제한효소질량다형법을 이용한 인유두종바이러스 유전형 검사법의 임상적 유효성
이은희1․이규범2․김은옥1․지승일3․신수경3․이한성3․심수연3․김수옥3․홍선표3
녹십자의료재단 진단검사의학과1, 녹십자의료재단 진단병리과2, (주)진매트릭스 중앙연구소3
Clinical Effectiveness of Restriction Fragment Mass Polymorphism Assay for Human Papillomavirus Genotyping
Eun Hee Lee1, Kyu Bum Lee2, Eun Ok Kim1, Seung Il Ji3, Soo-Kyung Shin3, Han Seong Lee3, Soo Yeon Shim3, Soo-Ok Kim3, and Sun Pyo Hong3
Department of Laboratory Medicine1 and Department of Pathology2, Green Cross Reference Laboratory;
R&D Center, GeneMatrix Inc3., Yongin, Korea
Background: Human papillomavirus (HPV) infection is the main cause of cervical cancer and with the advent of genotype specific vaccines, there is increased need for accurate, broad-spectrum and high-throughput methods for HPV genotyping. A MALDI-TOF mass spectrometry (MS)-based restriction fragment mass polymorphism (RFMP) assay has proven to accurately and reliably genotype a wide variety of HPV.
Methods: We evaluated the clinical utility of the RFMP assay in HPV genotyping by testing a total of 2,689 specimens taken from liquid-based cytology, which was composed of normal cytology, atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), low grade squamous intraepithelial lesion (LSIL), high grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) and invasive squamous cervical cancer (SCC).
Results: Overall HPV positive rate of total specimens was 32.5% and the high-risk positivity was 16.4%. The HPV positive rates were increased as increasing severity level of cervical lesion.
Predominant high-risk HPV genotypes were found as following order; 52 (18.6%), 16 (13.7%), 18 (3.8%), 58 (3.4%), 56 (2.6%) and 31 (2.5%). The high-risk HPV positivities according to cytologic diagnosis were 10.7% (238/2229), 31.7% (76/240), 50.0% (88/176), 86.0% (37/43), 100% (1/1) in normal, ASCUS, LSIL, HSIL and SCC subgroups, respectively. The concordance rate and Kappa value between sequencing and RFMP assays were 96.6% and 0.932 (95%CI: 0.908-0.956).
Conclusions: The RFMP HPV genotyping assays showed high concordance with sequencing.
The assay is simple, and can accurately detect and identify HPV genotypes in samples with various levels of cytological lesions. The results demonstrated that RFMP assay should be clinically suitable for HPV genotyping in laboratories.
Key Words：FMP, HPV Genotyping, Clinical effectiveness
교신저자：이은희
우) 446-913 경기도 용인시 기흥구 보정동 314번지 녹십자의료재단 진단검사의학과
전화：031)260-9201, FAX：031)260-9087 E-mail：[email protected]
서 론
인유두종바이러스(human papilloma virus, HPV) 감 염은 자궁경부암의 주요 원인으로서, 최근에 특이 유전형에 효과적인 백신이 출시됨에 따라 대량의 검체에서 다양한 HPV 유전형을 정확하게 진단해 낼 수 있는 HPV 유전형
검사법에 대한 임상적 수요가 증가하고 있다[1-5]. 현재까 지 100 여종 이상의 HPV 유전형이 동정되었으며, 이중 대략 40여종이 자궁 질부에 감염된다고 알려져 있으며, 이 는 다시 주로 생식기 사마귀에서 발견되는 저위험군 (low-risk types), 침윤성 자궁경부암 발병과 연관되어 있 는 고위험군(high-risk types), 그리고 역학적으로 확립되 어 있지 않지만 자궁경부암 발병과 연관성이 보고되고 있는 잠재 고위험군(probable high-risk types)으로 분류된다[6,7].
HPV 유전자형 검사를 자궁경부암 선별 검사의 일부로 포 함시킴으로써 자궁경부암 발병 가능성이 높거나 불분명한 세포학적 이상 소견을 보인 여성을 진단하는데 임상적으로 도움이 된다는 연구 결과가 꾸준히 보고되고 있어 향후 HPV 유전형 검사의 임상적 중요성이 더욱 부각될 것으로 기대된다[8,9].
제한효소질량다형법(restriction fragment mass poly- morphism, RFMP)은 유전자 염기는 고유한 질량을 갖고 염기 변이는 질량 변화를 유발한다는 원리에 착안하여, PCR 후에 바이러스 유전형을 결정 짓는 유전자 부위를 TypeIIS 제한효소로 절단하고, 절단된 올리고머들의 질량 을 측정함으로써 바이러스의 유전형을 결정하는 방법이다 [10]. PCR 증폭물(amplicon)의 유전형에 특이하며 형광 이나 동위원소로 표지된 프라이머나 프로브 DNA로 혼성화 하고 혼성화 여부로 유전형을 파악하는 기존 방법과 상이하 게, RFMP 진단법은 유전형 결정 부위를 직접 잘라내서 분석한다는 점에서 정확하며, DNA의 이중 나선을 모두 분 석하고, 표적으로 사용되는 유전자가 증폭되지 않을 경우 예상되는 질량값에서 벗어나므로 질량 분석과 동시에 PCR 반응의 특이성을 검증할 수 있다는 점에서 검사에서 신뢰도 높은 결과를 얻을 수 있다고 보고되고 있다[10,11]. RFMP 진단법은 HPV 유전형 진단 외에도 항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스 유전형, C형 간염 바이러스 유전형, 인간 유 전체 변이 등의 정확하고 신뢰도 높은 진단에 유용함이 밝 혀져 왔다[12-14,17-21,23]. 본 연구에서는 자궁경부암 세포 진검사(Pap smear)에서 다양한 병변 단계로 진단된 검체군 을 대상으로 RFMP법을 이용한 HPV 유전형 검사를 시행함 으로써, 병변 단계별 HPV의 감염 비율, 고위험군 감염 비율 을 확인하고, 염기서열법과의 일치율을 평가하여, RFMP법 을 이용한 HPV 유전형 검사의 임상적 유효성을 검증하려 고 했다.
재료 및 방법 1. 연구 대상
본 연구에 사용된 자궁경부 세포 표본은 세포진검사 (liquid-based Pap smear)를 위해 녹십자의료재단에 보내진 PreservCyt (Cytyc corporation, Marlborough, MA, USA) 검
체 중 세포 검사 후 남은 검체를 사용하였다. 세포진단은 새 로운 Bethesda system에 따라 정상, 미확정 비정형 편평세포 (atypical squamous cells of undetermined significance, ASCUS), 경증 자궁경부 이형성증(low grade squamous intraepithelial lesion, LSIL), 중증 자궁경부 이형성증(high grade squamous intraepithelial lesion HSIL), 자궁경부암 (invasive squamous cervical cancer, SCC)으로 분류되었다.
검체의 총 수는 2,689개였으며 세포진단에 따른 각 검체는 정 상 2,229개, 미확정 비정형 편평세포 240개, 경증 자궁경부 이 형성증 176개, 중증 자궁경부 이형성증 43개, 자궁경부암 1개 였다.
2. DNA 추출
자궁경부 세포 표본으로부터의 DNA 추출은 Qiagen사 의 QIAamp® DNA Blood Mini kit (Cat.No.51106) (Qiagen, Hilden, Germany)를 제조사의 매뉴얼을 준수 하여 시행하였다. Kwok과 Higuchi의 가이드라인을 준수 하여 위양성을 방지하였다[25].
3. RFMP법을 이용한 HPV 유전자형 분석
추출된 DNA로부터, 보고된 RFMP법을 이용하여 HPV 유전형 분석을 시행하였다 [20,21,24]. 실험 과정을 간략하게 기술하면, 중합효소연쇄반응은 4 μL의 자궁경부 DNA, 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP, 2 mM MgSO4, 양방향 프라이머 각각 0.4 μM, Platinum Taq polymerase (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)을 포함하 는 18 μL의 반응물을 이용하였다. PCR은 94℃에서 5분간 초기 변성을 시킨 후, 94℃에서 15초, 60℃에서 15초, 72℃
에서 30초씩 40회 반복하였다. 그 후 2차 중합효소연쇄반응 은 순방향 HPV-RFMP F, 5′-GCMCAGGGHCAYAAGGATG- AATGG-3′; M=A/C, H=A/C/T, Y=C/T (nucleotide number 6584-6603), 역방향 HPV-RFMP R, 5′-GTACTDCKDGTRGT- ATCHACMACGGATGTAACAAA-3′; D=A/ G/T, K=G/T, R=A/G (nucleotide number 6657- 6626)를 사용하여 PCR을 시 행하였다. 2차 중합효소연쇄반응의 반응물은 프라이머와 1차 중합효소연쇄반응에서의 생산물을 1/20로 희석하여 사용하 는 것을 제외하면 1차 중합효소연쇄반응의 반응물을 사용하 여 동일한 방법으로 검사하였다. PCR 조건은 annealing 온 도 45℃를 제외하면 1차 PCR의 조건과 동일하였다. HPV16 whole genome (ATCC 45113D)과 증류수를 각각 양성대조 군과 음성대조군으로 사용하였다. PCR 산물의 제한효소 절 단은 50 mM potassium acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM dithiothreitol과 각각 1 unit 의 FokⅠ과 BtsCI이 포함된 buffer 10 μL와 PCR reaction mixtures를 반응시켜 진행하였다. 이 reaction mixtures는
Table 1. Prevalence of high-risk HPV genotypes based on cytologic diagnosis
RFMP Result
Cytology Result Normal
(total)
Normal (inflammation-)
Normal
(inflammation+) ASCUS LGSIL HGSIL SCC
(n=2689) (n=2229) (n=805) (n=1424) (n=240) (n=176) (n=43) (n=1)
High risk 238
(10.7%)
60 (7.5%)
178 (12.5%)
76 (31.7%)
88 (50.0%)
37 (86.0%)
1 (100%) Probable high risk 48
(2.2%)
15 (1.9%)
33 (2.3%)
13 (5.4%)
22 (12.5%)
3 (7.0%)
0 (0.0%)
Low risk 135
(6.1%)
44 (5.5%)
91 (6.4%)
30 (12.5%)
17 (9.7%)
0 (0.0%)
0 (0.0%)
Unassigned 128
(5.7%)
43 (5.3%)
85 (6.0%)
16 (6.7%)
22 (12.5%)
0 (0.0%)
0 (0.0%)
HPV Negative 1680
(75.4%)
643 (79.9%)
1037 (72.8%)
105 (43.8%)
27 (15.3%)
3 (7.0%)
0 (0.0%) 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 제한효소 절단산물을
Oasis® µElution Plates (Waters Co., Milford, MA, USA)를 이용하여 진공여과(vacuum filtration)하였다. 진공이 부하된 상태에서 각 well을 1 M triethylammoninumacetate (TEAA, pH 7.6) 90 L로 equilibration하였다. Desalted reaction mixture를 15 mg/mL 3-hydroxy picolinic acid, 0.023 M ammonium citrate, 12% acetonitrile을 함유한 matrix solution과 재현탁한 후 3 μL을 384-well anchorchip plate (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA)에 점적하였 다. Mass spectra는 337 nm nitrogen laser와 1.25 m의 nominal ion flight path length가 장비된 Biflex Ⅳ linear MALDI-TOF MS workstation (Bruker Daltonics)을 이용 하여 얻었다. 얻어진 각 질량 값을 유전자형 별로 예상되는 질량 패턴과 비교하여 HPV 유전형을 결정하였다[24].
4. 염기서열분석법을 이용한 HPV 유전형 분석
HPV DNA는 L1 일치 프라이머의 2개의 non- degenerate pools로 이루어진 PGMY09/11로 증폭하였 다[26]. 중합효소연쇄반응의 증폭은 4μL의 자궁경부 DNA, 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 0.2 mM dNTP, 2 mM MgSO4, 양방향 프라이머 각각 0.4 μ M, Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen) 1 unit을 포함한 reaction mixture 18 μL로 하였다. PCR 은 94℃에서 15초, 60℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 회 반복하였다. 증폭산물은 Qiaquick PCR purification Kit (Qiagen)를 이용하여 제조사의 방법대로 정제하였다.
Purified PCR 산물은 5 pmol의 PGMY09/11 primers 를 이용하여 BigDye terminator v3.1 Cycle Sequenc- ing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 ABI prism model 3100 DNA sequencer
(Applied Biosystems)에 의해 염기서열 분석을 시행하였 다. Los Alamos National Laboratories HPV Database (http://hpv-web.lanl.gov)의 HPV reference sequence를 참 고하여 HPV 유전형을 결정하였다[24].
5. 통계학적 분석
통계 처리는 SAS 통계 패키지 version 8 (SAS Instit ute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였다. 각 군별로 RFMP 와 sequencing 결과의 유의성을 Mantel- Haenszel 카이제 곱 검정법, Cochen의 Kappa 일치도 검정법 등으로 분석하 였으며, P값이 0.05 이하인 경우를 유의한 것으로 간주하였 다.
결 과
1. 세포학적 병기별 RFMP 법의 HPV 유전형 결과 전체 시료 2,689개 중 HPV 양성율은 32.5% (874/ 2689) 였고, 고위험군 HPV 양성율은 16.4% (440/2,689)였다. 병기 별 고위험군 HPV 양성율은 정상군 10.7% (238/2229), ASCUS 31.7% (76/240), LSIL 50.0% (88/176), HSIL 86.0%
(37/43), SCC 100% (1/1)로서, 병기가 진행될수록 고위험군 HPV 감염율이 현저히 높았다(P<0.05) (Table 1). 정상군 내에서도 염증 소견이 없는 경우보다 있는 경우가 고위험군 감염 비율이 7.5% 대비 12.5%로 높았고, HPV 53, 66, 13형 과 같은 잠재 고위험군도 고위험군과 마찬가지로 병의 악화 정도와 감염 비율의 순비례 관계가 관찰되었다. HPV 유전 형 분포는 52형 18.6%, 16형 13.7%, 53형 6.8%, 미결정 유 전자형 (unassigned HPV type) 9.7%, 62형 4.8%, 81형 4.1%, 18형 3.8%, 44형 3.6%, 58형 3.4%, 66형 3.0%, 56형
(A)
(B)
Fig. 1. Overall HPV (A) and high-risk type HPV (B) distribution.
2.6%로 나타났고, 고위험군만을 고려했을 때는 52형 (36.7%), 16형 (27.0%), 18형 (7.4%), 58형 (6.8%), 56형 (5.2%) 순으로 나타났다(Fig. 1). 유전자형이 확립되지 않은 HPV 양성은 미결정 유전자형(unassigned type)으로 분류했 다[33].
2. RFMP와 염기서열법과의 일치율
HPV 양성을 보인 874명을 염기서열법으로 분석하여 RFMP법으로 분석된 유전형과 비교해본 결과, 전체 환자
874명 중 불일치하는 경우가 28개(3.2%)였고, 유전형별 결과가 불일치하는 경우를 정리하여, 카이제곱 검정법을 통 해 확인하였을 때, 불일치 경우와 특이하게 통계적 연관성 을 보이는 유전형은 발견되지 않았다(Table 2). RFMP법 의 HPV 유전자형 진단의 정확성을 확인하기 위해 염기서 열법과 비교한 결과, RFMP법과 염기서열법의 일치율과 Kappa 값은 각각 96.8%, 0.932 (95%CI: 0.908- 0.956)였다 (Table 2, Fig. 2).
Table 2. HPV types detected by RFMP and sequencing in all HPV positive samples with focus on discrepant results
HPV Type RFMP Sequencing No. of discordant
results
No. % No. %
52 163 18.6% 160 18.3% 3
16 120 13.7% 118 13.5% 2
53 60 6.8% 59 6.8% 1
62 42 4.8% 43 4.9% 1
81 36 4.1% 36 4.1% 0
18 33 3.8% 34 3.9% 1
44 32 3.6% 34 3.9% 2
58 30 3.4% 34 3.9% 4
66 26 3.0% 25 2.9% 1
56 23 2.6% 22 2.5% 1
31 22 2.5% 24 2.7% 2
43 21 2.4% 21 2.4% 0
55 19 2.2% 19 2.2% 0
6 17 1.9% 16 1.8% 1
30 16 1.8% 17 1.9% 1
51 16 1.8% 17 1.9% 1
61 14 1.8% 13 1.5% 1
72 12 1.6% 12 1.4% 0
11 11 1.3% 11 1.3% 0
35 11 1.3% 11 1.3% 0
84 11 1.3% 10 1.1% 1
45 10 1.1% 11 1.3% 1
40 9 1.0% 9 1.0% 0
90 9 1.0% 8 0.9% 1
33 7 0.8% 6 0.7% 1
68 6 0.7% 7 0.8% 1
74 4 0.5% 4 0.5% 0
54 2 0.2% 2 0.2% 0
82 2 0.2% 2 0.2% 0
83 2 0.2% 2 0.2% 0
89 2 0.2% 2 0.2% 0
39 1 0.1% 1 0.1% 0
Unassigned 85 9.7% 84 9.6% 1
HPV positive 874 100.0% 874 100.0% 28
Fig. 2. RFMP and sequencing results of patient samples infected with HPV genotype 58 (belonging to high risk group) and HPV genotype 66 (belonging to low risk group). X and y axes represent relative peak intensity (r.i.) and mass-to-charge ratio (m/z), respectively.
고 찰
현재 HPV는 자궁경부암 발생에 있어서 가장 중요한 원 인은 바이러스로 보고되고 있다. 즉 자궁경부암의 90% 이 상과 자궁경부암의 전구병변(cervical intraepithelial neoplasias)에서 고위험군 HPV 유전형의 감염이 발견되 고, 고위험군 HPV 유전형이 검출되는 병변은 그렇지 않은 병변에 비해 암으로의 진행이 잘 된다는 사실이 보고 되고 있다[1]. 이러한 관점에서 현재까지 많은 기초 및 역학적 연구들에서 HPV 감염이 자궁경부암의 직접적인 발암 원인 으로 규명되었으며, HPV 감염의 검출과 감염 진행성에 대 해 모니터링함으로서 자궁경부암 예방을 위한 검사로서 HPV 유전자형 검사를 이용되는 것은 매우 당연하다고 할 수 있다.
자궁경부암은 대부분 발생초기에 자궁경부 상피세포에 이형성변화가 선행되어 서서히 진행되며 이러한 변화를 유 발하는 직접적인 인자로서 기저층을 제외한 모든 표피층의 증식과 동반되고 가시세포증(acanthosis), 이상각화증(pa- rakeratosis), 그리고 각화 과다증(hyperkeratosis)등을 유발하므로, 자궁경부암 발생에 중요한 원인인 바이러스 유 전자형과 세포분석학적 결과의 연관성에 대한 연구는 매우 중요한 의미를 지닌다. 또한 같은 고위험군 HPV 유전형의 지속적인 감염은 대체로 중증의 이형성증 및 최종적으로는 자궁경부암으로 발전하기 위한 위험도가 증가하므로, 보다 나은 질병과정을 예측하고 최적의 모니터링을 위해 정확한 HPV 유전형 식별의 필요성은 진단의 유효성 측면에서 세 포분석학적 결과와 차별화된 중요한 의미를 지닌다.
본 연구에서는 자궁경부 세포진검진을 받은 여성 2,689명 을 대상으로 (1) MALDI-TOF MS에 기반한 RFMP- HPV 유전자형검사와 유전자서열 분석법의 결과 일치도를 비교 분석하였으며, (2) 한국여성의 HPV 감염에 있어서의 HPV 감염 유병율 및 유전형 분포를 평가하였다. (3) 또한 한국 여성을 대상으로 HPV 감염 여부와 기존의 세포진검사, RFMP-HPV 유전자형검사 두 방법들 간의 집단검진에서의 연관성을 비교하였다.
일반적으로 말디토프 질량분석(MALDI-TOF MS)을 이 용한 분석시스템은 검출하고자 하는 분석물질(analyte)의 고유 질량을 측정함으로써, 유전체학(genomics), 단백질체 학(proteomics) 및 진단(diagnostics) 분야 등 다양한 생 물과학 분야에서 정확성이 장점으로 보고 된 바 있다 [10-21]. MALDI-TOF MS를 이용한 유전자 분석 기법 은 유전자 증폭 이후, 간접적으로 교잡 반응에 의한 신호 분석 없이, MALDI-TOF 이온화 과정을 거쳐, DNA가 진 공관에서 날아가는 속도 차이로 염기서열을 알아내는 것에 직접분석방식에 근간한다. MALDI-TOF MS를 이용한 유 전자 분석 기법으로 최근 개발된 RFMP법은 유전자 서열 을 이루는 4개의 염기가 고유한 질량 값을 가진다는 점에 착안하여(A=331.2, C=307.2, G=347.2, T=322.2), 유전자 내 변이가 밀집한 부위(genotype-specific motifs)를 직접 절단 해 내고, 조각난 유전자 절편(genotype- diagnostic fragments)의 질량을 측정함으로써 유전자형을 파악하는 범 용적 기술로서 MALDI-TOF MS 분석의 특성상 탁월한 정 확도, 민감도, 대용량 처리능력 및 변이간 연관성을 분석할 수 있는 등의 장점이 잘 알려져 있다[10-14]. 또한 복수의
유전자형을 진단함에 있어 바이러스의 혼합 감염을 정량적 으로 진단할 수 있으므로, 그 임상적 응용성이 높아 간염 바이러스(HBV, HCV) 진단 분야에서 이미 차세대 유망 신 기술로서 평가된 바 있으며, 다기관임상 실험에서 유전자 서열 분석을 표준법으로 하여 분석하였을 때, 다른 분석법 에 비해 가장 높은 일치도를 보이는 것으로 알려진 바 있다 [16-21].
RFMP-HPV 유전형 검사법을 적용한 유전형 분석 평가 는 2,689례의 임상 검체를 이용하여 수행하였으며, 본 연 구에서는 그 중 HPV 양성을 보인 874명을 염기서열분석 법과 비교하여 임상적 성능을 평가하였다. 염기서열법과 RFMP 법을 비교 하여 유전형 분석 결과, 전체 환자 874 명의 일치율은 96.8% (846/874)이고, Kappa 값은 0.932 (95% CI 0.908-0.956)이었다. 또한, 유전형별 결 과가 불일치하는 경우를 카이제곱 검정법을 통해 확인하였 을 때, 특이하게 통계적 연관성을 보이는 유전형은 발견되 지 않았다.
검사의 판독에 있어서는 RFMP법이 염기서열분석법보다 signal 판독의 정확성과 편의성을 나타내었으며, 염기서열 분석법보다 하나 이상의 HPV 유전형이 나타나는 중복감염 검출율이 높은 것으로 분석되었다. 연구자 별로 중복감염에 대한 역학조사는 발견되는 비율이 10-30%로 다소 다양하 게 나타나는데[30-31], 일반적으로 바이러스 검사법으로서 MALDI-TOF 기반 RFMP 검사법은 기존검사법과 달리 혼합 감염시의 바이러스의 상대량 비교가 가능한 것이 중요 한 장점으로 보고되는 바[24], MALDI-TOF을 원리로 하는 RFMP-HPV 검사법은 아직 알려지지 않은 HPV의 중복 감 염 기전에 대한 중요한 연구 방법 및 자료를 제시 할 것으 로 사료된다.
본 연구에서는 한국여성의 HPV 양성율 32.5%로서, 기 존 연구 보고와 유사한 경향을 보이는 것으로 사료된다. 한 국여성의 HPV 유전형 분포는 52형 18.6%, 16형 13.7%, 53형 6.8%, 62형 4.8%, 81형 4.1%, 18형 3.8%, 44형 3.6%, 58형 3.4%, 66형 3.0%, 56형 2.5%로 나타났고, 고위험군 만을 고려했을 때는 52형 (36.7%), 16형(27.0%), 18형(7.4%), 58형(6.8%), 56 형(5.2%) 순으로 나타났다. 일반적으로 HPV-16, -18형 이 자궁경부암과 가장 밀접하게 연관되어 있다고 알려져있 다. 그러나 HPV 아형의 분포도는 지역별로 많은 차이를 나타내는 것으로 보고되고 있다. 즉 미국의 경우 HPV-16, -18형의 감염율이 높은 반면, 일본 여성의 경우 HPV 감염 율이 3.3 %로서 그 중 16형이 가장 놓은 빈도를 차지하 고, 18형보다도 HPV-31, -33, -35, 52, 58형이 높은 빈 도로 감염 된 것으로 보고 된 바 있다. 한국여성을 대상으 로 한 본 연구에서는, 52형(18.6%), 16형(13.7%), 53형 (6.8%), 62형(4.8%) 순위의 감염률을 나타내었는데, Oh 등[32]이 보고한 자궁경부암 경험이 없는 일반인 여성을
대상으로 진행한 HPV 유전자형 분포인 52형(19.8%), 39 형(14.0%), 58형(15.6%), 16형(12.8%)의 결과와 비교 하여 본 연구의 HPV 감염율에 있어 16형, 18형 외에도 52형의 고위험군 바이러스 감염사례가 많다는 것은 주목할 만한 사실이다. 따라서 우리나라의 경우 향후 백신접종을 실시함에 있어 한국여성의 유전형에 따른 감염빈도는 보다 자세한 역학 연구를 통해 조사되어야 할 것으로 사료된다.
또한 본 연구에서는 세포적 진단과 연관하여 고위험군 감염 양성율을 비교 분석하였다. 전체 시료 2,689개 중 병 기가 진행될수록, 고위험군 HPV 감염율이 현저히 높았다 (P<0.05) (Table 1). 또한 정상군 내에서도 염증 소견이 없는 경우보다 있는 경우가 고위험군 감염 비율이 높았고, HPV 53, 66, 13형과 같은 잠재 고위험군도 고위험군과 마찬가지로 병의 악화 정도와 감염 비율의 순비례 관계가 관찰되었다. 즉 RFMP-HPV검사법은 다른 연구와 같이 세 포적 진단의 심각성 등급의 증가와 비례하여 고위험군 HPV의 감염례가 증가하는 결과를 나타냈다[27-29]. 전체 2,689개의 시료 중, HGSIL (CIN2) 이상의 비율은 1.4%
(38/2,689) 였고, RFMP-HPV 유전형 검사에 의한 고위험군 HPV 양성율은 16.4% (440/2,689)였다. HGSIL 이상의 세포 진 검사 소견의 시료 44개 중, RFMP-HPV 유전형 검사의 의한 고위험군 HPV 양성율은 86.4% (38/ 44) 였고, 잠재 고위험군 HPV를 포함시킬 경우, 93.2% (41/44)였다.
결론적으로, 본 연구에서는 RFMP-HPV 유전형검사를 통해 자궁경부암 병기별로 한국여성의 HPV 감염 및 유전 형의 분포도를 제공하여 향후 자궁경부암의 진단 및 치료에 도움이 될 것으로 사료된다. RFMP-HPV 유전형검사는 대 량 검사와 객관적 판독이 가능하고 정확하며, 기존의 세포 진 검사를 보완하고, 자궁경부암에 대한 예민도를 증가시킴 으로써 전암 병소 및 자궁경부암의 조기 진단에 매우 유용 한 방법으로 사료된다.
요 약
배경: 인유두종바이러스(human pallilomavirus, HPV) 감염 은 자궁경부암의 주요 원인으로서, 최근에 특이 유전형에 효과적인 백신이 출시됨에 따라 대량의 검체에서 다양한 HPV 유전형을 정확하게 진단해 낼 수 있는 HPV 유전형 검사법에 대한 임상적 수요가 증가하고 있다. HPV 유전형 진단 외에도 항바이러스제 내성 B형 간염 바이러스 유전형, C형 간염 바이러스 유전형, 인간 유전체 변이등의 정확하고 신뢰도 높은 진단에 유용함이 밝혀져 왔다.
방법: 액체세포진 검사 결과 정상 2229개, 미확정 비정형 편평세포(atypical squamous cells of undetermined significance, ASCUS) 240개(33.1%), 경증 자궁경부 이형성 증(low grade squamous intraepithelial lesion, LSIL) 176개, 중증 자궁경부 이형성증(high grade squamous intraepithelial
lesion HSIL) 43개, 자궁경부암(invasive squamous cervical cancer, SCC) 1개로 구성된 총 검체 2,689개를 대상으로 제 한효소질량다형법(restriction fragment mass polymorphism, RFMP)법을 이용한 HPV 유전형 검사를 시행함으로써, 병변 단계별 HPV의 감염 비율, 고위험군 감염 비율을 확인하고, 염기서열법과의 일치율을 평가하여, RFMP법을 이용한 HPV 유전형 검사의 임상적 유용성을 검증하려고 했다.
결과: 전체 시료 2,689개 중 HPV 양성율은 32.5%
(874/2689)였고, 고위험군 HPV 양성률은 16.4% (440/ 2689) 였다. 병기별 고위험군 HPV 양성율은 정상군 10.7%
(238/2229), ASCUS 31.7% (76/240), LSIL 50.0% (88/176), HSIL 86.0%(37/43), SCC 100% (1/1)로서, 병기가 진행될수 록, 고위험군 HPV 감염율이 현저히 높았다. 유전형의 감염 빈도는 52(18.6%), 16(13.7%), 18(3.8%), 58(3.4%), 56(2.6%), 31 (2.5%)였고, RFMP와 염기서열법의 유전형 일치율과 Kappa값은 각각 96.8%, 0.932 (95%CI: 0.908- 0.956)였다.
결론: RFMP법을 이용한 HPV 유전형 검사는 384개의 시료까지 동시에 분석할 수 있기 때문에 대량검사가 가능하 고, 염기서열법과의 일치율이 매우 높고 염기서열법보다 객 관적 판독이 가능하며, 다양한 자궁 경부 병변 검체에서 다 수의 HPV 유전형을 정확하게 진단하는 성적을 나타내므로 HPV 감염 선별검사로서 임상적 유효성이 높다.
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