서론
현재 나노기술을 이용하여 생명공학과의 학문적·기 술적 융합을 통해서 NT-BT 원천기술을 확보하고 나아 가 새로운 형태의 통합형 분자진단시스템을 개발하려고 미국, 일본, EU 등을 중심으로 국가적인 차원에서 막대 한 연구비를 투자하여 다양한 분야에서 활발한 연구가 진행되고 있고, 특히 주목할만한 사실은 이러한 NT-BT 융합기술을 이용하려는 많은 연구자들에게 관심이 있는 이유는, 아마도 전통적인 바이오시스템에 나노구조체가 결합된 형태의 융합 시스템을 개발하여 거대분자 수준이 아닌 단일분자 수준에서의 생물학적 상호작용 혹은 메카 니즘을 규명함으로써 최종적으로 질병의 조기 진단이 가 능해지고, 이를 바탕으로 새로운 신약개발이 기대되기 때문이다. NT-BT 융합기술은 1980년대 후반에 개발된 주사 터널링 현미경(Scanning Tunneling Microscope, STM) 등으로 기존에 관찰할 수 없었던 원자나 분자의 형상화 및 원자 혹은 분자의 조작을 가능하게 되었다는 점에서 그 유래를 찾아볼 수 있다. 즉, 단백질 정도 크기 의 나노 구조물을 제작할 수 있게 되었으며, 이러한 나노 크기에 대한 분석 및 조절이 가능하게 되면서 전통기술 로 접근하기 어려웠던 나노 크기의 세계가 열려 생명현 상이나 질병에 대한 보다 깊은 연구가 가능하게 되었다.
결론적으로, NT-BT 컨버젼스기술은 나노크기의 수준 에서 조작 및 분석하고 이를 제어하는 기술로 정의될 수 있으며, 현재 이 기술을 이용하여 질병의 조기 진단, 생체 물질의 정제, 질병치료, 에너지, 농림, 수산, 분자의학진단 기술 등 첨단 과학 기술분야와의 융합화 및 기술혁신이 가속되고 있는데, 그 대표적인 예로 나노바이오칩, 나노 바이오 센서, 나노바이오 미세종합분석시스템, 질병조기 진단용 나노바이오 이미징 기술 등을 들 수 있다.
본 컬럼에서는 NT-BT 컨버젼스기술을 이용하여 생 분해성 고분자 칩을 이용하거나 microfluidic 기술을 이 용하여 생물학적 상호작용(DNA-DNA interaction, protein-protein interaction)과 SARS 검출 연구, 카본나 노튜브를 이용한 나노바이오센서 제작을 위한 기능화 연 구, antimicrobial peptoid를 이용한 TiO2 표면에서의 항
NT-BT 융합
컨버젼스기술을 이용한
분자진단기술 개발
1998 대구대학교 생물공학과 공학사 2000 대구대학교 생물공학과 공학석사 2004 KAIST 생명화학공학과 공학박사
2008 Northwestern Univ. 생명화학공학과 박사후 연구원 2009 Columbia Univ. 화학공학과 박사후 연구원 현 재 대구한의대학교 한방제약공학과 전임강사
박 종 필
대구한의대학교 한방제약공학과
[email protected]
균활성 연구 등에 대해서 소개하고, 마지막으로 현 재 진행중인 실험에 대해서 간단히 소개하고 이 컬 럼을 마치고자 한다.
1) 생분해성 고분자칩을 이용한 생물학적 상호작용 검출
본 연구에서는 재조합 대장균을 이용하여 고농도 발효를 통해서 생분해성 고분자인 PHB(poly(3- hydroxybutyrate)를 생산하고, 이 고분자를 이용하 여 위해미생물인 SARS 조기검출용 센서를 개발하 고자 하였다. 세포내에서 에너지원으로 사용하기 위 해서 미생물은 PHB를 체내에 축척하게 되고, 에너
지가 고갈되었을 때 재사용하는 프로그램이 있다.
이때 체내에서는 PHB를 분해하기위한 효소가 분비 되는데 PHB depolymerase가 대표적이다. 이 효소 는 PHB를 특이적으로 인식하는 binding domain을 가지고 있는데, 본 연구에서는 PHB binding domain을 유전공학적인 기법을 이용하여 재조합 단 백질로 생산하였으며, PHB 칩을 특이적으로 인식 하는 anchoring motif로 사용하였다. silicon 표면위 에 PHB를 코팅처리하여 표면을 개질하였고[그림 1], 이미 알려진 microcontact printing 기법을 이용 하여 binding domain을 포함한 재조합 단백질을 특 이적으로 고정화하는 방법을 사용하여, 위해미생물 인 SARS 조기검출용 센서를 개발하였다[그림 2].
기존에 광범위하게 사용되고 있던 glass를 이용할 경우 단가가 매우 비싸며, 사용한 후 폐기처분으로 인해서 환경적 문제를 유발하는 단점이 지적되어져 왔다. 이 연구에서 개발된 생분해성 고분자칩은 환 경문제를 줄일 수 있으며, 동시에 고감도 성능을 가 지는 융합형 바이오센서로서의 개발이 가능하게 되 는 등 여러 가지 장점이 있다.
비록, real 검체를 사용하여 SARS의 존재유무를 확인하진 않았지만, 이 연구에서 개발된 칩으로도 충분히 limit of detection(LOD)를 낮출 수 있으며, 동시에 고감도로 조기에 위해미생물을 검출할 수 있 다는 장점이 있다.
또한, 개발된 생분해성 고분자칩을 이용하여 기존 에 광범위하게 사용되고 있던 항원-항체반응에 포함 되는 다양한 바이오컨텐츠를 이용할 수 있어 다양한 응용이 가능하다는 장점이 있다.
2) 생물학적 상호작용 검출이 가능한 microfluidic chip 개발
마이크로/나노플루이딕스(micro/nano fluidics) 기술을 이용한 칩제작기술은 시료의 반응, 분리, 분 석이 하나의 칩 위에서 이루어지도록 고안된 5∼200 µm의 크기의 마이크로 채널로 생명공학의 발전에 그림 2. PHB칩을 이용한 고감도 SARS 검출.
그림 1. PHB칩 제작을 위한 모식도.
크게 기여하고 있는 대표적인 NT-BT 컨버젼스기 술 중에 하나이다. 다양한 샘플을 나노리터정도 또는 그 이하의 양만으로 연속적으로 분석할 수 있는 방 법을 제공함으로써 초고속 처리(high-throughput screening) 분석이 가능하게 되었다. 또한, lab-on-a chip에 응용뿐 아니라 약물전달시스템(drug delivery system)이나 마이크로통합분석시스템 (µ-TAS: Micro Total Analysis System) 등에 응 용될 것으로 기대되고 있다. 이 연구에서는 반도체 공정에 사용되는 photolithography 기술을 이용하여 원하는 형태의 다중채널 PDMS 마이크로플로이딕 스를 제작하였고, gold에만 특이적으로 분자인식 (molecular recognition)이 가능한 펩타이드(gold specific binding peptide)를 재조합 단백질형태로 대 장균에서 생산하여 anchoring motif로 사용하여 단 백질을 특이적으로 금 표면에만 고정화하였다. 이를 통해서 생물학적 상호작용의 대표적인 DNA-DNA interaction, protein-protein interaction을 SPR imaging 기술을 이용하여 확인하였다[그림 3].
Phage display 기술을 이용하여 다양한 종류의 inorganic 표면(gold, aluminum, silicon 등)에 특이 적으로 인식하는 펩타이드가 발굴되었다. 이 연구에 서는 기존에 밝혀진 펩타이드 서열을 randomized하 여 binding affinity를 높이는 연구도 동시에 수행하 였다. [그림 3]에서 보는 바와 같이 금표면만 특이적 으로 인식하여 DNA-DNA, 단백질-단백질 상호작 용을 검출할 수 있었다. 이번 연구에서 개발된 센서 는 부가적인 label이 필요없어 기존의 검출기기보다 보다 안전하게 고효율로 검출할 수 있는 장점이 있 다. 또한, gold 표면을 개질하여 특이적 고정화를 하 기 위해서는 thiol SAM(self-assembly) 방법이 광 범위하게 사용되는데 이 방법은 많은 단계를 거쳐야 하고 작용기를 선택함에 있어서 매우 제한적이다.
하지만, 금 표면을 특이적으로 인식하는 펩타이드를 사용하면 이를 대체할 수 있으며 유전공학적인 방법 을 이용하여 많은 양의 재조합 단백질을 생산할 수 있어 전체 바이오센서 공정의 단가를 효율적으로 낮 출 수 있는 장점이 있다.
3) 나노바이오센서개발을 위한 카본나노튜브의 기능화 연구
탄소나노튜브(carbon nanotube, CNT)가 발견된 이래 100nm이하 전기적 혹은 기계적인 부품이 초집 적화된 나노시스템으로 응용하려는 시도가 현재 활 발히 진행되고 있다. 탄소나노튜브는 금속전도체 또 는 반도체적 성질을 가질 수 있어 전기적, 기계적 특 성이 우수하여 센서, 액츄에이터, 평판 디스플레이, 에너지, 환경분야에서 매우 각광받고 있는 탄소유기 복합체이다. 6개의 탄소원자로 이루어진 육각형 격 자구조로 이루어진 그래핀판(graphene sheet)이 동 그랗게 다발형태로 말린 구조로 단일벽(single- walled), 다중벽(multi-walled) 탄소나노튜브로 나 눌 수 있다. 기존에 알려진 CVD(chemical vapor deposition)방법으로 합성된 탄소나노튜브는 표면개 질, 자기조립을 통해서 전자소자나 센서로의 응용이
그림 3. Microfluic channel 제작 및 이를 이용한 생물학적
상호작용 검출.
가능하다. 이 연구에서는 합성된 단일벽 탄소나노튜 브를 이용하여 센서제작을 위해서 평행하게 배열 (aligned)하기 위해서 표면을 카복실기로 개질한 후 biotin-streptavidin 결합을 이용하여 magnetic bead 을 고정화하여 자기장에서 평행하게 배열이 되도록 디자인하였다[그림 4]. 기존의 방법들은 전기영동법 을 이용하거나 유체를 이용하여 자기정렬을 시도하 였으며 지속적으로 증착을 통해서 탄소나노튜브 어 레이를 개발하려 함으로써 매우 제한적이며 복잡한 공정을 거쳐야만 했다.
하지만, 이번 연구에서 개발된 자기장(magnetic field)을 이용하여 탄소나노튜브 자기정렬법은 매우 간편하게 원하는 parallel 혹은 crossed array로 개발 이 가능할 뿐만 아니라 낮은 자기장하에서도 자기정 렬조절이 가능하게 됨으로써 다양한 형태의 탄소나 노튜브 어레이개발이 가능하다[그림 5]. 원하는 형 태의 CNT array 개발이 가능해짐에 따라서 이를 이용하여 온도센서, 화학물질 탐지 센서, 바이오센 서, 질량센서 등의 개발이 용이하게 될 것으로 판단
된다. 하지만, 극복해야할 과제도 많이 지적되고 있 다. 예를 들면, 고가의 합성방법으로 제공되는 현재 의 탄소나노튜브 생산을 대체할 수 있는지에 대해서 는 더 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 판단된다.
또한, magnetic field하에서 자기정렬이 가능한 CNT array를 개발하기 위해서 SWNT 혹은 MWNT의 양쪽 말단에만 화학적 치환이 필요한데 어떤 방법을 사용하여 정확한 기능화를 할 수 있을 지도 해결해야 할 문제로 남아있다.
그림 4. CNT biosensor 제작을 위한 CNT 기능화(functionalization) 모식도.
그림 5. Crossed CNT array의 전자현미경 사진.
4) Antimicrobial peptoid를 이용한 TiO2표면에서의 항균활성
펩토이드(peptoid)는 펩타이드(peptide)를 모방 해 만든 인공 고분자(폴리머)이기 때문에 펩타이드 결합(peptide bond)이 없어 단백질가수분해효소로 부터 자유로울 수 있다. 펩토이드는 고체상 합성 방 법을 이용하여 상대적으로 쉽게 합성을 할 수 있으 며, 원하는 sequence 혹은 체인 길이를 인위적으로 조절이 가능하다는 장점이 있다. 합성된 펩토이드는 몸에서의 대사 안정성이 좋기 때문에 항암제, 향균 제 등 다양한 분야에 이용이 가능하다. 최근에는 면 역반응에 있어서도 펩타이드보다 현저히 줄어든 새 로운 형태의 펩토이드 모방체가 개발되기도 하였다.
펩토이드 연구는 미국 Lawrence Berkeley lab.에 있는 Zuckermann 박사가 최초 합성법을 개발한 이래, Stanford 대학교 Barron 교수, New York University
Kirshenbaum 교수, Wisconsin 대학교 Gelman 교 수, Indiana 대학교의 임현석 교수, Genentech의 이 병철박사 등이 매우 활발하게 연구하고 있으며 이 분야에 종사하는 연구자들이 매년 ‘Peptoid Summit’이라는 학술대회를 개최하여 서로의 연구 결과를 발표하고 의견을 나누는 시간을 갖고 있다.
펩토이드를 이용하여 antimicrobial agent를 개발하 기 위해서는 chirality, helical structure, amphiphilicity 등이 고려되어야 한다. 기존에 보고되어 있는 antimicrobial peptide database(http://aps.unmc.edu /AP/main.php)에 보고된 펩타이드 염기서열을 모 방하여 새로운 형태의 peptoid 모방체를 합성할 수 있다. 이번 연구에서는 magainin-2를 모방한 peptoid를 scaffold로 사용하여 TiO2 표면에 특이적 결합능을 가지는 L-DOPA와 antimicrobial peptoid 를 가지는 새로운 hybrid 분자를 다양한 monomer
그림 6. Antimicrobial peptoid 합성에 사용된 모노머의 종류.
를 이용하여 합성하였다[그림 6]. 합성된 분자는 antifouling effect와 antimicrobial activity를 가질 수 있게 디자인하였다. 최종적으로 합성된 고분자는 HPLC, ESI-MS, CD, XPS, OWLS를 이용하여 정 제와 표면분석, 2차 구조, 고정화된 peptoid 폴리머의 정량 등을 확인하였다[그림 7]. Antimicrobial activity 활성을 확인하기 위해서E. coli와 Bacillus subtilis를 개발한 칩위에 올려놓고 결합시킨 후 confocal microscopy로 측정하였다[그림 8]. 형광검
출을 위해서 FITC를 처리하여 세포벽이 손상된 미 생물에만 형광을 나타낼 수 있게 조절하였다.
결론적으로, 합성된 peptoid 폴리머는 antimicrobial activity가 높은 것으로 확인되었으며 정확한 메카니 즘은 아직 밝혀지지 않았지만, 아마도 세포내로 penetration된 후 세포벽을 lysis 작용기작일 것으로 판단하고 있다.
N-methoxyethylene glycine은 antifouling effect 를 가질 수 있게 모노머로 사용하였으며, PMP1-C 는 antimicrobial activity를 비교하기 위해서 control 로 사용하였다. [그림 8]에 보는 바와 같이 예상한대 로 PMP1-AMP 폴리머가 높은 antimicrobial activity를 보였으며, PMP1, PMP1-C, TiO2 표면 에서는 거의 활성을 보이지 않았다.
현재 진행중인 연구
저자가 근무하고 있는 대구한의대학교는 한방특 성화를 위해서 많은 노력을 하고 있는 학교이다. 특 히나 한방제약공학과는 한의학과 생물공학기술을 이용하여 국내 제약 혹은 바이오산업에 중추적인 역 할을 할 수 있는 공학도를 길러내는데 목적이 있다.
이러한 주변상황과 구축된 인프라를 이용하여 위에 서 소개한 다양한 융합기술을 이용한 분자진단분야 에 주력함과 동시에 한의학의 표준화와 분자 메카니 즘 연구, 실시간 세포독성을 모니터링할 수 있는 그림 7. 합성된 antimicrobial peptoid의 정제(HPLC), 분자량 측정(ESI-MS), 2차 구조(circular dichroism spectroscopy)를
확인한 결과.
그림 8. Confocal microscopy를 이용한 항균활성 조사.
HCS(high-content screening)기술을 개발하고자 노력하고 있다. 한약재기원의 수많은 바이오소재 (bioresource)로부터 신약후보물질을 검색하고 발굴 하기 위해서 칩제작기술, 모니터링기술, screening 기술, imaging 기술 등이 접목된 융합기술 인프라를 구축하려고 노력하고 있으며, 또한 세포칩 혹은 꼬 마선충을 동물모델로 하여 비만, 암, 신경세포를 유 도하고 억제할 수 있는 새로운 물질을 검색하는 방 법들이 현재 진행중이다.
결론
본 컬럼을 통해서 저자가 경험한 NT-BT융합기 술을 이용하여 분자진단의 몇가지 개발예에 대해서 간단하게 소개하였다. 이 융합기술은 다른 학문과는 달리 물리, 화학, 전자, 생물, 의학, 재료, 기계 등의 과학기술자들이 긴밀하게 융합하여 진행해야만 연 구성과를 극대화시킬 수 있는 독특한 학문분야이다.
현실적으로 여러 가지 문제들도 지적되고 있고, 융
합기술기반으로 초고감도 분자진단을 위한 바이오 센서의 개발은 많은 시간과 연구비가 투자되어야 하 지만, 무엇보다도 중요한 사실은 개발된 바이오센서 의 validation이 매우 중요하고 표준화된 방법이어야 한다. 현재까지 당센서 이외에 이렇다할 표준화된 바이오센서 혹은 칩 개발이 이루어지지 않고 있는 상황에서 무엇보다도 학문을 넘나드는 융합기술의 붐이 이루어져야 한다고 판단한다. 주지하다시피 NT-BT 융합기술은 나노와이어, 탄소나노튜브, 그 래핀 또는 nanoparticle 등의 나노구조체를 이용하 여 전기화학적 특성, 광학적 특성(형광, 발색, SPR), 전하, 질량 등의 변화를 증가시킴으로써 기존의 센 서보다 매우 민감하여 소량의 생체물질만으로 질병 을 조기에 진단할 수 있다는 가능성을 가지고 있기 때문이다. 또한 이 융합컨버젼스 기술을 이용하여 질병의 진단 및 모니터링이 용이하게 되어 질병의 진단 및 치료를 동시에 수행할 수 있는 다기능성 나 노소재개발을 위한 기반기술로 활용될 수 있다.
