DOI 10.17480/psk.2017.61.3.195
고지방식이 마우스에서 콩잎추출물의 지방간 억제 효과
김소라 · 제지현 · 정준연 · 김현정* · 송영훈** · 박기훈** · 강상수*** · 박상원# 경상대학교 의과대학 약리학교실, *경상대학교 의과대학 경상대학교병원 내과학교실
**경상대학교 농업생명과학대학 환경생명화학과, ***경상대학교 의과대학 해부학교실
(Received May 30, 2017; Revised June 14, 2017; Accepted June 23, 2017)
Effect of Soybean (glycine max) Leaf Extract against the Development of Non-alcoholic Fatty Liver in High Fat Diet-fed Mice
So Ra Kim, Jihyun Je, Jun Yeon Jeong, Hyun-Jung Kim*, Yeong Hun Song**, Ki Hun Park**, Sang Soo Kang***, and Sang Won Park#
Department of Pharmacology, Institute of Health Sciences, Gyeongsang National University School of Medicine, Jinju 52727, Republic of Korea
*Department of Internal Medicine, Gyeongsang National University School of Medicine and Gyeongsang National University Hospital, Jinju 52727, Republic of Korea
**Division of Applied Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 52727, Republic of Korea
***Department of Anatomy, Institute of Health Sciences, Gyeongsang National University School of Medicine, Jinju 52727, Republic of Korea
Abstract — This study was designed to investigate the effect of soybean leaf extract on the development of hepatic ste- atosis in high fat diet-fed mice. Soybean plants were treated with ethephon to enhance the production of isoflavones in the leaves. The mice were fed with normal chow diet(ND), high fat diet(HFD) or HFD+Soybean leaf extract for 9 weeks. HFD feeding significantly increased the body weight gain and visceral and subcutaneous adipose tissue weights compared to ND group in the mice, but these increases were attenuated by Soybean leaf treatment. Soybean leaf also attenuated the increases in hepatic lipid droplet and hepatocellular triglyceride level at 64 days of HFD feeding. Finally, soybean leaf mark- edly increased the phosphorylation of AMPK and ACC and their protein expression in the liver at 64 days of HFD feeding, while inhibited the increase in fatty acid synthase protein expression. Our results indicate that soybean leaf extract has ben- eficial effects against hepatic steatosis in HFD-fed mice.
Keywords High Fat diet, Isoflavone, Non-alcoholic Fatty Liver, Phytoestrogen, Soybean Leaf
지방간(fatty liver)은 간세포의 세포질 내에 triglyceride(TG), cholesterol 및 lipid droplet 등의 비정상적 축적으로 일어나며, 전 세계적으로 식생활이 풍요해지고 고지방식을 섭취할 기회가
많아지며 성인병이 증가함에 따라 지방간의 발생 빈도도 급격히 증가하고 있다. 지방간의 유병률은 서구의 여러 국가뿐만 아니 라 국내에서도 최근 지속적으로 증가하고 있으며, 이는 성인과 소아 비만의 증가와 관련이 있고, 국가마다 차이가 있지만 선진 국가에서 전체 인구의 약 20~30%로 보고하고 있다.1)
대부분의 지방간은 특별한 임상증상이 없으며 일부의 경우 가 벼운 피로감이나 우상복부의 불쾌감이 있지만, 가역적 변화로서 원인을 제거하면 다시 정상 간으로 비교적 쉽게 회복되므로 임 상에서는 지방간 자체를 심각하게 여기지 않아 왔다. 그러나 비 알코올성 지방간(nonalcoholic fatty liver)은 단순 지방증(simple steatosis)에서 간세포 괴사와 염증을 동반하는 비알코올성 지방
#
Corresponding Author Sang Won Park
Department of Pharmacology, Institute of Health Sciences Gyeong- sang National University School of Medicine Jinju 52727, Republic of Korea
Tel.: 055-772-8073 Fax.: 055-772-8079 E-mail:
[email protected]김소라, 제지현, 정준연은 공동 1저자로서 본 논문에 동일하게 기여하 였음.
Short Report
종설간염(nonalcoholic steatohepatitis), 섬유화에 의한 간경변증(cirrhosis) 더 나아가 간암(hepatic cancer)으로 이어지는 일련의 비알코올성 지방간 질환군에 포함되어 있다.2)따라서 지방간을 예방하고 개 선시킬 수 있는 새로운 물질 개발의 필요성이 지속적으로 강조되 고 있다.
식물은 외부 환경에 적응하고 생존하기 위해 다양한 이차 대사 체을 지속적으로 생성할 수 있으며, 이러한 대사체는 식물을 섭 취하는 인간의 건강에 도움이 될 수 있다.3)식물에서 에틸렌 (ethylene) 호르몬은 다양한 생리활성을 나타내며, 식물의 성장을 조절하는 물질이다. 에틸렌 호르몬은 식물 대사체 합성에 관여하 는 다양한 효소와 이에 대한 전사인자의 활성화를 이끌 수 있다.4) 본 연구팀은 선행연구에서 에틸렌을 처치할 경우 콩잎에서 isoflavone 함량이 급격히 증가는 결과를 확인하였다. Daidzin, genistein, malonyldaidzin 및 malonylgenistein의 함량이 모두 증 가하여 총 이소플라본함량은 에틸렌 처치에 의해 0.2 mg/g 미만 에서 24시간만에 7 mg/g 이상으로 증가하였으며 120시간까지 약 15 mg/g 이상으로 증가하였다. 또한 에틸렌을 생성하기 위해 에 테폰(ethephon)을 처치하였을 때도 유사한 결과를 나타내었다.5)
이소플라본은 17-β-estrogen과 유사한 구조의 phytoestrogen 물 질로서 estrogen receptor에 결합하여 다양한 생리활성을 나타낼 수 있다.6)이소플라본은 골다공증, 갱년기 여성장애, 심혈관 질환, 호르몬 관련 암 등 estrogen과 관련된 질환을 개선시킬 수 있는 것 으로 보고되었다.7)따라서, 본 연구에서는 이소플라본 유도체를 고 농도로 함유하도록 재배된 콩잎의 추출물이 고지방식이 동물모델 에서 체지방증가 및 지방간 발병에 개선 효과가 있는지 알아보고 자 하였다.
실험 방법
시약 및 재료
Phosphorylated AMP-activated protein kinase(AMPK), total AMPK, phosphorylated Acetyl-CoA carboxylase(ACC), total ACC, fatty acid synthase(FAS)에 대응하는 일차항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA)에서 구입하였으며, β-tubulin 에 대응하는 일차항체는 Thermo Fisher Scientific(Rockford, IL) 에서 구입하였다. 별도 표기되지 않은 시약은 Sigma-Aldrich(St.
Louis, MO)에서 구입하였다.
고지방식이 동물모델
동물실험에 대한 프로토콜은 경상대학교 동물윤리위원회의 승 인(승인번호: GNU-151006-M0054)을 받아 수행하였으며, 수컷 C57BL/6종 마우스(7주령)를 코아텍에서 구입하고 1주간 경상대 학교 의과대학 동물실험실에서 순화시켰다. 24마리의 동물을 각 각 정상식이군(ND), 고지방식이군(HFD) 및 콩잎추출물 투여 고
지방식이군(HFD+Soybean leaf) 등 실험군 당 8 마리씩으로 분 리하고 9주간 고지방식이 또는 정상식이로 사육하였다. 고지방식 이는 60% high fat diet(Dyets, Inc)를 식이하였다. 9주간 사육하 는 동안 매주 2회씩 체중과 사료섭취량을 측정하였으며, 9주간 사 육한 후 64일째에 동물을 치사시켜 혈액을 채취하고 간 조직 및 지방조직을 채취하여 무게를 측정하고 이 후 분석에 사용하였다.
콩잎추출물의 제조 및 처치
콩잎추출물은 선행연구의 방법에 따라 수확한 콩잎으로부터 제조하였다.5)즉, ‘대원콩’ 종자를 사용하여 시설재배를 통해 약 60일 동안 까투리가 맺히기 전 최대 성장 시기인 R3시기까지 재 배를 하였다. 에테폰을 250 μg/mL 농도로 약액이 흐를 정도로 충분히 24시간 간격으로 2회 살포하였다. 첫 살포 후 96시간 후 에 콩잎을 수확하여 물로 간단히 세척 후 식품건조기(35oC)에서 건조하였다. 건조시료를 분쇄한 후 시료와 정제수를 1:10 비율로 6시간 동안 100oC에서 열수추출하였다. 총 이소플라본 농도 약 1 mg/mL의 콩잎추출물은 5 mL/kg 용량으로 9주의 사육기간 동 안 매일 1회 경구로 투여하였다. 콩잎추출물의 용량은 식약처에 서 권장하는 이소플라본 일일섭취량(25-28 mg)을 기준으로 마우 스의 체표면적 지수(0.08)로 환산하였다.
조직학적 분석(Hematoxylin & Eosin 염색법)
간 조직 시료를 10% 포르말린에 24시간동안 고정시킨 후 수세 -탈수-투명-파라핀침투-포매의 조직처리과정을 거쳐 5 μm의 조직 절편 슬라이드를 제작하고 hematoxylin and eosin (HE) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)로 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
간 조직 내 중성지방 분석
간 조직 내 중성지방 함량은 균질화된 간에서 Triglyceride Colorimetric Assay kit(Cayman, Ann Arbor, MI)를 사용하여 측정 하였다.
웨스턴 블럿법(Western blot)
간 조직을 protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를 포함 하는 PIRA buffer에서 균질화한 후 원심분리(12,000 rpm, 4oC)하 여 상층액을 취하였다. Bicinchoninic acid(BCA)법으로 총 단백질 을 정량한 후 sample buffer를 넣고 100oC에서 7분간 denaturation 하여 웨스턴 블럿 시료를 준비하였다. 정량된 단백질을 동일한 농 도로 10% SDS-PAGE로 전기영동 한 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 옮기고 5% bovine serum albumin으로 1시간 blocking하였다. Phosphorylated AMP-activated protein kinase (AMPK), total AMPK, phosphorylated Acetyl-CoA carboxylase (ACC), total ACC, fatty acid synthase(FAS) 및 β-actin 단백질에 상응하는 각각의 1차 및 2차 항체를 순차적으로 반응시켰다. 각
각의 표적 단백질 발현 정도는 ECL 용액으로 반응 후 Chemi- doc(Bio-rad)으로 분석하였다.
통계분석
실험 결과는 Mean±SEM으로 나타내었으며, Dunnett’s t-test 로 실험군을 비교하고 P 값이 0.05 이하인 경우에만 통계학적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실험 결과
사료 섭취량 및 체중 증가에 대한 콩잎추출물의 효과
9주간 고지방식이를 투여하는 동안 콩잎추출물에 별다른 영향 을 나타내지 않았다. 모든 실험군은 22 g의 무게에서 사육을 시작 하였다. 고지방식이군에서 64일째 체중은 43.5±0.7 g으로 정상식 이군(28.8±0.3 g)에 비해 낮은 사료섭취량에도 체중이 현저히 증 가하였다. 콩잎추출물 투여는 고지방식이에 의한 체중 증가를 통 계적으로 유의하지 않지만, 억제하는 경향을 나타내었다(Fig. 1).
지방조직의 무게에 대한 콩잎추출물의 효과
9주간 고지방식이 또는 정상식이 투여 후 마우스를 치사시키고 내장지방(visceral adipose tissue), 피하지방(subcutaneous adipose tissue), 부고환지방(epididymal adipose tissue) 및 갈색지방(brown adipose tissue)을 분리하여 지방조직의 무게를 측정하였다. 고지 방식이군은 내장, 피하, 부고환 및 갈색지방조직의 크기와 무게가 정상식이군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 고지방식이에 의해 증가된 내장지방(1.46±0.09 g) 및 피하지방(3.66±0.18 g)의 무게 는 콩잎추출물에 의해 모두 통계적으로 유의하게 억제되었다(내 장지방 1.13±0.08 g, P<0.05; 피하지방 3.05±0.18 g, P<0.05) (Fig. 2).
간 조직 무게에 대한 콩잎추출물의 효과
9주간 고지방식이 또는 정상식이 투여 후 마우스를 치사시키 고 간 조직의 무게를 측정하고 각각 마우스의 체중 대비 간 무 게를 분석하였다. 고지방식이군은 정상식이군(1.21±0.04 g)에 비 해 유의적으로 간 조직의 무게가 증가하였으나(1.60±0.10 g, P<0.01 vs ND), 이러한 증가는 콩잎추출물 처치에 의해 유의적 으로 억제되었다(1.32±0.06 g, P<0.05 vs HFD+Vehicle). 또한 고지방식이군에서 콩잎추출물은 체중 증가를 억제하는 경향에 비해 간 조직 무게의 증가를 더욱 현저히 억제하여 체중 대비 간 무게 비율을 통계적으로 유의하게 감소시켰다(콩잎추출물 3.15±
0.08 vs 고지방식이군 3.66±0.19, P<0.05)(Fig. 3).
간 조직 내 지질축적에 대한 콩잎추출물의 효과
9주간 고지방식이 또는 정상식이를 투여한 마우스의 간 조직
을 H&E 염색을 통해 조직을 분석한 결과 고지방식이군은 정상 식이군에 비해 간 실질세포 내 지질(lipid droplet) 축적이 증가 하였으며, 콩잎추출물은 고지방식이에 의한 간 조직 실질세포의 지질축적을 현저하게 억제하였다(Fig. 4). 또한 지방간은 간조직 의 실질세포에 과도하게 중성지방이 축적된 것으로 정의된다. 따 라서 9주간 고지방식이 또는 정상식이를 투여한 마우스의 간 조 직에서 중성지방 함량을 측정하였다. 고지방식이군에서 간 조직 내 중성지방 함량은 26.3±0.8 mg/g liver로서 정상식이군의 중성 지방 함량인 10.3±0.2 mg/g liver에 비해 약 2.6배 높았다. 그러 나, 고지방식이군에서 콩잎추출물의 투여는 간세포 내 중성지방 함량의 증가를 통계적으로 유의하게 억제하였다(22.6±0.5 mg/g liver, P<0.05) (Fig. 4).
Fig. 1 − Effect of soybean leaf extract on food intake and weight gain in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf (N=8 for each group). Food intake and body weight were measured twice a week. Data are presented as the mean±SEM. *P<0.05 compared to the ND group;
#
P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group.
간 조직 내 지질합성 및 대사 조절단백질 발현에 대한 콩잎추 출물의 효과
9주간 고지방식이 또는 정상식이를 투여한 마우스의 간 조직 에서 지질합성및 지질대사 조절단백질의 발현을 분석한 결과 고 지방식이군 투여는 정상식이군은 정상식이군에 비해 지질대사 효소인 AMPK의 인산화를 증가시켰으며, 또한 지방산 생합성 효
소인 FAS의 단백질 발현을 3.9배 증가시켰다. 이는 고지방식이 에 의해 지질대사 및 지질합성이 증가하는 것으로 볼 수 있다.
고지방식이에서 콩잎추출물은 고지방식이에 의한 AMPK의 인산 화를 더욱 증가시켜 조제용매 투여군에 비해 통계적으로 유의하 게(2.8배) 높았다. 콩잎추출물은 또한 지방산 생합성 효소인 FAS 의 단백질 발현을 정상식이군 수준으로 통계적으로 유의하게 억
Fig. 2 − Effect of soybean leaf extract on fat accumulation in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for
64 days with or without Soybean leaf, and then the adipose tissues were weighed (N=8 for each group). Data are presented as the
mean±SEM. *P<0.05 compared to the ND group;
#P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group.
제하였다. 또한 고지방식이에서 조제용매 투여군은 ACC의 인산 화를 정상식이군에 비해 4.4배 증가시켰다. 콩잎추출물은 정상식 이군에 비해 ACC의 인산화를 8.1배 증가시켜 조제용매 투여군 에 비해 1.9배 높은 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다. 따라 서, 본 결과에서 콩잎추출물은 고지방식이 동안 AMPK 및 ACC 등 지질대사 효소의 활성화를 증가시키고, FAS 등 지질합성 효
소의 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 5).
고 찰
본 연구에서는 비알코올성 지방간 개선에 효과가 있을 것으로 생각되는 이소플라본 고함량 콩잎추출물에 대해 고지방식이 동
Fig. 3 − Effect of soybean leaf extract on liver weight in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for 64
days with or without Soybean leaf, and then body and liver weights were measured (N=8 for each group). Data are presented as the mean±SEM. *P<0.05 compared to the ND group;
#P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group.
Fig. 4 − Effect of soybean leaf extract on hepatic lipid droplet and triglyceride accumulation in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with
normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf, and then liver sections were stained and hepatic TG levels were
measured (N=6-8 for each group). Data are presented as the mean±SEM. *P<0.05 compared to the ND group;
#P<0.05 compared
to the HFD+Vehicle group.
물모델을 이용하여 체지방 축적 및 비알코올성 지방간 억제 효 능을 알아보았다.
비알코올성 지방간질환은 비만, 당뇨 등 대사성 질환과 밀접하 게 연관되어 있으며, 단순 지방간에서부터 만성간염, 간경변(간경 화)을 거쳐 간암으로 까지 발전할 수 있는 광범위한 영역을 포함 하는 질환이다.8)단순 지방간은 임상적으로 뚜렷한 외부증상이 나타나지 않으므로 지방간 자체를 심각하게 여기지 않고 있다.
그러나, 단순 지방간도 중증 질환인 간염, 간경변 등으로 발전할 수 있는 가능성이 있다는 면에서 중요하게 다루어야 하며, 단순 지방간은 그 원인을 제거하면 다시 정상 간으로 회복될 수 있는 가역적 단계에 있으므로 비알코올성 지방간질환의 치료를 위한 중요한 단계라고 볼 수 있다.
비알코올성 지방간의 원인은 매우 복잡하고 다양하나 주로 고 칼로리식에 의한 비만, 인슐린 저항성 증가, 지방조직 내 대사조 절 호르몬인 adiponectin의 감소, 고지방식으로 인한 혈중 지질 함량 증가 등이 원인이 되어 간세포 내 지질함량을 증가시킴으
로써 나타나는 것으로 알려져 있다.9)비알코올성 지방간에서 간 세포 내 지질 축적은 고지방식이 섭취, 혈중 FFA의 유입 증가, 세포 내 지질합성 증가 및 세포 내 지질대사 감소가 주된 원인 이다.10)따라서, 본 연구에서는 콩잎추출물의 비알코올성 지방간 억제 효능을 알아보기 위해 비만, 당뇨 등 대사성질환의 양상을 나타내는 고지방식이 동물모델에서 실험을 진행하였으며, 체지 방 및 간 조직 내 지방의 변화를 중심으로 결과를 분석하였다.
또한 간 조직의 지질대사 및 지질합성에 관여하는 효소의 변동 도 함께 분석하였다.
고지방식이는 9주에 걸쳐 정상식이에 비해 지속적으로 체중을 증가시켰으며, 내장, 피하, 부고환 및 갈색지방을 현저히 증가시 켰다. 콩잎추출물의 처치는 특히 내장지방 및 피하지방의 증가 를 유의적으로 억제하였으며, 이러한 결과는 콩잎추출물이 고지 방식이에 의한 체지방량 증가를 개선하는 효능이 있음을 명확히 보여준다. 비만에 의한 체지방 증가는 지방간을 유발하는 주요 원 인으로 알려져 있다. 지방조직의 지질은 지방산 형태로 혈중에 유
Fig. 5 − Effect of soybean leaf extract on lipolytic and lipogenic enzymes in the liver from high-fat diet-fed mice. The mice were fed with
normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf, and then the changes in protein levels were determined by
Western blot analysis (N=4 for each group). Data are presented as the mean±SEM. *P<0.05 compared to the ND group;
#P<0.05
compared to the HFD+Vehicle group.
입되며, 혈중 지방산은 cluster of differentiation 36 또는 fatty acid translocase에 의해 간세포로 유입된다. β-oxidation에 의한 지질대사가 원활하지 않으면 간세포에서 지질로 축적된다.11)본 연구에서 콩잎추출물은 간 조직에서 지질 및 중성지방의 축적을 유의적으로 억제하였으며, 콩잎추출물의 지방간 억제 효능은 비 만 및 체지방 증가 억제에 대한 효능을 통해서도 나타나는 것으 로 생각된다.
다음으로는 간세포 내 콩잎추출물의 작용기전을 알아보기 위 해 지질합성 및 지질대사 효소의 발현 및 활성화 양상을 분석하 였다. AMPK는 세포 내 대사기능의 항상성 유지와 밀접하게 관 련되어 있는 효소로서 간세포에서는 주로 콜레스테롤 합성, 지 질 합성, 중성지방 합성의 억제 및 fatty acid oxidation에 관여하 는 것으로 알려져 있다.12) AMPK의 활성화는 다양한 지질합성 효소 전사인자인 SREBP-1c의 활성화를 억제하는 것으로 알려 져 있으며, ACC의 인산화를 일으키는 상위신호전달인자이다.13) ACC는 acetyl-CoA의 비가역적 카르복시화로 malonyl-CoA를 생 성하는 효소로서 malonyl-CoA는 지방산의 생합성을 위한 전구 물질로 사용된다. AMPK에 의한 인산화로 ACC는 활성이 억제 되며, 이 때 지방산 대사는 증가하고 지질생합성은 감소한다.14) 본 연구에서 콩잎추출물은 간 조직 내 AMPK의 단백질 발현과 인산화를 증가시켰다. 콩잎추출물의 투여는 ACC의 발현을 증가 시켰으나 인산화도 증가시키는 결과를 나타내었다. 이러한 결과 는 콩잎추출물에 의한 간 조직 내 지질 및 중성지방 축적 억제 효과와 일관되는 결과이며, 콩잎추출물이 AMPK 및 ACC의 인 산화를 증가시킴으로써 지질대사를 높이고 지질합성을 억제하는 것으로 판단된다. FAS는 간세포에서 지방산 생합성의 마지막 과 정을 조절하는 효소로서 malonyl-CoA로 부터 fatty acid를 생성 한다. 본 연구에서 콩잎추출물은 FAS의 발현을 억제하는 결과를 나타내었다. 최근 연구에서 genistein과 daidzein이 당뇨병 동물 모델에서 FAS 활성을 억제하고 β-oxidation을 증가시켜 간장 내 중성지방의 축적을 억제하는 것으로 보고되었으며,15) 본 연구에 서 이소플라본 유도체가 다량 함유된 콩잎추출물이 간에서 지질 합성 및 지질대사 효소를 조절할 수 있다는 본 연구결과와 일관 성이 있다. 이러한 결과로 볼 때 본 연구에 사용된 콩잎추출물은 이소플라본 고함량 물질로서 이소플라본에 의한 에스트로겐 수 용체 자극이 주요 작용기전 중 하나로 생각되나 콩잎추출물은 또 한 다량의 필수아미노산(essential amino acid)을 함유하고 있으 므로 아미노산에 의한 효과도 함께 나타날 수 있다. 콩잎추출물 의 작용기전에 대해서는 향 후 더 많은 연구가 필요할 것으로 판 단된다.
결 론
본 논문에서는 에테폰 처리를 통해 재배된 콩잎 열수추출물의
비알코올성 지방간 억제 효능을 고지방식이 동물모델에서 평가 하였다. 콩잎추출물은 고지방식이 동물모델에서 내장지방 및 피 하지방의 축적을 억제하였으며, 간 조직의 무게 증가, 지질축적 및 중성지방의 축적을 억제하였다. 콩잎추출물은 지질대사 관련 효소인 AMPK와 ACC의 발현 및 인산화를 증가시켰으며, 지방 산 합성효소인 FAS의 발현을 억제하였다. 따라서, 이소플라본 유 도체를 함유하는 콩잎추출물은 대사성질환으로 일어나는 체지방 증가 및 비알코올성 지방간의 발병을 억제하는 효과가 있는 것 을 알 수 있다.
감사의 말씀
본 연구는 한국연구재단 선도연구센터 지원 사업(바이오항노 화 의과학연구센터, NRF-2015R1A-5A2-008833)에 의해 이루어 진 것임.
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