242 책임저자：김안근, 140-742, 서울시 용산구 청파동 52번지
숙명여자대학교 약학대학 Tel: 02-710-9566, Fax: 02-710-9871 E-mail: [email protected]
접수일：2009년 9월 3일, 게재승인일：2009년 9월 15일
Correspondence to：An Keun Kim
College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, 52, Cheongpa- dong, Yongsan-gu, Seoul 140-742 Korea
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마우스 악성흑색종세포에서 L-Arginine이 항산화작용과 멜라닌생성에 미치는 영향
숙명여자대학교 약학대학 송경희ㆍ김미지ㆍ유지선ㆍ김안근
The Effect of L-Arginine on Antioxidant Activity and Melanogenesis in Murine Melanoma Cells
Kyung Hee Song, MiJi Kim, Ji Sun Yu and An Keun Kim College of Pharmacy, Sookmyung Women's University, Seoul 140-742, Korea
Pigmentation protects cells from harmful effects of sunlight or oxidative stress. It is due to the synthesis and dispersion of melanin. Our study has shown to melanogenesis effect of L-arginine on B16F10 cells, murine melanoma cells. L-arginine (0∼200 mM) exhibited effective cell growth inhibition dose- dependently. L-arginine decrease level of ROS (reactive oxygen species). Further investigation revealed that L-arginine is a factor of melanogenesis. tyrosinase activity and Melanin contents increased dose dependent manner. Taken together, these findings suggest that L-arginine has to decrease the level of ROS, and increase tyrosinase activity and melanogenesis. (Cancer Prev Res 14, 242-247, 2009) Key Words: L-Arginine, Antioxidant activity, Melanogenesis, Murine melanoma cells, ROS
서 론
산소는 지구상에서 가장 많은 원소로서 호기성 생물 은 이렇게 풍부한 산소를 전자 수용체로 하는 호흡을 통 해 에너지를 획득하며 대사과정의 부산물로 hydroxyl radicals, superoxide anion, hydrogen peroxide와 nitric oxide를 포함하는 반응성이 매우 큰 reactive oxygen species (ROS)를 생산한다.1) ROS는 사실상 산소를 소비하는 거의 모든 세 포내부기관의 일상적인 대사과정에서 발생하고 따라서 각각의 기관은 산화적 스트레스의 중요한 표적이 된다.2) 많은 연구에서 산화적 스트레스가 다양한 질병과 환경 적 세포손상에 공통요인임을 지적하고 있다. 또한 이러 한 다양한 생물학적 그리고 비생물학적 스트레스가 활
성산소종에 의한 것임을 규명하고 있다.3)
자외선이나 환경오염 그 밖의 외부 요인의 자극에 대 해 피부세포는 방어기전으로 포유동물의 표피 기저층에 존재하는 melanocyte의 melanosome에서 멜라닌을 합성하 며, melanocyte가 멜라닌을 형성할 때 tyrosine이 3,4-dihydro- xyphenylalanine (L-DOPA)으로 전환하는 과정을 거친다.4) 이 과정에서 tyrosinase가 중요한 역할을 하며, 멜라닌 생 성의 중요 조절효소이다. 이러한 멜라닌은 생체 내 cysteine과 glutathione이 존재할 때 효소의 작용에 따라 eumelanin과 pheomelanin으로 분류되며(Fig. 1),5) 이들의 형 성 비율에 의해 동물들의 피부, 눈동자, 머리카락의 색 결정에 중요한 요인이 되고 있다.6)
L-Arginine은 모든 생물체에 존재하는 아미노산이며 특히 어류의 정자에 많고 발육기의 동물에게는 필수적
Fig. 1. Overall view of melanogenesis.5)
인 아미노산이다. L-arginine에 의해 형성된 nitric oxide (NO)는 혈관압축, 내피의 기능장애, 백혈구정착, 스트레 스에 작용함으로서 항동맥경화성 작용에 중요한 역할을 한다. 또한 L-arginine은 항산화작용이 있는 것으로도 알 려져 있다. Moncada 등의 연구결과7)에서 L-arginine은 생 장호르몬의 분비를 촉진하고 생체 내에서 여러가지 생 리조절 기능을 가지고 있는 nitric oxide를 합성하는 효소 의 기질로 이용되며, 또한 유아의 필수아미노산으로서 근육에 의한 아미노산 흡수를 자극하고 여러 조직에서 단백질 합성을 증가시키는 somatotrophin을 유리하는데 가장 강력한 아미노산 자극물질로 알려져 있다.
본 실험에서는 마우스 악성 흑색종 세포인 B16F10에 서 항산화작용과 멜라닌 생성과의 관계를 알아보기 위 하여 L-arginine이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하 기 위해 마우스의 흑색종 세포인 B16F10 세포에 L-argi- nine을 처리하여 그 변화를 검토하였다. 세포 생존율을 알아보기 위하여 MTT assay, 항산화작용을 검토하기 위 해서 ROS level의 변화 등을 측정하였다. 또한 멜라닌 생 성 효과를 알아보기 위하여 tyrosinase 활성변화와 melanin 함량을 측정하여 L-arginine이 멜라닌 생성 미치는 영향 을 살펴보고자 하였다.
재료 및 방법 1. 시약 및 기기
RPMI 1640 powder medium, antibiotics (10,000 units/ml penicillin G sodium, 10,000μg/ml, streptomycin sulfate), try- pan blue는 Gibco BRL life Technologies Inc. (Carlsbod, CA, USA)제품을 사용하였고, fetal bovine serum (FBS)은 Bio WhittakerTM (Walkersville, MD, USA), protease inhibitor cocktail tablets은 Roche에서 구입하여 사용하였다. MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide], bicinchonic acid protein assay kit, β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form (β-NADPH), glu- tathione reduced form, hematoxylin는 Sigma Co. (St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
ELISA reader는 Bio-Tek instrument Inc. (Washington, USA), cytofluor 2,350 plate reader는 Millipore (Bedford, MA, USA), CO2 incubator (Forma science), tabletop centrifuge (Hanil scienceindustrial Co. Ltd.) inverted microscope는 Olym- pus CK2 (Massachusetts, USA), UV/visible spectrophotometer 는 Ultraspec 2000 (Pharmacia Biotech.) 제품을 사용하였다.
2. 세포 배양
실험에 사용한 세포는 mouse melanoma로부터 유래된 B16F10 cell로 한국 세포주 은행(Korean cell lines bank)으
로부터 분양 받았다. 10% FBS와 항생제(penicillin G 100 sodium 10,000 units/ml, streptomycin sulfate 10,000μg/ml), 1 mM sodium pyruvate를 포함하는 RPMI 1640 배지를 배 양액으로 하여 37oC, humidified 5% CO2 incubator에서 배 양되었다. 배양액의 pH는 10 mM HEPES와 2 mg/ml sodium bicarbonate를 사용하여 7.2∼7.4로 조정하였다. 25 cm2 tissue culture flask나 75 cm2 tissue culture flask에서 계대 배 양하고 confluent 되었을 때 trypsin-EDTA 용액을 처리하 여 실험에 사용하였다.
3. 세포 생존율 측정
본 실험에서 B16F10 세포(murine melanoma cell)에 처리 할 L-arginine의 농도를 결정하기 위해 MTT assay로 측정 하여 검토하였다. 이 분석법은 노란색의 수용성 기질인 MTT가 mitochondria의 dehydrogenase 효소에 의해 purple formazan crystal을 형성하여 진한 보라색을 띠는 원리를 이용한 것이다. 생성된 formazan의 양은 살아있는 세포 수에 비례한다.
1) MTT시약 제조: MTT 2.5 mg/ml를 DPBS에 녹인 후 clean bench에서 0.22μm filter로 filtration 하여 사용하였다.
2) 시료처리: B16F10 cell suspension을 1×105 cells/ml의 농도로 96 well plate에 100μl씩 가하여 24시간 안정화 시 켰다. L-arginine은 수용액 상태로 50∼200 mM의 농도로 처리하였다. Control은 sample 대신 DMEM 배지 20μl를 넣었다. 그 후 incubator에서 24시간 배양하였다.
3) MTT측정: 배양한 96 well plate에서 media를 suction 한 후, MTT시약 50μl/well을 넣고 4시간 동안 배양기에 방 치하였다. 그 후 상층액을 제거하고 DMSO를 well당 100 μl씩 가하여 1분간 shaking하여 formazan을 완전히 용해 시킨 후 ELISA pleate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 결과는 control (100%)에 대한 %로 나 타내었다.
4. Reactive oxygen species level 측정
미리 배양한 96 well plate (B16F10 cell suspension을 1×
105 cells/ml)에 L-arginine수용액을 농도별로 넣어 처리하 였다. Control은 DMEM배지 20μl를 넣었다. Incubator에 서 2시간 배양 후 96 well plate를 꺼내어 PBS로 2번 씻은 후 각 well당 3.6% DCFH-DA를 가하고 30분 동안 차광한 상태로 incubator에 보관하였다. Cytofluor 2350 plate reader 로 5분마다 흡광도를 측정하였다. Emission 파장은 485 nm의 excitation wavelength와 530 nm의 emission wavelength 에서 측정하였다.8)
5. Tyrosinase 활성변화 측정
Tyrosinase activity 측정은 tyrosinase 활성에 의해 L-DOPA 가 dopachrome으로 변하는 원리를 이용한 것이다. 여기 서 활성이 강할수록 흡광도가 높다.
Protein preparation은 100π dish에 세포를 배양(1×106 cells/dish)하여 L-arginine을 각각 0.5, 25, 100 mM로 했으 며, control은 L-arginine 대신 media를 넣어주었다. 24시간 배양 후 DPBS로 2회 washing 하고 scraper로 dish를 긁어서 세포를 포합했다. 15 ml conical tube에 농도별로 세포를 넣고 원심분리한 후(1,500 rpm, 10분), 각 tube에 triton X-100가 1% (w/v)로 함유되고 있는 10 mM sodium pho- sphate buffer (pH 6.8)을 넣어 단백질을 분해시키고, tube 에 모아 17,000 rpm, 15 min, 4oC에서 원심분리 하였다.
이 때 상층 액에서는 tyrosinase activity를 측정하고, pellet 에서는 melanin 함량을 측정하였다. Protein의 정량은 Bradford법을 이용해 측정하였다.
Tyrosinase activity 측정은 단백질 정량 후 농도별로 96 well-plate에 상층액을 40μl/well씩 넣는다. 그리고 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.2)와 기질인 2 mg/ml L- DOPA를 합하여 총 200μl가 되게 하여 각 well에 첨가하 고 37oC에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기서 생긴 dopa- chrome의 양은 ELISA reader를 이용하여 475 nm에서 흡광 도를 측정하였다.
6. melanin contents 정량
96 well plate에 농도별로 pellet에 1 N NaOH 100μl와 증류수 200μl를 넣은 후, 60oC에서 1시간 동안 배양시켰 다. 이후 96 well plate에 농도별로 200μl씩 분주하여, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 표준품으로 부터 얻은 표준 검량선을 이용하여 생성된 멜라닌 양을 산출 하였다.
7. 통계처리
본 연구의 그래프와 표의 모든 수치는 각 실험 횟수에 대한 평균과 표준편차로 표시하였으며, 모두 triplicate로 세 차례 이상 수행하였다. 각 sample의 통계적 유의성에 대한 검증은 student t-test를 시행하여 계산하였으며, p＜
0.05인 값에 대해 유의적인 것으로 처리하였다.
결과 및 고찰
본 연구에서는 L-arginine의 항산화작용과 멜라닌 생성 효과를 알아보기 위하여 침습성이 강하고 전이가 빠른
Fig. 2. Cell viability of B16F10 cells after treatment with L-arginine. The cells were exposed to various concentrations of L-arginine for 24 hr. Percentage of cell viability was determined by using MTT assay. Results are expressed as percentage of control. Values are means±SD and were ob- tained from three different experiments. ap<0.05: Significantly different from untreated control cells.
Fig. 3. Measurement of reactive oxygen species (ROS) level after L-arginine treatment. The melanoma cells (2×104/well) were incubated with L-arginine at various concentration and then 5 μM was added as a substrate for ROS. After incu- bation for 30 min, ROS levels were measured by spectro- fluoremeter (excitation: 485 nm, emission: 530 nm). Results are representative of three experiments and each performed in triplicates.
Fig. 4. Tyrosinase activity of L-arginine on B16F10 melanoma cells. Tyrosinase activity was measured after cells were ex- posed to various concentration of L-arginine for 24 hr. Results are expressed as percentage of control. Values are means±
SD and were obtained from three different experiments.
마우스 악성 흑색종 세포에서 생존율과 ROS의 억제효 과, 그리고 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생성 효과를 알아 보았다. B16F10 세포에서 생존율을 알아보기 위하여 MTT assay를 실행하였고 이 때 배양 기간은 2일로 고정 하고, 농도는 50, 100, 150, 200 mM을 각 각 투여하여 실 험하였다. 세포생존율을 확인한 결과 L-arginine의 50 mm, 100 mM에서는 생존율이 감소되지 않았으나 이 L- arginine의 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소되어 150 mM에서는 15%, 200 mM에서는 40%까지 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 2). 본 실험에 사용한 L-arginine의 농도는 50 mM 농도에서 감소되지 않 았으므로 이농도를 최고농도로 하여 모든 실험을 실행 하였다.
활성산소종(ROS)은 O2가 전자 전달계에 의해 물로 환 원되어 가는 동안에 전자 한 개씩에 의해 순차적으로 환 원되면서 생성되는 radical 등의 파생물로, 과잉 생성될 경우 세포에 손상을 촉진시키며, DNA 돌연변이를 유발 해 다양한 종류의 암을 비롯한 난치질환의 근원이 된다 고 알려져 있다.9) 이러한 ROS의 생성 억제와 제거는 항 산화능의 지표가 되므로 L-arginine도 B16F10 세포에서 ROS에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 실험을 하였 다. L-arginine를 세포에 처리하고 30분 배양한 후 다음과 같은 측정한 결과를 얻었다. 25 mM 농도에서 ROS level 의 농도를 30% 감소시키고, 50 mM에서는 70%를 감소시 킴에 따라 ROS도 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다
(Fig. 3).
Melanin은 tyrosine으로부터 tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), dopachrome tautomerase (TRP-2)에 의해 서 합성되는데, 이 중 tyrosinase는 L-DOPA (dihydroxypheny- lalanine)가 melanin으로 형성되는 cascade 반응에 관여하는 효소로서 전사인자인 MITF와도 밀접한 관련이 있다.10) 따라서 L-arginine의 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 검토
Fig. 5. Melanin contents of B16F10 cells after treatment with L-arginine. The cells were treated with various concentration of L-arginine for 24 hr. Results are expressed as percentage of control. Values are means±SD and were obtained from three different experiments. ap<0.05: Significant different from untreated control cells.
하기 위해 tyrosinase activity를 측정하였다. Tyrosinase효소 의 활성정도에 따라 dopachrome의 생성에 비례하여 영향 을 주므로 L-arginine을 투여하지 않은 control에서의 dopa- chrome의 양(100%)으로 하여 비교 검토하였다. Tyrosinase activity 측정결과를 보면 5 mM과 10 mM로 처리하였을 때는 거의 영향을 주지 않았으나 25 mM에서는 19%, 50 mM에서는 48%가 증가되었다(Fig. 4). L-Arginine에 의해 영향을 받은 tyrosinase activity는 melanin생성에도 영향을 미친다. Melanin 색소형성도 tyrosinase 활성과 유사한 양 상을 나타내었다. 저 농도에서는 melanin 색소의 형성에 거의 영향을 미치지 않았으나 농도가 높아지면서 melanin양도 증가하여 25 mM에서는 control (100%) 대비 162%, 50 mM에서는 293%가 증가하였다(Fig. 5). 멜라닌 은 산화적 스트레스나 NO 등에 의한 자극에 의해서도 생성이 되는데10) NO는 세포 내 cGMP를 합성하는 guanylate cyclase를 활성화시키면서 효과를 나타낸다.11) 실제로, NO가 증가하게 되면 tyrosinase gene expression가 유도되 고, NO 증가로 tyrosinase activity와 tyrosinase protein level이 증가하게 된다. Tyrosinase acitivity가 증가하면 시간에 따 라 tyrosinase protein level도 상승하게 된다. L-arginine이 L-citrulline으로 전환되는 과정에서 nitric oxide (NO)가 생 성되는데 free radical gas로서 세포내 또는 세포 외의 신호 전달분자로서 중요한 역할을 한 것으로 볼 수 있다. L- Arginine에서 유도되는 NO 농도 증가가 melanogenesis 활 성화시켜 melanin 형성을 촉진시킨 것으로도 볼 수 있다.
많은 논문에서 항산화작용이 있는 것이 멜라닌 억제
작용과 관련이 있는 것으로 보고되어 있으나 L-arginine 을 투여한 경우에는 다르게 나타났다. 즉 농도 의존적으 로 ROS를 감소시키나 ROS를 제거시키는 항산화작용 효 과와는 달리 tyrosinase 활성측정 실험결과는 L-arginine의 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성도 높아짐을 알 수 있었다. 이로 인하여 멜라닌 생성도 농도 의존적으로 촉 진시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 향 후 연구를 진행하여 멜라닌 생성을 필요로 하는 백반증이나 의 치 료에도 활용할 수 있는 가능성이 있는 것으로 생각된다.
결 론
L-Arginine을 마우스 악성 흑색종 세포인 B16F10에 처 리하여 세포 생존율을 확인한 결과는 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 감소하여 200 mM에서는 세포생 존율이 40%까지 감소됨을 알 수 있었다.
마우스 악성 흑색종 세포인 B16F10에서 L-arginine의 항산화효과를 알아보기 위하여 ROS level을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 ROS의 형성이 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
멜라닌 생성작용은 tyrosinase 활성과 유사한 양상을 나 타내어 저농도에서는 거의 영향을 미치지 않았으나 고농 도에서는 농도 의존적으로 상승하는 것으로 나타났다.
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