Whitening Effect of Salicornia herbacea Ethanol Extract by Inhibition of Melanin Synthesis

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46(4) : 315∼ 320 (2015)

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함초 에탄올 추출물의 멜라닌 합성 억제를 통한 미백 효과

고은실·강제란·최미래·황승미·최경민·차정단* (재)진안홍삼연구소

Whitening Effect of Salicornia herbacea Ethanol Extract by Inhibition of Melanin Synthesis

Eun-Sil Ko, Jae-Ran Kang, Mi-Rae Choi, Seung-Mi Hwang, Kyung-Min Choi, and Jeong-Dan Cha* Institute of JinAn Red Ginseng, Jinan-Eup, Jinan-Gun, Chonllabuk-Do 567-801, Korea

Abstract − This study was carried out to investigate the effect of ethanolic extract Salicornia herbacea (SHEE) on melanogenesis and mechanism. The SHEE on α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) induces melanogenesis in B16F10 melanoma cells. The effect of SHEE remarkably decreased protein expression of tyrosinase and tyrosinase relate protein (TRP)- 2 increased extracellular signal related kinase (ERK) on α-MSH 100 nM induced melanogenesis on B16F10 melanoma cells at dose-dependent manner. It has been reported that the activation of ERK reduce melanin synthesis by down-regulating microphthalmia-associated transcription fator (MITF). These results sugggest that possibility of extracted korean medicinal herbs as a functional ingredient for whitening cosmetic formula.

Key words − Salicornia herbacea, Melanogenesis, Tyrosinase, MAPKs

사람의 피부색은 헤모글로빈, 카로틴, melanin에 의해 결 정되며, 이중 melanin의 영향이 가장 크다. Melanocyte에는 lysosomelike organlles 인 melanosome이 있는데 여기에는 melanin의 합성에 관여하는 몇 가지 효소들을 포함하고 있 다. 그 효소 중에 구리를 함유하고 있는 tyrosinase는 생체 내 tyrosinase는 생체 내 tyrosine을 DOPA로, 나아가 DOPA quinone 으로 산화되는 과정을 촉매하여 melanin 생합성에 관여 한다. 또한 갈색과 흑색의 색소를 만들어 내는 eumelanogenesis에는 적어도 두 가지 이상의 효소가 관여 하는데 그것은 TRP-1(DHICA oxidase)과 melanin 중간체인 DOPAchrome 으로부터 5, 6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid(DHICA)의 반응을 촉매하는 TRP-2(DOPA chrome tautomerase)이다.¹⁾

멜라닌 합성은 아미노산의 하나인 tyrosinase을 기질로 tyrosinase, tyrosinase related protein-1(TRP-1), tyrosinase related protein-2(TRP-2)에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)를 거쳐 DOPA quinone 으로 전환된 자동산화반응 과 효소반응으로 DOPA chrome 을 거쳐 흑갈색의 공동합 체인 멜라닌을 생성하게 된다.²⁾

또한, 멜라닌 합성의 조절인자로 잘 알려진 microphthalmia- associated transcription factor(MITF)는 helix-loop-helixleucine zipper 구조를 가진 transcription factor로서 멜라닌 합성을 통한 흑화 과정, 세포의 증식 및 생존을 조절함이 알려져 있 다. MITF는 tyrosinase 및 TRPs의 M-box sequences 에 결 합하여 멜라닌 합성에 관여하는 효소들의 발현을 조절하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에³⁾ 멜라닌 합성을 조절하는 skin-lightening agents를 개발하기 위한 주요 타깃으로 여겨 지고 있다 피부가 자외선 자극을 받으면 각질형성세포에서 endothelin-1(ET-1), 부실피질 자극 호르몬, 일산화질소(NO) 등이 분비되어 피부색소가 증가하게 된다. 피부 색소는 기 저층내 존재하는 멜라닌 세포가 만들어 내는 멜라닌의 함 량에 의해 결정되며⁴⁾이러한 멜라닌은 자연계에 널리 존재 하는 생체 고분자 물질로 자외선이나 자유 라디칼로부터 피 부가 손상되는 것을 방지하는 역할을 담당하고 있다.⁵⁾ 많은 사람들이 외부환경에 의해서 색소 침착, 멜라닌 과다 현상 을 걱정하고 있는데, 멜라닌 형성에 주요 효소를 억제하여 멜라닌 합성 저해를 위한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

현재 알려진 합성 미백원료들은 사용 중 분해나 착색, 이취 등으로 인해 불안정하여 안정성 문제 등이 대두되고 있다.

따라서 최근에는 세포 영향을 미치지 않으며 멜라닌 합성

*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-63-432-0942

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을 감소시키는 천연 소재에 대한 연구가 활발히 진행 중이 다.⁶⁾

함초(Salicornia herbacea)는 염전주변이나 갯벌에서 자라 는 염생식물로 명 아주과(Chenopdiaceae)에 속하며 마디가 퉁퉁하게 튀어나온 풀이라 하여 퉁퉁마디라고도 한다. 갯벌 식물인 함초는 다량의 염분을 체내에 축적하고 있을 뿐만 아니라 천연 미네랄이 풍부하고 필수지방산인 리놀렌산이 다량 함유하고 있으며과 필수 아미노산도 총 아미노산 함 량 대비 약 40% 를 함유한 것으로 알려져 있다.⁷⁾ 이 성분 중 발린, 류신 히스티딘등 다량 함유하는 식물로 식품소재 의 활용으로 많은 보고가 되어있다.⁸⁾그 외에 함초로부터 β- sitosterol, stigmasterol, uracil 및 isorhamnetin-3-O-β-D- glucopyranoside의 플라보노이드 성분이 분리 되었는데, 이 들이 항산화 효과가 있다고 보고되고 있다.⁹⁾

함초는 민간요법으로 많이 이용되었던 자원식물로서 암, 축농증, 관절염, 고혈압, 요통, 비만 천식 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 생리활성 기능이 기대되는 해양자원식 물 중 하나인 함초에 대한 연구가 많이 진행되고 있으며 최 근 quinone reductase 활성유도 효과에 대한 연구가 보고 되 었다.¹⁰⁾

천연물질을 이용하여 미백제 탐색이 활발히 진행 되고 있 으며 식물 추출물에서 보편적인 미백제로 사용되는 hydroquinone은 phenol성 화합물로서 산화, 환원 반응에 민

감한 구조적 특징으로 tyrosinase의 활성을 억제하고 melanocytes를 선택적으로 억제한다고 한다.¹¹⁾

본 연구에서는 함초를 새로운 미백소재로 이용하기 위해 B16F10 melanoma 세포에서의 멜라닌 합성 억제효과를 측 정하여 작용기전을 규명 하고자 멜라닌 합성 과정에 관여 하는 단백질의 발현을 확인하였다.

재료 및 방법

함초 탈염 및 추출 − 함초는 순천만에서 재배하는 유기농 함초 건초를 미가식품(2014년 3월)에 구입하여, 증류수로 탈 염과정을 거친 뒤 99% 에탄올(v/v)로 상등액을 분리 한 다 음 탈염과정을 3회 반복한 후, 이 침전물을 회수하여 회수 물의 10배의 70% 에탄올(v/v)로 환류 추출을 실시하였다.

이후 50^oC에서 감압 농축 후 -70^oC 초저온 냉동고에서 동 결 후 동결건조기로 건조한 분말 상태의 수율 30% 정도의 시료 50 g을 얻어 진안홍삼연구소 효능연구실 냉동실에 보 관 중이며 실험 전 10% DMSO에 녹여 실험에 사용하였다 (Fig. 1).

B16F10 세포배양 − B16F10 melanoma세포는 ATCC (American Type culture collection, Rockville, MD, U.S.A) 구입하여37^oC에서 5% Co₂배양기에서 RPMI-1640 media (Corning, USA)에 10% fetal bovine serum(Corning, USA),

Fig. 1. The procedure for extraction from Salicornia herbacea.

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1% penicillin 및 streptomycin을 첨가하여 배양하였고, 멜라 닌 세포 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone, α- MSH)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.

세포 생존율 실험 − 본 실험에서 B16F10 세포에 대한 시 료의 처리농도를 결정하기 위해 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma] assay를 Mosmann의 방법에 의하여 실시하였다. 24 well plate에 2×10⁵개를 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 함초 추출물을 농도별로 처리한 다음 48시간 배양 하였다. 배양 후 0.5 mg/

ml MTT용액을 넣어 3시간 동안 37^oC에서 배양한 다음 상 층액을 제거하고 formazan 침전물에 1 ml DMSO를 넣어 약 20분간 방치한 후 570 nm의 파장에서 ELISA readrer로 흡 광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.

Western Blot을 통한 미백 관련 단백질의 발현 측정 − 미백 관련 단백 유전자 중 TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, TRP- 1, TRP-2, ERK 항체는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA), β-actin Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) MITF, pERK, CREB Abcam(Cambridge, MA, USA), MEK Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA), pMEK Enzo Life Scinences(Farmingdale, NY, USA)에서 사용하였다. 이 차항체로는 anti-rabbit Invitrogen(Carlsbad, USA), anti- mouse Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA)를 사 용하였다.

단백질 발현을 확인하기 위하여 B16F10을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 함초 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24- 72 시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)로 세척해 주었다. Radio-immunoprecipitation (RIPA) buffer(iNtRON Biotechnology, Inc, USA)로 단백질 을 용해해서 4^oC 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 하였다.

원심분리 하여 얻은 상층액은 BCA protein assay kit 를 사 용하여 정량하였다. 30 µl의 단백질을 10% SDS-PAGE 전 기영동 하여 PVDF membrane(BIO-RAD, Laboratories, Inc, USA)에 transfer하였다. Transfer가 끝난 뒤 5% skim milk로 1시간 blocking을 한 뒤 1차 항체를 희석하여 4^oC에 서 over night 한 다음, 다시 10분 간격으로 Tris-buffered saline and tween 20(TBST)로 3회 washing하고 2차 항체를 희석하여 3시간 배양하였다. 3회 washing한 후, enhanced Chemiluminescense(ECL) reagent(Thermo Scientific, IL, USA)를 이용하여 발광한 다음 암실에서 X-film으로 감광한 후 현상 하였다.

통계처리 − 본 실험에서는 독립적으로 3회 이상 반복 실 시 하여 실험 한 결과를 평균 표준편차로 표기 하였고, 통 계적 유의성은 SPSS 프로그램을 사용하여 p값이 0.05 미만 일 때 통계적으로 유의 하다고 판단하였다.

결과 및 고찰

세포 생존률 측정 − 함초 추출물의 B16F10 세포 독성에 미치는 농도를 조사하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.

B16F10 세포에 대한 각 시료의 세포 독성을 측정한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 250 μg/ml 이하의 농도에서 90%

이상의 세포 생존율을 확인하였다. 따라서 본 실험을 바탕 으로 B16F10 세포에 250 μg/ml 이하의 함초 추출물 농도를 처리하여 미백 관련 단백질의 발현 정도 실험을 진행하였다.

B16F10 세포의 함초 추출물의 시간대별 미백 관련 단 백질 발현 확인 − 함초 추출물이 멜라닌 합성 관련 단백질 을 변화시킬 수 있는지를 알아보기 위해 western blotting을 수행하였다. B16F10 세포에 α-MSH 100 nM로 멜라닌을 유 도한 후, 함초 추출물을 농도별로 처리한 후 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 단백질 발현 량을 측정하였고 housekeeping gene인 β-actin을 대조군으 로 사용하였다. 그 결과, 48시간 처리를 제외한 Tyrosinase 단백질 발현량은 농도 의존적으로 감소함을 보였으며 처리 시간에 관여 없이 TRP-2, MITF 단백질 발현량도 추출물의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 3, 4). 하지만 72 시간 처리한 세포에서는 흥미롭게도 DOPA 자극 하에서 세 포에서 매우 높은 수준의 TRP-1 단백질 발현을 나타냈다 (Fig. 5). 이는 체내 melanin이 항상성 있게 유지되기 위함 으로 사료되며 TRP-1은 DHICA를 산화시켜 최종적으로 melanin을 생성하는 DHICA oxidase로 melanin 생성에 있 어 매우 중요한 역할을 하는 단백질 중 하나이다.¹²⁾함초 추 출물을 농도별 처리한 결과 농도 의존적으로 증가 하였다.

이는 함초 추출물이 유의적으로 DOPA를 제거하였기 때문 에 세포에서 TRP-1의 생성이 정상 수준으로 돌아간 것이라

Fig. 2. The cell viabillity of the SHEE in B16F10 melanoma cells. The cells were incubated with SHEE for 48hrs in 5%

CO₂ incubator at 37^oC. The amount of living cells was mea- sured using MTT. Data represent the mean values of three experiments. values are the mean±SE of three experiments.

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고 사료되어진다. 또한 dopachrom을 산화시켜 DHICA를 생 성시키는 고농도의 함초 추출물의 존재하에서 TRP-2의 단 백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다.¹³⁾

125µg/ml 농도로 함초 추출물의 처리한 후 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 멜라닌 관련 단백질 발현은 9시간 이 후부터 발현이 현저하게 감소 하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 6). MAPKase의 활성을 확인해 본 결과, 3시간 때에 발현량이 증가함을 나타내어 멜라닌 생성 억제에 extracellular signal-regulated kinase(ERK) pathway가 관여함을 알 수 있 었다(Fig. 7). 함초 추출물의 농도별로 3시간 처리 후 농도 의존적으로 인산화가 증가하는 것으로 보아 멜라닌 합성 억

제에 ERK가 관여함을 알 수 있었다(Fig. 8). 세포 내 cAMP response element binding(CREB) protein을 활성화되면서 melanin 합성이 증가하며 3시간 처리 후 함초 추물이 농도 의존적으로 발현량이 감소하는 것을 볼 수 있다¹⁴⁾(Fig. 9).

이 실험 결과로 Melanin의 생합성 신호 전달 체계에는 매 우 다양한 신호 전달 물질이 관여 하고 있고 melanin은 몇 가지 세포내 신호 전달 기전을 통하여 합성되는 데 그 중 cAMP/ PKA경로가 melanin 합성의 주요경로이다. PKA를 활 성화 시키며, CREB를 거쳐 MITF의 발현을 증가시킨다.^15,16) MITF는 melanin 합성과정에서 중요한 전사 조절 인자로 Tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진한다. MAPK 경로 Fig. 3. Effects of SHEE on the expression of melanogenesis-

related proteins in B16F10 cells. Cells were exposed to α- MSH 100 nM with various concentrations of SHEE for 24 hr.

The expression levels of the tyrosinase, TRP1, TRP2, and MITF proteins were examined by Western blot. Equal protein loading was confirmed by β-actin expression.

Fig. 4. Effects of SHEE on the expression of melanogenesis- related proteins in B16F10 cells. Cells were exposed to α- MSH 100 nM with various concentrations of SHEE for 48 h.

The expression levels of the tyrosinase, TRP1, TRP2 and MITF proteins were examined by Western blot. Equal protein loading was confirmed by β-actin expression.

Fig. 5. Effects of SHEE on the expression of melanogenesis- related proteins in B16F10 cells. Cells were exposed to α- MSH 100 nM with various concentrations of SHEE for 72 h.

Fig. 6. Effects of SHEE on the expression of melanogenesis- related proteins in B16F10 cells. Cells were exposed to α- MSH 100 nM with 125 µg/ml of SHEE for Time dependent.

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에 속하는 ERK 신호는 MITF의 인산화를 유도하여 MITF 의 ubiquitination이 이루어져 proteosomal degradation 을 일 으키게 됨으로써 멜라닌 합성을 감소시키는 것으로 알려져 있다.^17-19)

결과적으로 함초 추출물의 미백 작용은 tyrosinase의 활성 을 억제하며 B16F10 melanoma 세포에서 α-MSH에 의한 tyrosinase 활성과 melanin 생성 증가를 농도 의존적으로 억 제 하였다.

결 론

함초 에탄올 추출물이 세포 활성 및 멜라닌 생성에 미치 는 영향을 확인하기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이 용하여 세포내 멜라닌 생성 저해 효과와 tyrosinase 및 멜라 닌 형성에 관련된 단백질을 확인 하였다. 함초 에탄올 추출 물의 세포 독성을 분석한 결과 250 ug/ml 이하의 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 나타났다. 또한 B16F10 melanoma 세포에서 멜라닌 합성에 관여하는 단백질을 western blot으로 분석한 결과, tyrosinase와 TRP-2, MITF에 서 함초 에탄올 추출물 처리 군이 농도 의존적으로 감소하 는 것을 확인할 수 있었고, tyrosinase는 12시간 이후부터 TRP-1과 MITF가 24시간 이후부터 현저하게 감소하는 것 을 확인할 수 있었다.

또한 ERK 단백질 활성을 확인해본 결과, 3시간 때에 최 고 수준을 나타내었고 농도 의존적으로 인산화가 증가하는 것으로 보아 멜라닌 생성 억제에 ERK pathway가 관여함을 확인할 수 있었다.²⁰⁾

멜라닌 생합성에 관여하는 단백질의 발현조절 경로를 통 하여 멜라닌 생합성 저해 및 감소 효과를 나타나는 것으로 보이며 향후 미백 제품에 응용 할 수 있을 것으로 판단된다.

사 사

본 연구는 농림수산식품부의 순천지역의 농림자원을 활 용한 고부가가치 문화관광상품 개발 과제 사업(과제관리번 Fig. 7. Effects of SHEE on the expression of melanogenesis-

related proteins in B16F10 cells. Cells were exposed to α- MSH 100 nM with 125 µg/ml of SHEE for Time dependent.

The expression levels of phospho-MEK, MEK, phospho- ERK1/2 and ERK1/2 proteins were examined by Western blot.

Equal protein loading was confirmed by β-actin expression.

Fig. 8. Effects of SHEE on the phosphorylation of MEK and ERK1/2 in B16F10 cells. Cells were exposed to α-MSH 100nM with various concentrations of SHEE for 3hr. The expression levels of phospho-MEK, MEK, phospho-ERK1/2 and ERK1/2 proteins were examined by Western blot. Equal protein loading was confirmed by β-actin expression.

Fig. 9. Effects of SHEE on the phosphorylation of p38 and JNK, CREB in B16F10 cells. Cells were exposed to α-MSH 100 nM with various concentrations of SHEE for 3 hr. The expression levels of phospho-P38, P38, phospho-JNK, JNK and phospho-CREB, CREB proteins were examined by West- ern blot. Equal protein loading was confirmed by β-actin expression.

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호:311013-03-2)에 의해 수행하였습니다.

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(2015. 7. 24 접수; 2015. 8. 31 심사; 2015. 10. 30 게재확정)