정량하였다. 동일 양의 sample은 Laemmli해의 방법에 따라 12.5% sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel(SDS-PAGE)상에서 견개된 후 PVDF membrane 에 transfer 되었다. 0.5% skim milk와 0.1% tween 20 이함유된 20 mM Tris-buffei에서 16시간동안 blocking?}：후 EPO를확인하기 위해 1차항체로 anti-human EPO polyclonal rabbit IgG(R&D Systems, USA)를 사용하였고 2차 항체로 HRP-conjugated anti-rabbit IgG(R&D Systems)를사용■하였으며 ECL chemilumine-scence solution(Santa Cruz, USA)을: 기질로 효소반응을일으켜 X-ray 서 EPO를확언하였다. IBE 와 C05 내 EPO의앙은 Kim

et

실험 결과

IBE와 C05 세포 내 EPO 발현 양 버교

IBE와 C05 세포내 EPO 앙을 western blotting으로확인한 결과 Fig. 1의결과에서보는것처럼 IBE는 1일과 2일차에세포 내 EPO 양이가장많게나타났고 3일처부터그양이줄어드는 것이확인되었다. 4일차부터는 EPO가가지는 35 kDa의분자량 보다낮은분자량을나타내어 세포내에서붕괴되는것이 확인

9 10 11 12

Fig. 1 - Western blot analysis of EPO in IBE and C05 cell lysates.

Lane 1, 3, 5, 7, 9 and 11 are cell lysates of IBE at 1, 2, 3, 4, 5 and 6 days, respectively. Lane

2,

n

24 48

Time (hour)

72

I X

24 48

Time (hour) B

□ IBE (media) * 50 ^■ □ COS (media)

Q IBE (reagent) E

\a tzCOS (reagent)

□ IBE (control) 1 40 ^- □ COS (co ntro l)

■ IBE (C PSl-1) O ■ COS (C P S l-1)

216 조수미 • 김나영 • 김형진 • 김통진

되었고 5일과 6일차에는 30kDa 미만의분자량을나타내어세 포내 EPO가모두붕괴된것이확인되었다(Fig. 1). C05는 IBE 와마찬가지로 1일과 2일치세세포내 EPO 앙이가장많았으며 3일차부터즐어드는것이확인되었다(Fig. 1). Scion image틀통 한 densitometric assay 결과 C05 내 EPO 양은 IBE에비해 1 일차에 5배 2일과 3일차에는 3배가많옴이 확인되었고 IBE와 달리 5일과 6일차에도세포내에서 안정적으로 EPO가유지됨 을확인하였다(Fig. 1). 이결과로서 C05가 IBE보다 3~5배많

온세포내 EPO를가진다는것이확인되었고세포내 EPO를

더안정적으로유지할수있는조건을가짐이확인되었다.

C P S I의억제에 따른세포성장변화

C05의 CPS I 억제에따른세포성장의번화률확인하기 위해 media, reagent, 및 control 군과비교하였고이를대조군인 IBE 와비교하였다. Fig. 2에서보는것처럼 C05는 4씨간과 72시 간 배양 후 세포성장률이 IBE에 비해 40% 높게 나타났고 reagent와 control 처리군은 IBE와 C05에서 media 처리군에 비해세포성정어약 10% 감소하였다(Fig. 2). 이는 transfection reagent가가지는득성때문인것으로생각된다.노® IBE는 control 군과 CPS1-1 처리군이 비숫한세포성장률을보인반면 (Fig.

2A), C05의 CPS1-1 처리군은 contr이에비해 24시간배양후 8%, 48시간배양후 21%, 72시간배양후 10%의세포성장률 감소를보였다(Fig. 2B). 이는 IBE와달리 C05에 CPS1-1 이특 이적으로반응한다는것을의미하고 CPS I 억제에의해세포성 장률이감소한다는것을의미한다. 이결과로서 C05 세포의성

장률에 CPS I이중요한역할을한다는것이확인되었다.

C P S I의억제에 cc|론 세포내 E P O양의 변화

CPS I의억제에따른세포내 EPO 양의변화를확인하기위

1 2 3 4 5 6 7 8

헤

pwpp

Fig. 3 - Western blot analysis of EPO according to each treatment in IBE and COS cell lysates. IBE and COS cells were harvested at 48 hour post by each treatments. Lane 1, 2, 3 and 4 are cell lysates of IBE treating with media, transfection reagent, control siRNA and CPSl-1, respectively. Lane 5, 6, 7 and 8 are cell lysates of COS treating with media, transfection reagent, control siRNA and CPSl-1, respectively. CPSl-1 indicates siRNA against CPS I.

해 IBE와 C05에 media, reagent, control 및 CPSl-1 을처리하 였고 48시간후세포내 EPO 양을확인하였다. Fig. 3에서보는 것처럼 IBE에 media, reagent, control 및 CPSl-1 을처리한군 에서는 EPO 앙의변화가일어나지않았지만 C05의 CPS1-1 처 러군에서는 media, reagent 및 control 군에비해세포내 EPO 가감소하식 CPS I의발현억제가세포내 EPO 잉을감소시킨 다는것이 확인되었다(Fig. 3). 이결파로서 C05 내 CPS I이 EPO생산증7H1 매우중요한 소로작 용 한 것 이 확인되었다.

고 찰

우리는지난연구를통해요소희로의 첫번째두번째효소인 CPS I과 OTC를 CHO세포에형질전환시켰고그걸파세포성 장률이증가되고재조합 EPO의생심<>1 증가된다는걸파를얻었 다.iu 2) 그러나 EPO는배양배지내에서측정되었고세포내에 남바■었는 EPO 잉은측정되지 않았다.^® 또한각각의요소희로 유전자가세포성장과 EPO 발현에어떠?!: 영향을미치는지는밝

Fig. 2 - Viable cell numbers according to each treatment in IBE and COS cells. A: IBE, B: COS. Each treatment described in the materials and methods. Values are mean±SD of duplicate cultures.

0 1 30 I 20

z % 'i

c54321

I lu

l sis000-01

X I

SJeqiN

=

®u

sselA

CPS I 이 세포 성장과 EPO 생산에 미처는 영향 217

혀지지않았다. 따라서본연구에서는 IBE와 C05 세포내 EPO 양을 1일차부터 6일차까지측정하였고 siRNA를이용하여 C05

내요소회로유전자중 CPS I의발현을억제하여그에따른세

포성장률과세포내 EPO 잉=의변화룰분석하였다. IBE와 C05 세포내 EPO 양을분석한결과 C05가 IBE에비해 3~5배많 은 EPO가존재한다는결과률확인하였다(Fig. 1). 이는 Kim

et

a/. 미의연구에서배앙배지내존재하는 C05의 EPO 양이 IBE 보다 2배많게나타난결과보다더많은처이률보인다. 따라서 C05의세포내와배양배지내 EPO를고려한총 EPO 생산양

은 IBE와많은처의률보일것으로예상된다. 이러한결과로볼

때 C05는많은양의 EPO를생산할수있지만 EPO를배지내 로분비하는데는한계가있는것으로생각된다. C05 내 CPS I 를 CPS1-1로억제한결과세포성장률이 8-21%의감소를보 였다(Fig. 2). 이는 CPS I이 C05의성장률증가에 관여한다는

것을의미한다. 그러나 CPS I의억제에따른성장률의 감소가

IBE의성장률수준으로감소하지못한것은 OTC에대한억제

가이루어지지않았기 때문인것으로생각된다. CPS I 억제에

따른세포성장률의결과와달리, CPS I의발현억제시 C05 세 포내 EPO 앙은 IBE 와비숫한수준으로감소하여 세포성장 률파차별되는결과률보였다(Fig. 3). 이는 CPS I이 EPO 생산 증가에 매우중요한역할을한다는것을의미한다.

동물세포들이용한치료목적의당단백질생산은우수한생물 학적활성과생체내안정성을가지는당단백질의 생산을가능 케하지만생산효율과비용면에서많은단점을가지고었다. 이번연구틀통한 CHO 세포주에서 CPS I의역할에관한결과 는이러한동물세포발현시스템의단점을보완하는데유용하게 사용될수었을것으로예상된다. 앞으로의 연구에서는 C05 내 EPO가세포밖으로분비되는메커니즘과 OTC의 역할에관한 자세한연구가이루어져야할것이다.

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