인간 암 연구를 위한 인간화 마우스 모델의 확립

102 책임저자：최원재, 󰂕 130-701, 서울시 동대문구 회기동 1번지

경희대학교 의과대학 기초의과학 연구센터 생화학 및 분자생물학교실

Tel: 02-961-0940, Fax: 02-959-8168 E-mail: wchoe@khu.ac.kr

접수일：2008년 5월 21일, 게재승인일：2008년 6월 9일

Correspondence to：Wonchae Choe

Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical Science and Engineering Research Center for Bioreaction to Reactive Oxygen Species, School of Medicine, Kyung Hee University, 1, Hoegi-dong,

Dongdaemun-gu, Seoul 130-701, Korea Tel: ＋82-2-961-0940, Fax: ＋82-2-959-8168 Email: wchoe@khu.ac.kr

인간 암 연구를 위한 인간화 마우스 모델의 확립

경희대학교 의과대학 기초의과학 연구센터 생화학 및 분자생물학교실 우병현ㆍ이선경ㆍ김은영ㆍ김헌성ㆍ최원재

Establishment of Humanized Mouse Model for Human Cancer Research

Byung-Hyun Woo, Sun-Kyung Lee, Eun-Young Kim, Hun-Sung Kim and Wonchae Choe Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical Research Center for ROS,

School of Medicine, Kyung Hee University, Seoul 130-701, Korea

Immune deficient mice in which human cells survive and function are a valuable tool for the in vivo study of human immune function and human diseases including auto-immune disorders, lymphoma and infectious diseases. The NOD-SCID (Non Obese Diabetic-Severe Combined Immunodeficiency) mice, common γ-chain knockout (NOG) mouse was shown to be an excellent recipient for transplantation of human cells due to multiple immune dysfunctions. So, NOD/SCID mouse widely used for the research of various human immune diseases. The purpose of this study was to evaluate the huPBMC-NOD/SCID mouse as a small animal model for human cancer research and human acquired immune deficiency syndrome. We established humanized mouse through huPBMC injection. We injected huPBMC in 9 NOD/SCID mice according to predetermined amounts. After then, we gathered immune organs and analyzed them by FACS. In result, huPBMC were not detected in all control groups (non IP, PBS IP), but we could found huPBMC in injection groups as respect. For the most case, the more injected huPBMC into NOD/SCID mice, the more detected. In conclusion, the huPBMC-NOD/SCID mouse is expected to effective small animal model for human cancer research and human acquired immune deficiency syndrome research. (Cancer Prev Res 13, 102-107, 2008)

Key Words: NOD-SCID mouse, huPBMC, Cancer research, Animal model

서 론

인간의 질병연구에 있어서 임상실험은 없어서는 안 될 필수 단계이다. 임상실험이 가장 효과적인 실험 방법임 에는 틀림 없지만, 여러 가지 위험한 요소들과 윤리적 문제들 때문에 극히 제한적으로만 가능한 것이 현실이 다. 이를 대체하기 위해 여러 동물모델들이 사용되고 있 지만 인체와는 상이하기 때문에 동물실험에 성공을 한 다고 하더라도 인체와 동일하게 적용 되리란 확신을 얻

기가 힘들다. 따라서 인체와 비슷한 조건을 가지는 동물 모델의 제작은 암이나 에이즈 등의 불치병 치료 연구에 있어서 커다란 발전을 가져올 것이라 사료되어 우수한 동물모델 개발은 계속 활발히 진행 중이다. 그 중에서도 인간의 유전자와 97% 유사한 Mouse는 암 연구에 있어서 매우 광범위하게 사용되고 있다. 특히, 1960년대에 흉선 이 없는 Nude mouse가 활성화된 T-림프구의 결핍으로 면 역거부 반응이 약하다는 것이 알려지면서, 암세포를 Nude Mouse에 이식하는 방법의 연구가 활성 되었다. 그 리고, 1983년에는 Bosma에 의해 Severe Combined Immuno-

deficiency (SCID) Mouse가 보고¹⁾되었는데, SCID Mouse는 림프구의 분화과정에 있어 B세포와 T세포의 항체(An- tigen)을 인식하는 부위인 V(D)J를 조합하는데 관련된 DNA의 이중 가닥 파손 수리 활성(Break Repair Activity)이 결여되어 B세포와 T세포의 기능을 제대로 하지 못하는 모델이다. 이러한 B와 T세포 기능의 결함 때문에 SCID Mouse는 사람의 세포를 받아들이는데 거의 거부반응이 없으므로 SCID Mouse는 암을 비롯한 면역질환, 장기이식 및 감염 등 여러 분야의 연구에 널리 이용되고 있다. Non Obese Diabetic-Severe Combined Immunodeficiency (NOD/

SCID) Mice는 선천적인 면역(Innate Immunity)이 결핍된 NOD Mouse와 후천적인 면역(Acquired Immunity)이 결핍 된 SCID Mouse에서 유래된 Mouse Model로 NOD Mouse의 기능적 특징(Phenotype)인 자연 독성 세포(Natural Killer Cell)의 활성 저하, 단핵백혈구(Monocytes)의 사이토카인 (Cytokine)으로의 분비기능장애, 보체 제5성분(Complement5, C5)의 활성 결여 등을 나타내며 SCID Mouse의 기능적 특 징(Phenotype)인 B세포와 T세포의 기능 결여도 동시에 나 타낸다.²⁾ 인간말초혈액단핵구(Human Peripheral Blood Mononuclear Cell, huPBMC)는 Lymphocyte나 Monocyte 같은 원형의 Nucleus를 갖는 Blood Cell로 외부 물질에 의한 감 염에 적응하거나 저항하는 Immune System에서 중요한 역할을 하는 세포이다. 이것은 Ficol을 이용하여 전혈 (Whole Blood)로부터 분리가 가능하며 CD4+ Cell을 포함 하고 있기 때문에 HIV Research에 사용가능하며 암 연구 에 있어서도 인체와 비슷한 면역체계를 제공할 수 있다.

SCID Mouse에 인간말초혈액단핵구를 복강주사(Intra- peritoneal Injection, IP)하여, 일정기간 동안 주입된 림프구 수가 일정기간 동안 Mouse 내에 존재함을 보고³⁾되었고, 암세포를 이식하였을 때 다른 Mouse 모델들 보다 더 인 체와 흡사한 조건이라고 평가 되어왔다. 하지만 1995년 Hesselton의 연구에 의하면 SCID에 인간말초혈액단구를 이식하였을 때 보다 NOD/SCID Mouse에 이식하였을 때 5∼10배 정도 더 인간말초혈액단구를 잘 받아들였다는 보고⁴⁾가 있다. 이에 본 실험은 NOD/SCID Mouse를 이용 하여 암세포나 조직 이식 등 암 연구에 있어서 더욱 효 율적인 실험을 할 수 있도록 인체와 더욱 흡사한 Mouse Model을 확립할 수 있는지 확인하기 위해 실험을 진행하 였다.

재료 및 방법 1. huPBMC 얻는 법

건강한 사람에게서 얻은 blood 400 ml을 50 ml Cornical

Tube에 10 ml씩 나누어 담은 후, 4배 Volume의 1X PBS와 잘 섞었다. 그 다음 1,500 rpm에서 5분간 원심 분리하여 혈장을 제거하고, 다시 4배 Volume의 PBS로 희석한 다 음, 50 ml Cornical Tube에 25 ml씩 나누어 담고, 미리 상온 에서 Warming-Up 해놓은 Ficol-Paque (Sigma, st. Louis, USA)액 13 ml을 Pipette Aid를 이용해 Blood 아래층에 섞 이지 않도록 천천히 넣었다. 이 Cornical Tube를 저속 원 심분리기에 넣고, 2,000 rpm에서 20분간 원심분리 시켰 다. 분리된 상층액을 흡입하여 버리고, Buffy Coat Layer를 Pipette으로 천천히 빨아들여 모았다. 모아진 Cell들을 3 배 이상 Volume의 1X PBS로 2회 세척(2,000 rpm, 20분) 후, 25 ml의 1% BSA가 첨가된 PBS로 마지막 세척을 한 다. 그 다음 RBC Lysis Buffer 10 ml을 넣고 1∼2분 반응시 킨 후 PBS로 2회 세척(2,000rp, 20분)한다. RPMI Media 5 ml에 풀어 20μl만 1.5 ml Eppendorf Tube에 따로 담고, 같은 양의 Trypan Blue와 섞어서 Hematocytometer로 Cell 수와 Viability를 확인하였다.

2. Transplantation of huPBMC

huPBMC의 이식 그룹별로 1×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷의 huPBMC 이식량을 설정하고 NOD/SCID Mouse에 분리된 인간말초 혈액단핵구(huPBMC)를 복강에 이식하였다. 대조군으로 huPBMC를 이식하지 않은 그룹과 PBS만을 주입한 그룹 도 설정하여 복강 안으로 주사하였다.

3. NOD/SCID mouse 관리

생후 6주 된 male NOD/SCID mouse (Australia, animal resources Centre, NOD.CD17-Prkdc^scid)는 외부와 차단된 Specific Pathogen Free (SPF) Room, Autoclaved Microfilter Cage에서 키웠으며 Autoclaved Food Pellet 및 Autoclaved Water를 먹였다. 모든 시술은 Hepafiltered Lamina-Flow Hood에서 시행하였으며, 복강주사로 huPBMC를 이식하 고 경추탈골을 통해 조직 및 혈액 샘플을 얻었다.

4. FACS Analysis

FACS Analysis는 Beckmancoulter사의 제품을 사용하여 측정하였다. NOD/SCID Mouse의 조직과 혈액에서 분리 해 낸 PBMC를 CD4-FITC (Santa Cruz Biotechnology)와 CD45-PE-cy5 (Beckmancoulter) Antibody로 염색하여, 면역 형광 염색 분석법을 이용하여 인간면역세포의 생착율을 확인하였다. Single-Cell Suspensions에 Labeled Anti-Human CD4-FITC (Santa Cruz Biotechnology)와 CD45-PE-cy5 (Beck- mancoulter) antibody를 넣고 30분간 Ice에서 Incubation시킨 후 세척을 하고, Human Antigens의 Two-Color Fluorescent

Table 1. Intraperitoneal (IP) injection and anatomizing scheme

Control group huPBMC injection group (amount)

Groups 󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏 󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏󰠏

Anatomizing day Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5

1 day after IP non PBS 1×10⁶ 1×10⁷ 3×10⁷

7 days after IP non PBS 1×10⁶ 1×10⁷ 3×10⁷

10 days after IP non PBS 1×10⁶ 1×10⁷ 3×10⁷

Fig. 1. Mouse spleens, which are one stained with hu CD45-PE- CY5.

Fig. 2. The percentage of detected human T cell in mouse spleen by Flow cytometry, after 1 day.

Analyzer로 분석하였다.

결 과

NOD/SCID Mouse에 huPBMC를 이식 하지 않은 군과 PBS만을 주입한 군, 그리고 이식하는 huPBMC 수를 달리 하는 Group (1×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷)을 나누었다(Table 1). 그 리고 일정 지속 시간(1일 후, 7일 후, 10일 후)에 맞춰 Mouse의 Spleen을 적출하여 인간 면역세포의 생착률을 FACS로 측정해 보았다(Fig. 1). huPBMC와 PBS를 이식하 고 1일 후, 대조군인 1군(Non Injection)과 2군(PBS Injec- tion)에서는 huPBMC를 인식하는 huCD45-PE-CY5항체로 형광 염색한 후 인간 면역세포를 확인하여 보았을 때 인 간 면역세포는 존재하지 않았다. 하지만 3군인 1×10⁶의 huPBMC를 이식한 Mouse에서는 대조군과 비교하였을 때 전체 Spleen Cell의 8.88%정도 면역세포가 검출되었고, 5 군인 3×10⁷의 huPBMC를 이식한 쥐에서는 전체 Spleen Cell의 9.31% 정도의 면역세포가 검출되었다. 하지만 4군 에서는 대조군과 같이 변화가 없었다(Fig. 2). 7일 경과 후에 다시 각 군에서 1일 후에 실험했던 것과 동일한 방 법으로 각 군의 전체 Spleen Cell에서 huPBMC 생착률을 살펴보았다. 7일차와 10일차 실험은 Hu CD45-PE-CY5 외 에 Hu CD4-FITC 항체를 추가하여 두 개의 항체로 형광 염색을 하여 더욱 확실하게 huPBMC의 생착률을 확인하

였다. 7일차 때에도 1일 후에 진행된 실험과 마찬가지로 1군과 2군에서는 전체 Spleen Cell에서 huPBMC가 검출되 지 않았고 3군(1×10⁶), 4군(1×10⁷), 그리고 5군(3×10⁷)에서 는 대조군에 비해 각각 5.94%, 10.88%, 3.48%의 면역세 포가 검출되었다(Fig. 3). 복강주사 후 10일 후에도 앞과 동일하게 실험이 진행되었는데 대조군인 1군과, 2군에 서는 역시 변화가 관찰되지 않았다. 그리고 3군(1×10⁶)에 서는 10.56%의 면역세포가 증가하였고, 4군(1×10⁷)과 5 군(3×10⁷)에서는 각각 15.14%, 26.23%의 변화가 나타났

Fig. 3. The percentage of detected human T cell in mouse spleen by Flow cytometry, after 7 days.

Fig. 4. The percentage of detected human T cell in mouse spleen by Flow cytometry, after 10 days.

다(Fig. 4).

고 찰

NOD/SCID Mice는 면역 거부반응에서 중요한 역할을 하는 T,B-Lymphocyte뿐 아니라, NK Cell 및 보체가 결핍 되어 있으므로, 인간 면역질환 연구에 필요한 임상실험 대체용 동물이식모델로서 널리 쓰이고 있다.⁵⁾

NOD/SCID Mouse는 기존에 사용 되어 왔던 NOD Mouse와 SCID Mouse의 기능적 특징을 모아놓은 실험 모 델로서, 이전의 Immune Deficiency Mouse보다 인체와 비 슷한 조건의 환경을 제공 할 수 있어 임상 실험을 대체 할 수 있다고 평가된다. 본 연구에서는 NOD/SCID Mouse 에 인간 면역 세포 이식을 위해 인간 말단 혈액 단구세

포의 이상적인 이식량과, 생착 지속 기간에 따른 생착률 의 변화를 알아보고자 실험이 진행되었다.

William 등이 말한 성공적인 인간 림프구의 생착을 위 해서는 SCID Mouse 1마리에 최소 2×10⁷의 huPBMC을 복 강에 투여해야 한다는 제안⁵⁾을 기반으로 하여 SCID Mouse보다 생착 효율이 좋다고 알려진 NOD/SCID Mouse 에 다른 연구진^5-9)들은 1×10⁷∼1×10⁸의 다양한 양의 huPBMC를 이식하였다. 이에 본 연구진들은 이론적인 효 율성과 다른 그룹의 이식량을 고려하여 3개의 huPBMC 이식 그룹을 설정하였다. 또한 지속 시간에 따른 huPBMC 의 생착률 변화를 알아보기 위해 지속 시간의 차이를 두 고 마우스를 희생시켜 생착률을 확인해 보았다. SCID Mouse 복강으로 이식한 인간의 면역세포는 복강 및 말초 림프조직에서 수개월 이상 머무를 수 있고, 복강 주입 2년 후에도 Human Immunoglobulia를 검출 할 수 있다는 연구 결과가 있었지만¹⁰⁾ 단기간내의 생착 변화를 확인하 기 위해 24시간, 7일 그리고 10일이라는 지속시간을 설 정하고 실험을 하였다. 생착 변화를 확인하기 위해 Spleen 에 생착한 인간말단혈액단구세포의 상대적인 양을 면역 형광 염색법을 통해서 측정하였는데, 인간 면역 세포의 CD4, CD45를 인식하는 두 종류의 항체를 사용하여 FACS를 통해 확인을 하였다.

먼저 1일차에 각 그룹의 Mouse 1마리씩을 희생시켜 생 착률을 비교 하여 보았는데, 대조군인 1군과 2군에서는 인간의 면역세포가 검출되지 않았다. 하지만 huPBMC를 이식하였던 3군과 5군에서 변화가 있었는데 각각 전체 Spleen Cell 중 8.88%와 9.31%의 인간 면역세포가 검출되 었다. 그러나 4군에서는 변화가 없었는데, 이는 이식했 던 인간 면역세포에 대해 이식 거부 반응으로 인하여 인 간 면역세포가 검출 되지 않은 것으로 사료된다. 7일차 의 생착률을 비교하여 보면 대조군에서는 1일차와 마찬 가지로 인간의 면역세포가 검출되지 않았으며, 3군과 4 군 5군에서는 각각 전체 Spleen Cell 중 5.94%, 10.88%, 3.48%가 나타났다. 7일차에서는 면역 이식 거부반응은 나타나지 않았지만 이식량에 따른 연관성이 나타나지 않은 것으로 보여진다. 또한 1일차와 비교해 보았을 때 지속시간에 따른 연관성 역시 부족한 것으로 보인다. 10 일차의 생착률을 비교하여 보면 1일차와 7일차와는 다 르게 이식량과 지속시간에 따른 연관성이 확인되는데, 대조군에서는 역시 인간의 면역세포가 검출되지 않았으 며, 실험군인 3군, 4군, 5군에서 각각 전체 Spleen Cell 중 10.56%, 15.14%, 26.23%의 면역세포를 검출하였다. 이식 거부 반응이 나타나지 않았으며 이식량에 따라 면역세 포 생착률이 증가함을 볼 수 있었고, 지속 시간에 따른

생착량의 증가는 이전 실험과 비교할 때, 시간이 지남에 따라 생착량이 증가하는 것으로 보인다. 하지만 각 군 사이의 이식량에 따른 생착률의 연관성이 결여 되어 있 고, 지속 시간에 따른 생착률 역시 간접적으로는 증가하 는 것으로 사료되긴 하지만 일관성이 결여되어 있다고 판단된다.

이는 복강으로 주입한 huPBMC의 생착 정도는 공여자, SCID Mouse 자체의 면역 활성 정도 및 실험자 등에 따라 생착율의 차이를 나타내기 때문에 생착 정도의 표준화 에는 많은 어려움이 있다고 보고¹⁰⁾에서도 확인되었지만 본 연구의 결과를 보았을 때도 NOD/SCID Mouse 역시 각 개체마다 생착률이 다르며 공여자의 huPBMC의 상태 등 에 따라 생착률이 다르기 때문으로 해석된다. 이식량에 따른 생착률이 연관성이 있을 것으로 유추할 수 있겠지 만, 실험군의 개체적 특성이 모두 동일하였다면 보다 정 확한 연관성을 확인할 수 있었을 것으로 생각되며, 지속 시간 역시 개체적 특성이 동일하거나 혹은 한 개체에서 면역세포를 지속 시간에 따라 획득할 수 있었다면 보다 일관된 연관성을 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 또한 huPBMC 생착 실험에 있어서 본 실험에 사용된 NOD/

SCID Mouse의 숫자가 충분하지 못함으로 인해 보다 많 은 수의 실험군을 통한 검증이 필요할 것으로 보인다.

개체마다 특성이 다르기 때문에 Mouse를 희생시켜 면역 기관을 확보하기 보다는 각 개체를 지속적으로 보존하 면서 huPBMC의 생착률을 확인할 수 있는 방법을 고안 하는 것도 필요할 것으로 보인다.

또한 Mouse의 면역 거부 반응 능력이 제거된 NOD/

SCID Mouse 모델을 사용하여 인간말단혈액단구세포의 생착을 시행한 것이므로, 공여자의 인간말단혈액단구세 포 건강 상태에 따라 NOD/SCID Mouse의 인간 면역화에 영향을 줄 수 있으며, 5% 이하의 SCID Mice에서 나타나 는 생쥐 림프구의 기능회복이 나타날 수 있고, 이런 경우 에는 huPBMC-SCID Mouse에서 GVHD가 나타날 가능성 이 높은 것이 보고된 사례도¹¹⁾ 있는 것으로 보아 NOD/

SCID Mouse에서도 가능성이 있기 때문에 실제 면역 능 력을 갖추고 있는 임상적 경우와는 면역반응의 양상이 상이할 수 있다. 본 연구의 결과로 보았을 때, 개체 마다 갖는 다른 특성과 공여자의 PBMC의 상태 등 여러 가지 요인으로 인해 이식량에 따른 생착률과 이식 지속 시간 에 따른 생착률의 일관성을 확정 짓기는 어렵다. 하지만 huPBMC를 이식하는 것이 NOD/SCID Mouse의 면역 전환 을 유도하는 것은 본 연구 결과로 얻을 수 있는 사실이 다. NOD/SCID Mouse의 면역체계의 전환은 개체의 면역 거부 반응 능력이 회복되지 않는다는 전제하에 일어난

다는 단점이 있지만, 윤리적 문제나 여러 가지 위험 요소 를 줄이고 암 연구나 후천성 면역 결핍증과 같은 인간의 면역질환 연구의 임상실험 대체 실험 동물 모델로써 활 용할 가치가 있음을 확인 할 수 있었다.

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was supported by grant No. (R01-2006-000- 10506-0) from the Basic Research Program of the Korea Science & Engineering Foundation and the Korea Research Foundation Grant funded by the Korean Government (MOEHRD) (KRF-2007-331-E00024)

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