Journal of Korean Spine Surg.
Vol. 14, No. 1, pp 8~16, 2007
Address reprint requests to Jae-Won You, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, Chosun University Hospital 588, Seosukdong, Donggu, GwangJu, 501-717, Korea
Tel: 82-62-220-3147, Fax: 82-62-226-3379, E-mail: [email protected]
�본 논문의 요지는 2006년도 대한척추외과학회 춘계학술대회에서 발표되었음.
�이 논문은 2005년도 조선대학교병원 선택진료 학술연구비에 의하여 연구되었음.
척수 손상 쥐에 사람탯줄혈액 이식 후 손상부위의 조직학적 변화와 행동 변화
김동휘∙손홍문∙김종중
#∙하상호∙이상홍∙문영래∙이준영∙임만택∙유재원
조선대학교 의과대학 정형외과학교실, 해부학교실#
Human Umbilical Cord Blood Infusion in Paralyzed Rats:
Histologic and Behavioral Alterations
Dong-Hui Kim, M.D., Hong-Moon Sohn, M.D., Jong-Joong Kim, Ph.D.#, Sang-Ho Ha, M.D., Sang-Hong Lee, M.D., Young-Rae Moon, M.D., Jun-Young Lee, M.D., Man-Taek Lim, M.D., Jae-Won You, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, Department of Anatomy, College of Medicine, Chosun University, Gwangju, Korea# – Abstract –
Study DDesign: Experimental animal study
Objectives: To examine the ability of human umbilical cord blood (hUCB) stem cells to target a zone of injury and to determine the efficacy of hUCB cells to ameliorate the behavioral deficits after a hUCB cell infusion in paralyzed rats.
Summary oof LLiterature: Many groups have investigated the use of stem cells as potential treatments for a CNS injury. hUCB cells have recently been reported to alleviate the behavioral consequences of a stroke injury.
Materials aand MMethods: Thirty Sprague Dawley rats were divided into 6 groups (Gr) (Gr 1. SCI (spinal cord injury) + hUCB delivered at one day postinjury, Gr 2. SCI + hUCB delivered at 3 days postinjury, Gr 3. SCI + hUCB delivered at 5 days postin- jury, Gr 4. laminectomy + hUCB, Gr 5. SCI only, Gr 6. Laminectomy only). SCI was produced by compressing the spinal cord to the level of the 8-9ththoracic spine for 1 minute with an aneurysm clip that was calibrated to a closing pressure of 50 gms. The hUCB cells (0.5 ml, 1.5×106) were administered intravenously to the rats. The rat was assessed behaviorally at one, two and three weeks using the BBB behavioral scale. Four weeks after the injury, the animals were sacrificed and the hUCB positive- response neural cells (mouse anti-human mitochondria monoclonal antibody=MAB 1273) at the injury level observed using optical and fluorescent microscopy.
Results: MAB 1273 positive cells were observed in groups 1, 2 and 3 but not in groups 4, 5 and 6. In particular, there were 870 cells distributed over an area of 1.2 mm2in group 3. Group 3 showed the most significant recovery over time in the open field exam, and the most improvement in another tests of incline, leg extension, and toe spread compared with group 1 (p�0.01).
Conclusion: After infusing the hUCB stem cells to SCI rats, it was confirmed that hUCB cells migrate to an injured area and ameliorate the behavioral deficits. A hUCB infusion 5 days after the injury produced best results in terms of the number of cells and motor recovery.
Key WWords: Spinal cord injury, HUCB, Histology, Behavioral recovery
서 론
척수 손상은 여러 가지 사고 후 생존한 환자의 가장 심 각한 후유증의 하나로 특히, 대부분의 환자가 활동성이 많은 30대 이하에서 발생하기 때문에 의학적 관점에서 뿐만 아니라 사회경제적 관점에서도 많은 관심의 대상 이 되고 있다1). 최근 의학의 발전으로 척수 손상 후 생존 율은 현저히 증가했지만 신경 증상의 회복은 이에 못 미 치고 있으며 척수 손상 후 발생하는 2차적 손상의 병태 생리는 아직 완전히 이해되지 못하고 있고 척수재생을 위한 적절한 치료 방법이 없어 대부분 척수 손상 후에 발생한 타 장기의 합병증에 대한 치료나 재활치료에 의 존하는 실정이다. 척수를 포함하는 중추신경계 신경원 자체는 말초신경계와는 달리 축색재생의 내재적 능력 이 떨어지고 손상받은 척수의 외재적 주변 환경은 Myelin inhibitors나 Glia scar inhibitors 같은 요소들로 척 수재생에 불리한 환경이 조성되어 척수 손상 후 축색의 재생은 되지 않는 것으로 보고되고 있다2,3). 이렇게 척수 재생에 불리한 내재적 및 외재적 환경을 개선하기 위해 많은 연구가 되어왔지만 아직까지 확실하게 우수한 방 법은 소개되지 못하고 있다4,5). 최근에 당뇨병이나 심장 질환, 퇴행성 뇌질환 등 난치성 질환에 세포치료가 도입 되면서 척수 손상에서도 세포치료를 이용한 손상된 척 수재생을 시도하고 있는데 뇌와 척수에서 질병과 장애 가 유발된 부위에 신경세포와 신경아교세포(neuroglial cell)로 분화, 증식하고 자가 유지능력을 지닌 새로운 신 경조직을 형성할 수 있는 무한한 가능성과 잠재력을 가 지고 있는 신경줄기세포에 대한 관심이 고조되고 있다
6,7). 줄기세포에는 발현 기원에 따라 배아줄기세포와 성 체줄기세포로 나눌 수 있는데 배아줄기세포는 매우 다 양한 새로운 세포로 분화할 수 있는 만능세포(pluripo- tential stem cell)로서 신경질환을 치료하는데 가장 적합 하지만 생명의 시작인 배아의 조직을 이용해야 한다는 윤리적인 문제와 악성종양의 발생 가능성이 있어 기술 적인 문제 뿐만 아니라 사회적인 공감대가 형성되어야 하는 문제가 있다8,9). 그러나 성체줄기세포는 배아줄기 세포에 비해서 증식능력이 떨어지고 잠재력이 약하다 는 단점은 있지만 윤리적인 측면에서 배아줄기세포보 다 자유롭고, 아직까지 종양형성의 보고가 없으며 자가 이식치료가 가능하다는 등의 장점이 있어 배아줄기세 포보다 활발한 연구가 진행되고 있다10). 성체줄기세포인 사람탯줄혈액세포(haman umbilical cord blood, hUCB)는 정맥에 주입했을 때 스스로 손상받은 부위로 이주하여 신경세포와 신경아교세포로 분화 증식한다는 보고가 있으며, 출산할 때 탯줄이나 태반에서 쉽게 얻을 수 있
는 혈액세포로써 혈우병, 각종 암, 면역계통과 신경계통 의 질병을 치료할 수 있는 자원이 풍부한 성체줄기세포 이며 어린이나 어른에게도 충분히 이용할 수 있고 특히 급성 이식편대숙주 반응(Acute Graft versus Host Reac- tion)의 위험성이 거의 없는 것으로 알려져 최근 신경원 성 퇴행성 질환, 뇌졸중, 척수 손상 등에서의 유용성에 대하여 많은 연구가 되어지고 있다11,12,13).
본 연구의 목적은 쥐의 척수의 흉수 분절을 완전히 압 박 손상시키고 손상부위에 사람탯줄혈액을 주입한 후 손상부위의 조직학적 변화와 신경학적 손상의 회복 정 도를 확인하여 사람탯줄혈액이 손상된 척수를 재생시 킬 수 있는지 알아보고자 하였다.
연구 대상 및 방법
실험동물은 조선대학교 동물사육장에서 분양받은 흰 쥐 수컷 Sprague Dawley 30마리(220~250 gm)를 이용하 였으며 사육장에 도착 즉시 동물 행동평가를 위하여 길 들이기를 한 마리 당 3~5분씩 1일 1~2회, 10일 동안 실시 하였다. 실험군은 척수 압박손상 1일 후 사람 탯줄 사람 탯줄혈액세포 주입군(SCI 1+hUCB), 척수 압박손상 3일 후 사람 탯줄 사람탯줄혈액세포 주입군(SCI 3+hUCB), 척수 압박손상 5일 후 사람 탯줄 사람탯줄혈액세포 주 입군(SCI 5+hUCB), 척추궁 절제술만 시행하고 사람탯 줄혈액세포 주입군(L+hUCB), 척추궁 절제술과 척수 압 박손상만 시행한 군(SCI), 척추궁 절제술만 시행한 군 (L)의 6군으로 나누어 실험하였다.
1. 척수 손상 및 관리
각 실험군은 5마리씩을 사용하였으며 흉추 8~9번째 부위를 척추궁 절제술을 하여 척수를 노출시키고 압박 력이 50 gm인 Dietrich Bulldog Clamp (Fine Science Tools Inc, Foster city, CA)로 전, 후방을 동시에 1분간 압박하 여 척수를 손상시켰다. 그 후 정상적으로 근육과 피부는 봉합하여 동물사육장에서 먹이와 물을 제한없이 공급 하 여 사 육 하 였 다 . 면 역 억 제 제 인 Cyclosporine (10 mg/kg/day)을 실험기간 동안 근육내 주사하였으며 항생 제인 Baytril (20 ml/kg)을 5일 동안 피하 주사하였고 하 루에 2회씩 배변과 배뇨를 인위적으로 시켰다.
2. 사람탯줄혈액 주입
단핵 hUCB세포는 조선대학교 줄기세포 연구팀으로 부터 냉동된 상태로 분양받아 사용하였다. 이식할
hUCB세포 준비는 냉동 보관되어 있는 탯줄혈액을 10％
bovine serum (Gibco)과 gentamicin (50 μl/ml, Sigma)이 들 어 있는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM.
Gibco)에 37�C에서 빠른 속도로 녹인 다음 이들 세포를 10 ml Isolyte 용액(pH 7.4)이 들어 있는 15 cc 원심분리관 에 옮겨 7분 동안 1,000 rpm으로 원심분리한 뒤 상청액 은 버리고 hUCB세포는 glucose-saline에 2~3회 씻어낸 다음 FITC (fluorescent isothiocyanate)가 결합되어 있는 cholera toxin subunit B (CTX-FITC)에 결합시키기 위하 여 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 이식하기에 앞서 세 포의 생존율과 세포수를 평가하기 위하여 trypan blue로 염색한 후 현미경으로 관찰하여 세포수를 3,000/μl로 조 절하였다. 세포의 생존율은 hUCB세포를 주입하기 전에 는 81%, 주입 후에는 61%로 매우 좋은 상태였다.
hUCB세포의 주입은 실험군의 날짜에 따라 쥐를 플라 스틱으로 제작한 원형의 통(restrainer) 속에 머리 부분이 앞쪽을 향하게 한 다음 꼬리만 원통 밖으로 나오게 하고 꼬리정맥을 쉽게 노출시키기 위하여 약 40�C 정도의 뜨 거운 물로 꼬리를 씻어주었다. 미리 준비된 hUCB세포 를 1 ml 주사기에 부착된 27 gauge 주사바늘을 이용하여 서서히 한 마리 당 0.5 ml(1.5×106)씩 주입하였다.
3. 형태학적 분석
1) 광학미경적 면역조직화학염색
실험동물은 척수를 손상시킨 후 28일 동안 사육한 다 음 희생시켰다. 동물은 chloral hydrate로 마취시킨 후 왼 쪽심실을 통하여 heparin이 함유된 생리식염수로 관류시 켜 혈액을 제거한 다음, 0.1 M phosphate buffer saline (PBS, pH 7.4) 용액에 녹인 4% paraformaldehyde로 관류 고정시킨 후 척수를 채취하여 4�C에서 같은 고정액에 3~5시간 더 고정하였다. 그 후 조직은 0.1 M PBS 용액에 10% sucrose (Sigma)를 희석하여 4�C에서 24시간 침적시 킨 다음 냉동절편기(Reichert-Jung)를 이용하여 35~40 μm 로 수평과 관상절편을 만들었다. 조직내의 내인성 과산 화 효소의 활성을 억제하기 위하여 0.5% 과산화수소 (H2O2)에 30분간 반응시켰다. 손상된 척수조직에서 hUCB세포의 활성화를 확인하기 위하여 제1차 항체는 mouse anti-human mitochondria monoclonal antibody (MAB1273, Chemicon)를 1:30으로 희석하여 사용하였으 며 조직은 항체 희석액에 4�C에서 48시간 반응시켰다.
2차 항체는 biotinylated goat anti-mouse IgG와 ABC complex (Vectastain, Elite. Vector. CA)를 1:200과 1:1,000 으로 희석하여 실온에서 1 시간씩 반응하였다. 기질액은 3.3’-diaminobenzidine-HCL (DAB, Sigma)을 0.1 M PBS 용액에 용해하여 여과한 후 과산화수소가 0.003% 되도
록 첨가하였다. 발색반응을 확인한 후 탈수, 투명과정을 거처 봉합하여 양성반응을 보이는 hUCB양성반응신경 세포(MAB1273)를 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.
2) 형광현미경적 면역조직화학염색
hUCB세포가 척수의 손상부위로 이동한 것을 확인하 기 위하여 형광면역조직화학염색을 시행하였다. 1차적 으로 hUCB세포는 CTX-FITC와 결합시켜 꼬리정맥을 통하여 주입했기 때문에 이 상청액이 손상부위로 이동 했는지를 확인하기 위하여 슬라이드에 있는 조직절편 을 매 5개의 절편 중 1개의 절편을 선택하여 2차 증류수 로 10분씩 2회 씻어낸 다음 조직을 건조시킨 후 형광물 질 보호 봉합제를 이용하여 덮개유리로 봉합하여 형광 현미경으로 hUCB양성반응신경세포를 관찰하였다. 그 후 다음 단계의 염색을 위하여 덮개유리를 조심스럽게 벗겨낸 다음 10% normal goat serum (NGS)과 0.3% triton X를 혼합한 0.1M PBS 용액에 실온에서 1시간 침적하고 나서 제1차 항체인 MAB1273을 2% NGS와 0.3% triton X 로 혼합한 PBS 용액에 각각 1:50으로 희석하여 4�C에서 24~48시간 반응시킨 후 2차 항체는 0.1 M PBS 용액으로 3회 씻어낸 후 2차 항체는 biotinylated goat anti-mouse rhodamine (Alexa Fluor 594, Molecular Probes)을 2% NGS 가 첨가된 0.1 M PBS 용액에 1:800으로 희석하여 실온 의 암 실 에 서 2시 간 반 응 시 켰 다 . 그 후 봉 합 하 여 MAB1273의 양성반응을 형광현미경으로 관찰하였다.
4. 척수 손상 후 행동시험
척수를 압박 손상시킨 후 실험동물의 행동평가는 1주 일 간격으로 3회 실시하였다. 운동시험평가는 맨눈관찰 (open field), 철망경사 오르기(incline), 뒷다리 펴는 운동 (leg extension), 발가락운동(toe spread)의 상태를 디지털 비디오 테이프에 녹화하여 컴퓨터 비디오 파일로 편집 한 다음 관찰하였는데, 관찰자간 오차를 줄이기 위해 3 명의 관찰자가 서로 독립적으로 판단하여 점수를 주고 평균점수를 최종 점수로 결정하였다.
맨눈관찰은 바닥이 부드럽고 울퉁불퉁한 큰 대야(직 경 100 cm×높이 20 cm)에 실험동물을 넣어 자유롭게 걸을 때 뒷다리의 엉덩관절, 무릎관절, 발목관절 운동의 움직이는 상태와 몸의 균형 유지 상태를 관찰하여 BBB 점수를 주었다14). 철망오르기는 높이 100 cm, 폭 30 cm, 65�의 경사진 철망 표면을 오르내릴 때 뒷다리의 움직 이는 상태를 관찰하였으며, 뒷다리 펴는 운동과 발가락 운동은 꼬리를 들어 올렸을 때 뒷다리의 펴는 운동 상태 를 관찰하였고, 발가락 운동은 발가락의 펴짐과 균형 상 태를 관찰하였다(Table 1). 이렇게 얻은 점수는 2-way
ANOVA 분석 방법으로 통계적 유의성을 검증하였다.
결 과
1. 형태학적 분석 결과
사람탯줄혈액 이식군에서 척수의 손상받은 부위에서 hUCB양성반응신경세포를 확인하기 위하여 면역조직 화학염색을 시행하였다. 광학현미경으로 관찰한 결과 손상받지 않은 부위에서는 hUCB양성반응신경세포를 전혀 관찰할 수 없었으나(Fig. 1B, D, F) 척수 손상부위 에서는 hUCB양성반응신경세포를 관찰할 수 있었다 (Fig. 1A, C, E).
형광현미경으로 관찰한 결과 각 실험군에서 척수 손 상부위에서 내인성 형광물질을 나타내는 세포들이 매 우 다량으로 출현하여 구별하기 어려웠으나 CTX-FITC 로 표 지 된 hUCB양 성 반 응 신 경 세 포 로 판 단 되 는 MAB1273양성반응세포(Fig. 2A, C, E)와 형광물질이 매 우 뚜렷하게 염색되어 있어서 확실하게 관찰할 수 있었 다. 그러나 각 실험군에서 척수 손상부위의 주변이나 손 상받지 않은 정상부위에서는 MAB1273양성반응세포 (Fig. 2B, D, F)는 전혀 관찰되지 않았다.
또한 척수를 손상시키고 hUCB세포를 주입하지 않은
실험군에서는 손상받지 않은 정상부위와 마찬가지로 MAB1273양성반응세포(Fig. 2B, D, F)는 전혀 관찰할 수 없었다. 이런 결과는 hUCB세포가 손상부위로 이동하여 신경세포나 혹은 신경아교세포로 분화 성장하여 본래 의 신경기능으로 회복되는 것으로 생각된다.
척수의 손상된 부위에서 관찰된 CTX-FITC로 표시된 hUCB양성반응신경세포는 대부분 아주 뚜렷한 핵과 함 께 직경 약 10 μm 정도된 둥글고 약간 길쭉한 모양이었 다(Fig. 2A, C, E). 또한 꼬리정맥을 통하여 주입한 hUCB 세포가 척수의 손상받은 부위에 얼마나 많은 수가 도착 하였는지 정확히 알 수 없어서 실험에 사용한 조직절편 의 일정부위를 선택하여 그 부위의 조직절편에 출현한 hUCB양성반응신경세포를 계수하여 세포의 출현 밀도 를 추정하여 결정하였다. 척수 손상 후 1일에 hUCB세포 를 주입한 실험군에서 척수조직 1.2 mm2에서 약 370개 의 hUCB양성반응신경세포를 관찰할 수 있었고, 3일에 세포를 주입한 실험군에서는 약 650개, 5일에 세포를 주 입한 실험군에서는 약 870개의 hUCB양성반응신경세포 를 관찰할 수 있었다.
2. 행동시험 분석 결과
척수 손상을 주지 않은 실험군에서는 마취 상태에서 깨어나자마자 어떠한 운동장애도 없었으나 척수 손상
Table 1.행동평가
점수 철망경사 오르기
다리를 들어올리지 못하고 정 위치를 취하지 못할 때 0
다리를 들어올리려고 시도는 하나 정 위치를 취하지 못할 때 1
다리를 들어올리나 몸을 지탱하지 못할 때 2
다리를 들어올리고 정 위치를 하며 몸을 지탱할 때 3
다리를 들어올리고 정 위치를 하며 다리의 펴짐 운동과 함께 몸을 지탱할 때 4
뒷다리로 약간 기어오르지만 철망을 움켜 잡지 못할 때 5
뒷다리로 약간 기어오르며 철망을 움켜 잡을 때 6
천천히 기어오르지만 철망을 움켜 잡지 못할 때 7
철망을 움켜 잡으며 기어 오를 때 8
정상적으로 철망을 기어 오를 때 9
뒷다리 펴는 운동
뒷다리를 펴지 못할 때 0
뒷다리를 약간 펴지만 벌리지를 못할 때(abduction) 1
뒷다리를 펴지만 벌리지 못할 때 2
뒷다리를 벌림과 함께 펼 때 3
발가락 운동
발가락을 펴지 못할 때 0
발가락을 부분적으로 안쪽 가 쪽으로 펼 때 1
발가락을 정상적으로 펼 때 2
을 받은 모든 실험군에서는 깨어나자마자 양쪽 뒷다리 는 전제적으로 마비된 상태였으며 마비로 인한 배뇨와 배변의 장애를 보였다.
맨눈관찰의 운동평가의 BBB점수는 척수 손상을 시키
지 않고 척추궁 절제술 후 hUCB 주입군과 척추궁 절제 술만 시행한 군에서는 정상점수인 21점을 보였다. 척수 손상을 받은 실험동물들은 기간이 경과할수록 상태가 점점 회복되었으며 척수 손상 후 5일에 hUCB를 주입한
Fig. 1. Identification of hUCB in compressed spinal cord immunohistochemical stained with mouse anti-human mitochondria mono- clonal antibody (MAB1273). (A) hUCB were injected into the tail vein 1 day compression injury. We can observed immuno- positive hUCB for the MAB1273 (arrows). (C) hUCB were injected into the tail vein 3 days compression injury. We could observed numerous immuno- positive hUCB for the MAB1273 (arrows). (E) hUCB cells were injected into the tail vein 5 days compression injury. We can observed numerous immuno-positive hUCB for the MAB1273 (arrows). (B, D, F) (right panel) were of the contralateral spinal cord, in which immuno-positiv hUCB were not found.
실험군은 전체 실험군에서 행동기능 회복 상태가 가장 좋았으며 실험기간이 경과할수록 척수 손상 후 1일에 hUCB를 주입한 군과 육안적으로나 통계학적으로 의미 있는 차이를 보였다(p<0.01)(Fig. 3).
철망경사 오르기 능력은 척수 손상 후 5일에 hUCB세 포를 주입한 군에서 가장 양호한 결과를 보였으며
(p<0.05), 척수 손상만 시킨 군과 손상 후 1일에 hUCB을 주입한 군과는 통계학적으로 의의있는 차이는 없었다 (Fig. 4).
뒷다리 펴는 운동과 발가락 운동점수도 척수 손상 후 5일에 hUCB를 주입한 군에서 가장 좋은 결과를 보였으 며(p<0.05), 척수 손상 후 hUCB를 주입한 군이 척수 손
Fig. 2. Identification of the hUCB in compressed spinal cord. hUCB, prelabeled with FITC-conjugated cholera toxin, were injected into the tail vein 1, 3, 5 days after compression injury. Fluorescent hUCB (MAB1273, arrows) are seen within the injured spinal cord at 5(A), 3(C), 1(E) days post-injection. Right panel (B, D, F) is of the contralateral spinal cord (intact spinal cord), in which fluorescent hUCB were not found.
상 후 hUCB를 주입하지 않은 군보다 실험 1주일이 지나 면서는 호전 정도가 유의하게 차이가 나기 시작했다 (p<0.05)(Fig. 5, 6).
고 찰
척수는 뇌와 연속되어 있으며 말초신경과 연결되어 우리 몸의 각종 장기 및 뼈와 근육에 신경을 공급하여 운 동과 감각을 조절하는 중요한 역할을 수행하고 있다. 따 라서 교통사고를 비롯한 각종 사고와 여러 장해요인에 의하여 뇌와 척수의 특정 부위가 손상을 받아 그 고유 기 능이 상실되면 치명적인 결과를 초래하게 된다. 그렇기 때문에 이런 여러 요인에 의하여 발생되는 질병을 치료 하기 위한 방편으로 신경과학자들은 신경면역학과 신경 조직이식에 관하여 끊임없는 연구를 계속하고 있는 실 정이며 이런 노력의 결과 여러 가지 신경원성 퇴행질환 을 치료하는데 상당한 성과를 얻었다15,16,17). 그러나 불행 하게도 신경원성 퇴행성 질환을 치료하기 위하여 신경 세포를 이식해야 하는데 이 이식세포를 배아줄기세포에 의존해야 하는 까닭에 요즈음 줄기세포가 사회적으로
많은 관심을 갖게 되었으나 윤리적인 문제가 제기되어 신경세포이식에 대한 연구가 상당한 제약을 받게 되었 다. 따라서 최근에는 배아줄기세포를 대체할 수 있는 것 으로 성체줄기세포인 골수와 사람의 탯줄혈액세포가 신 경세포 및 신경아교세포로 분화, 성장하여 척수질환, 뇌 졸중, 빈혈, 신경원성 퇴행질환을 치료하는데 중요한 역 할을 하는 것으로 보고되고 있다6,7,18,19). 특히 이들 줄기세 포는 종교 및 윤리적인 문제가 없다는 장점이 있어서 앞 으로 획기적인 연구의 성과를 얻을 것으로 생각된다.
본 연구에서 척수 손상 후 hUCB세포를 주입한 후 마 비된 실험쥐의 척수운동기능이 유의하게 회복되었으며 수술 직후와는 달리 시간이 경과할수록 걸음걸이 및 행 동이 향상됨을 확인할 수 있었다. 손상받은 쥐에 따라 차이는 있었으나 꾸준히 운동의 기능이 향상되었으며 3 주일 이후부터는 거의 정상에 가깝게 걷는 쥐도 관찰할 수 있었다. 또한 면역조직화학염색 및 형광염색법을 시 행한 조직절편에서 꼬리정맥에 주입한 hUCB세포가 척 수의 손상받은 부위로 이주하여 신경세포와 신경아교 세포로 분화하기 위한 단계로 변형되는 양상을 관찰할 수 있었다. hUCB세포양성반응세포는 척수 손상부위에 집중적으로 분포하고 있는 양상을 관찰할 수 있었으나 Fig. 3. The results of the BBB assessment for open field loco-
motor behavior.
Fig. 4. The ability of rats to climb inclined wire mesh grid.
Fig. 5. Test of toe spread. Fig. 6. Test of leg extension.
손상부위의 경계와 손상받지 않은 정상부위에서는 전 혀 관찰할 수 없었다. 일부 연구자들은 뇌의 일정한 부 위를 손상시킨 다음 hUCB세포를 이식하여 신경세포와 신경아교세포로 분화하여 신경원성 퇴행질환을 치유하 는데 중요한 역할을 한다고 보고하였다6,11,16). 그러나 비 록 hUCB세포를 이용하여 생체(in vitro)에서 척수기능 회복에 관한 연구 보고가 지금까지 없어서 직접 비교 분 석할 수는 없지만 이와 같은 연구 결과로 보아 hUCB세 포는 마비된 척수기능을 회복시키는데 매우 효과적인 성체줄기세포라고 생각된다.
한편 여러 연구자들이 척수를 손상시킨 다음 2주일 후 에 사람신경줄기세포를 직접 손상부위에 이식한 결과 실 험쥐의 행동이 매우 양호하였다고 보고하였으며20,21,22), 이 는 사람신경줄기세포가 척수 손상부위를 치유하여 척수 기능을 회복시킨 것으로 추측되며 이는 신경원성 퇴행질 환을 치료하기 위하여 앞으로 hUCB세포와 비교하여 계 속 연구되어야 할 매우 흥미있는 대상으로 생각된다.
결 론
실험쥐의 척수를 손상시킨 후 hUCB세포를 꼬리정맥 을 통하여 주입하였을 때 광학 및 형광면역세포화학적 염색으로 척수의 손상부위에서 hUCB세포에 반응하는 MAB1237양성반응세포가 관찰됨으로써 정맥 투여된 hUCB세포가 척수 손상부위로 이동함이 확인되었고, 운 동평가에서 마비된 척수기능이 회복되는 것을 관찰할 수 있었으며 특히 척수 손상 후 3일과 5일에 hUCB세포 를 주입한 실험군이 다른 실험군에 비하여 기능 회복이 가장 양호하였다.
참고문헌
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※ 통신저자 : 유 재 원
광주광역시 동구 서석동 588 조선대학교병원 정형외과학교실
Tel: 82-62-220-3147 Fax: 82-62-226-3379 E-mail: [email protected]
연구계획: 척수 손상 쥐에서 사람탯줄혈액 줄기세포 투입 후 기능적 회복에 대한 동물실험
연구목적: 사람탯줄혈액(hUCB) 줄기세포를 척수 손상받은 실험쥐의 꼬리정맥에 투입하여 hUCB세포가 손상부위로 이동하는지 여부와 척수 손상 후 기능적 회복에 관여하는지 여부에 대하여 알아보고자 하였다.
대상 및 방법: 흰쥐 암컷 Sprague Dawley 30마리(220~250 gm)를 사용하였다. 제 1군은 척수 압박손상 1일 후 사람탯 줄혈액세포 주입군(SCI 1+hUCB), 제 2군은 3일 후 주입군(SCI 3+hUCB), 제 3군은 5일 후 주입군(SCI 5+hUCB), 제 4 군은 척추궁 절제술 후 주입군(L+hUCB), 제 5군은 척수 압박손상만 시킨 군(SCI), 제 6군은 척추궁 절제술만 시행한 군(L)으로 나누어 관찰하였다. 척수 손상은 흉추 제 8~9번째 부위를 척추궁 절제술을 하여 노출시켜 클립(55 g)으로 척수를 1분간 압박하여 손상시켰으며 hUCB 세포의 주입은 쥐의 꼬리정맥을 통해 한 마리당 0.5 ml(1.5×106)씩 주입 하였다. 실험동물은 척수 손상 후 28일 동안 사육한 다음 희생시킨 후 손상부위에서 hUCB 양성 반응 신경세포 (MAB1273)를 광학현미경과 형광현미경을 이용하여 관찰하였고 기능적 회복을 보기 위한 행동평가는 1주일 간격으 로 3회 실시하였으며 맨눈관찰, 철망 오르기, 뒷다리 펴는 운동, 발가락 운동의 상태를 디지털 비디오 테이프에 녹화 하여 관찰하고 평균점수로 환산하여 최종점수를 결정하였다.
결과: hUCB양성반응신경세포는 척수 손상군인 제 1-3군에서는 관찰되었으나 4-6군에서는 관찰되지 않았고 특히 제
3군에서 척수조직 1.2 mm2에서 약 870개로 가장 많은 분포를 보였다. 맨눈관찰의 운동평가에서 제 3군이 가장 빠른
호전을 보였으며 시간이 경과할수록 1군과는 현저한 차이가 있었다(p<0.01). 철망경사 오르기, 뒷다리 펴기 및 발가 락 운동 모두 제 3군에서 제 1, 2군 보다 양호한 호전을 보였다.
결론: 꼬리정맥을 통해 주입된 hUCB세포는 손상받은 척수로 이동하는 것이 관찰되었으며 행동평가 결과 척수 손상 후 5일째 hUCB 주입군에서 가장 양호한 결과를 보였다.
색인단어: 척수 손상, 사람탯줄혈액(hUCB), 조직학적 변화, 행동 변화 국 문 초 록
