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전자현미경적 응용 Shadowing에 의한 핵산 사슬의 구조적 분석
광주보건대학 임상병리과
주경웅
Detection of Nucleic Acid Strand in the Electron Microscope by Modified Shadowing Procedure
Joo, Kyeng Woong
Department of Clinical Pathology, Gwangju Health College, Gwangju, Korea
Rabbit hemorrhagic disease(RHD) which was first recognized in China in 1984. Although Rabbit hemorrhagic disease virus was initially characterized as a picornavirus or a parvovirus, it is now proven to be calicivirus.
Kleinschmidt and Zahn developed a method which allows the visualization of DNA molecules as smooth, flexible filaments. In this protein monolayer technique the nucleic acid molecules bind to a protein film which results from surface denaturation of a cytochrome C at an air-water interface. The surface film is then picked up and the nucleic acid molecules are examined in the electron microscope after uranyl acetate staining and heavy metal shadowing.
This study is purposed to detection of RHD viral RNA structure by modified shadowing technique as basic procedure of Kleinschmidt and Zahn for observed to difference as ssRNA of RHD viral nucleic acids from other ssDNA on electron microscopy. I have experimented to chemical modified procedures that spreading and diffusion to 90% formamide and 0.2N NaOH denaturing agents, the signal is enhanced by silver solution before electron microscopic observation. It was appeared with effect to dense single strands of RHD viral nucleic acids
Key Words: Electron microscope, Nucleic acid strand, RHD, Shadowing technique 임상병리검사과학회지 : 35권 제2호, 170-173, 2003
1)
I. 서 론
Kleinschmidt와 Zahn에 의해 소개된(Kleinschmidt 와 Zahn, 1959) 전자현미경적 핵산연구는 핵산 원상태의 크 기와 구조를 정성 또는 정량적으로 알려주며 DNA나
교신저자 : 주경웅, (우)506-701 광주시 광산구 신창동 683-3 광주보건대학 임상병리과
Tel : 062-958-7624 E-mail : jookw@kjhc.ac.kr
RNA 분자의 실험적인 조절을 가능케 해주고 있다. 지금 까지 핵산과 단백질 관계에 대한 수많은 실험들이 행하여 지면서 핵산분석에 많은 발전을 가져왔으며, 최근 분자생 물학적인 수기가 발달하고 이를 이용한 광학현미경 수준 에서 분자병리학적인 진단이 광범위하게 응용되고 있다.
1984년 중국에서 최초로 발견된(Liu 등, 1984) 토끼출 혈증 바이러스(rabbit hemorrhagic disease virus;이하 RHDV로 약기함)는 토끼에서 급성 간 괴사와 높은 폐사
171 율을 나타내는 원인균으로서, 현재까지 RHDV의 기본 성 상 등이(Gregg 와 House, 1989) 보고된 바 있다.
RHDV의 간 조직을 유화시켜 생화학적 추출시료인 protein-free 핵산을 직접 grid 위에 얹어서 전자염색과 Shadowing을 실시하여 전자현미경으로 관찰하였다 (Kieinschmidt, 1968 ; Ferguson 등, 1978 ; Thomas 등, 1981)
본 연구에서는 Kieinschmidt 등의 기본 틀에서 90%
formamide에 의한 확산 및 0.2N NaOH로 변성, 그리고 은입자 신호처리 등 화학수식 처리를 응용하여 ssDNA로 부터 ssRNA를 보다 더 효과적으로 구별하고자 실험하였 다.
II. 재료 및 방법
1. 실험 재료
RHDV로 폐사한 5개월령의 Newzealand White 종의 12 마리 토끼로부터 얻은 신선한 각각의 간 조직 1gm을 측 량하여 petri-dish에서 chopping한 다음 lysis buffer (100mM NaCl+10mM tris buffer+25mM EDTA+0.5%
sodium dodecyl sulfate) 7.5mL를 가하여 biohomogeni- zer(Cat.1281)로 파쇄시킨 다음 60℃ 항온 수조에서 10분 간 반응시킨 후 얼음 조각에서 냉각시켰다.
2. 연구 방법
반투명의 플라스틱 petri dish 안에 grid를 두고 pipette 로 grid 위에 음전하를 띄는 시료인 RHDV RNA와 cytochrome C(90% Formamide, 10mM EDTA, 100mM Tris-HCl pH 8.5, 70μg/mL cytochrome C)를 사용 전에 hypophase 용액(50% Formamide, 1mM EDTA, 10mM Tris-HCl pH 8.5) 혼합하여 희석 염류용액의 표면에 경사 지게 하면서 분산시키고, 확산에 의해 표면막을 형성시켰 다. 여과지로 여액을 제거한 후, Uranyl acetate 37℃에서 7분 염색하고 90% formamide 그리고 0.2N NaOH처리 후 grid 위에서 platinum-palladium(Pt-Pd)으로 shadowing하 여 은입자 강화반응 후 투과전자현미경(JEM-100, CX, JEOL)으로 가속전압 80kV 하에서 40,000×로 관찰하고 사진 촬영하였다.
Fig. 1. Double stranded RHDV replicative form ssRNA(a, arrow) spread by the aqueous protein monolayer technique is as well extended as double stranded ssDNA(b, arrow). Single stranded RNA shown in the insert appears as a collapsed bush because of random base interactions. The preparation was shadowed with 90% formamide and 0.2N NaOH denaturing agents. Original magnification 40,000×.
III. 결 과
생화학적으로 추출된 시료를 직접 grid 위에 얹어서 Kleinschmidt와 Zahn 원법을 응용한 shadowing을 실시하 였다. 분산이나 변성시키는 방법에 따라 ssRNA의 전자현 미경 관찰에서와 사진과 같이 RNA의 특징에 많은 차이 를 가져 왔다. 고농도의 변성제 처리로 2차 구조의 특징 이 double-hairpin 고리를 가진 고리 그리고 뿌리구조의 ssDNA와 ssRNA가 구별되었다(Fig. 1).
IV. 고 찰
RHDV의 genome은 약 8kb 정도되는 positive stranded RNA로 약 2.4kb의 subgenomic RNA가 virion에 포함되어
172 있는 것으로 알려졌다. 이 subgenomic RNA는 약 60kd 크 기의 single 바이러스성 capsid 단백질을 형성하는 RHDV 의 주요 구성분으로 밝혀졌다(Boga 등, 1993). 현재까지 RHDV의 기본 성상, 병리임상학적 특성, 임상화학적특성, 예방 목적의 백신, 적혈구응집 및 응집억제 반응 등이 보 고된 바 있다(Cao 등, 1986 ; Wei 등, 1987).
본 연구에서는 Kleinschmidt와 Zahn 기법(Kleinschmidt 와 Zahn, 1959),을 기본틀로 하여 RHDV의 간 조직을 유 화시켜 생화학적 추출시료인 protein-free 핵산을 직접 grid 위에 얹어서 전자염색과 shadowing 처리하여 전자현 미경으로 관찰하였다. ssDNA로부터 구별을 위한 일반적 으로 사용하는 80% 정도 농도 비해 높은 90% formamide 의 농도와 0.2N NaOH 그리고 휘도 증가를 위한 은입자 등을 시험적으로 응용 처리함으로써 핵산과 관련된 발현 과 구조, 나아가 화학 조성을 보다 더 효과적으로 관찰할 수 있었다. 또한 분산과 확산을 단계적으로 실시하는 경 우와 분산과 확산을 동시 실시해 보았지만 유의할 만한 의의는 없었다.
실험과정에서 모든 시약은 증류수로 만들었고 유리병 에 보관하였으며, 사용 전에 실온으로 되게 하였다. 먼지 나 침전물등 작은 입자는 표본을 전자현미경으로 관찰 시 에 돌출되어 보인다고 한다(Moore, 1981). 이런 문제를 없애기 위해 용액을 여과시키거나 재 제조하여 사용하였 다. Ethanol과 같은 용액은 hydrophobic Milliphore Dura- pore filter(type GVHP)와 같은 0.22μm filter, 수용액은 wetting agent를 제거하기 위해 사용하기 전 증류수로 잘 세척된 MF-Millipore(type GSWF) 또는 Triton free filter(type GSTF)를 사용하여 여과시켜 주었다(Oudet 등, 1985). 분산은 깨끗하고 진동이 없는 실험 장소에서 Teflon 코팅된 dish와 산으로 처리된 유리 glass 및 talcum powder로 시행하였다. 소용돌이 모양의 DNA-단백 단층 이 되는 원인을 없애기 위해서 후드 안에서 조작하였다.
실온이 20～25℃로 습기가 높은 실험실에서는 좋지 않은 결과를 얻을 수 있고, 시약과 기구의 청결 또한 매우 중요 하다(Oudet 등, 1985). DNA- protein monolayer의 연결이 세척제, oil, grease와 같은 계면활성제로 파괴될 수 있기 때문에 직접 또는 간접적으로 기구나 시약의 오염을 최대 한 배제하였으며. 유기용매의 기체, 펌프로부터의 oil 증 기가 결과에 영향을 줄 수 있기 때문에 손가락으로부터의 grease가 묻거나 표본에 접촉되지 않도록 하였다.
Kleinschmidt-Zahn 기법은 핵산의 전자현미경 관찰을 위한 표본제작에서 간편하고, 신속하며, 신뢰할 수 있는
방법이다. 음전하를 띄는 DNA 또는 RNA와 기본 단백인 cytochrome C를 혼합하여 물이나 또는 희석 염류용액의 표면에 경사지게 하면서 분산시킨다. 분산은 파라필름에 시료액을 한 방울 놓고 그 속에 grid를 핀셋으로 삽입하 여 그 주위여액을 여과지로 흡수한 후 petri dish 안에 grid를 두고 pipette로 grid 위에 시료를 놓는다. 그리고 확 산에 의해 표면막이 형성되도록 시행하였다. 여과지로 여 액을 흡수한 후 건조시키면, 핵산분자들은 변성단백 필름 표면에 극성군은 물 쪽에, 비극성군은 공기 쪽에 두 분획 으로 구성되어 보전되었다. 핵산-단백착물은 비극성군과 소수성인 관계로 전자현미경 grid의 지지막에 흡착된다.
약간의 바이러스들에서 dsRNA가 발견되지만 대부분 RNA 분자들은 단일쇄이다. 염기 상호작용이 dsDNA보다 는 ssRNA가 더 강하기 때문에 분자간 그리고 분자내 상 호작용이 일반적으로 보다 더 안정하다. 약간 비특이적으 로 나타나지만 RNA는 보다 더 안정하고 2차 구조 특징 이 일관되게 형성된다. 이들은 구조적 또는 기능적 역할 이 표현되며 RNA에 관한 증명과 자세한 정보를 얻을 수 있다. 만약 RNA 길이를 측정할 수 없다면 short duplex region이 변성되어야 한다. 그러므로 비특이적인 염기쌍 의 제거가 항상 필요하지만 때때로 보다 강한 상호작용을 하고 있는 경우가 있다. 많은 연구보고서에 의하면 이와 같은 현상은 분자크기와 2차 구조에 관한 정보가 많은 차 이가 나는 것으로 밝혀지고 있다(Weber 등, 1975 ; Heme 등, 1980 ; Meyer, 1989).
본 실험은 기존 shadowing방법을 분산과 확산과정 등 에서 응용된 화학수식으로 실험한 것이다. 일반적으로 사 용되는 농도보다 더 고농도의 formamide와 변성제를 분 산용액에 추가하여 dsDNA와 구별을 효율적으로 할 수 있었다.
V. 결 론
RHDV의 간 조직을 유화시켜 얻은 생화학적 추출시료 인 protein-free 핵산을 직접 grid 위에 얹어서 Kleinsch- midt와 Zahn의 기본틀을 응용한 화학수식 처리 후 전자 염색과 shadowing법을 실험한 결과 보다 효율적으로 핵 산 구조를 관찰할 수 있었다.
1. 90% formamide와 0.2N NaOH처리로 RHDV ssRNA 를 ssDNA로 부터 효과적으로 구별할 수 있었다.
2. 흡착된 착물이 은강화 염색으로 휘도가 증가되었다.
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