병변을 구성하는 세포의 종류와 밀도를 생체 안에 있는 상 태 그대로, 비침습적인 방사선학적 방법을 이용해 알 수 있다 면, 병변의 전체적인 형태와 조영 증강 등의 속성에 추가하여 병변을 이해하는데 도움이 될 뿐만 아니라, 생체 내에서 살아 있는 세포의 기능에 대한 연구에 도움이 될 것이다(1). 최근 분자 영상의학에서는 자기공명영상(magnetic resonance imaging)을 이용하여 목적이 되는 세포(targeted cell), 주로 는 대식 세포 내에 superparamagnetic iron oxide (SPIO) 또 는 ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO)을 탐 식시키고 생체 내에서 추적(in vivo tracking)을 시도하는 연 구가 많이 진행되어 왔다(1-3). 이에 앞서, 현탁액 상태의 iron oxide 용액 농도가 높을 수록 자기 공명 영상의 신호강 도가 낮아진다는 것이 밝혀진 바 있고, 세포질 내의 iron oxide 의 농도와 in vitro MR 신호강도 간에 정량적 관계에 관한 연
구가 시행된 바 있다(4-6). 그러나 실제로 세포 내에 포함된 SPIO의 양이 생체 내 MR 영상에서 신호강도에 미치는 영향 에 관하여는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구는 SPIO 배양 용 액의 농도와 배양 시간이 SPIO가 대식세포 내로 표지 되는 데, 미치는 영향에 대해 알아보고자 한다. 또, 세포 내로 탐식 된 SPIO의 농도와 생체에서 시행한 자기공명영상의 신호 강 도의 상관관계를 알고자 한다.
대상과 방법
대식 세포의 분리
본 실험은 본원 동물 실험 위원회의 권고사항(recommen- dations of the committee on animal research)을 따랐고, 동 물 실험에 대한 동물실험위원회(institutional review committee)의 승인을 받았다.
수 세대에 걸쳐 동종 교배된 6주에서 8주 정도 나이의 수 컷 마우스(C3H/HeN, OrientBio, Sungnam, Korea, weight range, 20-25 g) 19마리를 표준화된 조명과 자유롭게 물과
대식 세포의 생체 내 추적에 있어 세포 내 SPIO의 양이 자기공명영상의 신호 강도에 미치는 영향
1김대윤・이진성・강주희・손진영・김상태2・우철웅2
목적: 배양 용액의 농도와 시간이 SPIO가 대식 세포 내로 표지되는데 미치는 영향에 대해 알 아보고자 한다. 대식세포 내 SPIO 농도와 생체에서 시행한 자기공명영상 의 신호강도의 상관 관계를 알고자 한다.
대상과 방법: 쥐의 복강에서 얻은 대식세포를 224, 112, 56, 28 μgFe/mL 농도의 SPIO 를 포 함한 용액에서 각각3, 6, 12, 24, 48시간 배양했다. 대식 세포 내 철 농도를 분광광도법으로 측정했다. 18 마리 쥐의 뒷다리에 각각 S. aureus를 주입하고 24시간 후, 세 개의 농도(112, 56, 28 μgFe/ml)로 24시간 배양하여 얻은 SPIO 표지 대식세포를 각각 6마리의 쥐에 경정맥 주입했다. MR로 농양 벽과 근육의 신호강도의 비(농양 SI / 근육 SI)를 구하고 Kruskal- Wallis test로 분석했다.
결과: 더 높은 SPIO 농도로, 더 오랜 시간을 배양할수록 대식세포 내 철 농도가 높아졌다(배 양 농도; p < 0.001, 배양 시간; p < 0.001). 세 집단 간 in vivo MR 신호강도도 세포 내 SPIO 농도가 높아질수록 의미 있게 낮아졌다 (112 μgFe/mL = 0.63; 56 μgFe/mL =0.67;
28 μgFe/mL =0.89, κ2=10.53, p < 0.005).
결론: 세포 내 SPIO 농도는 자화 감수성 효과에 의해 MR 신호 강도를 유의하게 감소시키므 로, 세포의 기능과 생존에 영향이 없는 한 SPIO를 많이 표지 시키는 것이 MR 영상의 대조 도에 좋다.
1울산대학교 의과대학 서울아산병원 방사선의학연구소, 방사선과
2울산대학교 의과대학 아산생명과학연구소
2006년도 아산생명과학연구소 연구비(06-384)의 지원을 받은 연구임.
이 논문은 2008년 1월 5일 접수하여 2008년 2월 20일에 채택되었음.
사료를 먹을 수 있는 환경을 제공하는 우리(cage)에서 키웠 다. 이 중 한 마리의 실험용 마우스의 복강 내에 3% 티오글 라이콜레이트(3% thioglycollate, 1 mL)를 주입하였다. 5일 후 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4, 250 g, 이하 PBS)로 복강 세척(peritoneal lavage)를 시행하 여 활성화된 대식세포가 있는 복강 세척액을 얻었다(7). 이 용액에 백혈구 추출용 용매(leukocyte separation medium, density 1.077 g/mL, PAA laboratories, Coelbe, Germany) 를 첨가한 후, 원심 분리(20 min, 400 g, 20°C)를 시행했다.
원심 분리 후 PBS로 침전법 (10 min, 250 g, 20°C)을 세 번 시행하여 세척하면서, 나누어진 층으로부터 대식 세포를 분리 하였다. 이렇게 얻어진 세포들은 RPMI 1640 medium(Gibco, Paisley, UK)에 섞은 후 3개의 웰플레이트(well plate)에 1×
106 cell/ 2 mL의 농도로 나누어 심고 한 시간 정도 웰플레 이트(well plate)에 부착시켰다. 한 시간 배양(37°C, a humidified 5% CO2 atmosphere)후 부착되지 않은 대식 세 포 (non-adherent macrophage)는 PBS로 씻어서 제거했다 (8).
대식 세포로의 SPIO 표지
duO(Pparamagnetic iron oxide)웰플레이트(Well plate)에 붙어 있는 단핵구들에 2 mL의 RPMI 1640 용액을 넣고, 10%
inactivated fetal serum, glutamine (4 mM), 페니실린(100 IU/mL), streptomycin (100 μg/mL)를 첨가했다. 이 용액에 각기 다른 농도(224, 112, 56, 28 μgFe/mL)의 SPIO (Feridex I.V. Advanced Magnetics, Cambridge, MA)를 넣었다. 또한, 각각의 농도에 대해 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간씩 시간을 달리하여 모두 20가지의 배양 조건으로 배양(37°C, a humidified 5% CO2 atmosphere)했다. 결합되지 않은 미세 SPIO 입자(particle)를 제거하기 위해 세포들을 15 mL 튜브 로 옮기고 침전법(10 min, 250 g, 20°C)으로 PBS를 이용해 3회 세척했다. 그 후 1 mL 의 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium, Gibco)로 다시 희석하였다.
SPIO에 대한 흡광도 분석의 표준화와 대식세포 내 SPIO 농도의 정량화
대식세포 내 철의 농도는 분광 지만 원자 방출 흡광기 (polarized Zeeman atomic emission absorption spectrometer, Hitachi, model Z-8200, Japan)을 이용하여 248.3 nm의 파 장(8)에 대한 원자 방출 흡광법(atomic emission absorption spectrometry)으로 정량화했다.
흡광도를 측정하기 전에 표준화를 위해 대식 세포 100개를 0.05M HCl 용액에 넣고 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer로 희석하여 세포를 파괴(cell lysis)시켜 현탁액 (suspension)을 만들었다. 0.4375 μgFe/mL 에서 112 μ gFe/mL까지 농도가 다른 9개의 SPIO 용액을 미리 만든 후 앞서 언급한 현탁액과 섞었다. 이 혼합 용액의 흡광도를 측정 하여 철의 농도와 흡광도 사이의 관계를 구했다(8).
이전 과정에서 만들어진 20개 군의 SPIO로 표지 된 대식
세포 200×103개의 세포를 뽑아서 0.05 M HCl 용액을 넣고 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer로 희석하여 현탁 액을 만든 후 흡광도를 측정했다.
각각의 농도로 24시간 동안 배양된 대식 세포에 대해 철 염 색(Prussian blue staining)을 하고 400 배율의 광학현미경으 로 관찰했다.
배양 농도와 배양 시간에 따라 흡광도가 유의한 차이가 있 는지를 통계적으로 알아보기 위해 반복이 있는 이원배치법을 이용하여 분산분석을 시행하였다. SPSS 12.0K (SPSS inc, Chicago, Illinois) 통계분석 프로그램을 이용하였다.
농양 형성과 대식세포의 결집
복강에서 대식 세포를 얻었던 마우스와 똑같이 동종 교배된 실험용 마우스 18마리의 왼쪽 뒷다리 대퇴부에 30 μl (2×109 /colony unit/mL)의 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, 25923; American Type Culture Collection, Manassas, Va)용 액을 직접 주입하여 농양을 형성시켰다. 그로부터 24시간 후, 다른 농도(28, 56, 112 μgFe/mL)의 용액에서 24시간 배양된 세 집단의 대식 세포(6×105 cells/injection)를 각각 6마리의 마우스의 꼬리에 있는 정맥을 통해 주입했다. 28, 56, 112 μ gFe/mL의 배양 용액에서 24시간 배양된 세 집단의 대식 세 포를 선택한 이유는, Fig. 1에서 log(OD)값이 -0.7에서 -0.32 일 때 대식 세포 내 SPIO 의 농도를 직선의 식을 통해 구하 는 것이 가장 정확했기 때문이다.
자기 공명영상 촬영과 영상 분석
대식 세포를 마우스의 경정맥으로 주입하고 나서 48시간이 지난 후, 마우스를 전신마취(anesthesia, 1.5% isoflurane in a 1:2 mixture of O2/N2O) 시켰다. 4.7 T 브루커 바이오스핀 영상기기(Bruker Medical system, Karlsruhe, Germany)로 T2* 강조 경사 에코 기법(repetition time, 356.5 msec; echo time, 10.3 msec; flip angle, 30°)을 이용하여, 자기 공명 영 상을 시행했다(9). 공간 해상도는 다음과 같이 결정하였다 (256×256 matrix, field of view; 2.18 cm ×2.06 cm, section thickness; 0.67 mm, section gap; 0.33 mm, number of sections; 16). 대퇴부 전체를 포함하는 대퇴골에 수직인 축 상면 영상(axial image)을 얻었고 그 중에서 농양이 시각적으 로 가장 잘 보이는 영상을 선택하여, 5 mm2 직사각형의 관 심영역(ROI, region of interest) 을 그렸다. 관심 영역 안으 로 원하지 않는 부분이 들어가지 않도록 주의하면서 농양 벽 의 신호 강도와 그 인근의 근육의 신호 강도를 동일한 영상 의 다른 위치에서 각각 3회 측정했다. 앞서 언급한 대로 똑같 이 18마리의 마우스에서 신호 강도의 측정을 반복했다. 근육 에서 대조군의 위치를 정할 때, 대조군 관심 영역과 표면 코 일(surface coil) 간의 거리가 농양 벽의 관심영역과 표면 코 일 간의 거리와 같도록 위상 부호화 축상에서의 위치를 결정 했다. 그 후, 농양 벽과 대조군의 신호 강도로부터 신호강도 의 비, 즉 상대적 신호강도(relative SI of abscess = signal intensity of abscess wall / signal intensity of muscle)를 계
산했다. 이 상대적 신호강도(Relative SI) 는 한 마리의 마우 스마다 같은 영상 단면에서3번 측정하였으므로, 그 평균값 (mean of relative SI)을 계산하여 통계 분석했다.
통계 분석
6개씩 세 집단에서 얻은 18개의 평균 relative SI에 대해, 세 집단 간의 유의한 차이가 있는지를 Kruskal-Wallis test 와 사후 점검인 Tukey-HSD test로 분석하였는데, SPSS version 12.0K (SPSS inc, Chicago, Illinois) 소프트웨어를 이 용하였다.
결 과
Iron oxide 농도와 흡광도의 관계
이미 그 농도를 알고 있는0.4375 μgFe/mL에서 112 μ gFe/mL까지 단계적으로 높아지는 9개의 SPIO 부유액 (suspension)에 대해 분광 광도법을 이용해서 농도(conc) 에 대한 흡광도(OD, optical density)를 측정했고, 이 값에 대한 각각의 Log10(OD) 와 Log10(conc)값을 구했다(Table 1).
0.4375 μgFe/mL의 SPIO 현탁액 용액의 흡광도(OD)는 0.060 이었고, 112 μgFe/mL에서는 0.918로 SPIO 농도가 올라갈수 록 흡광도도 높아졌다. 이 두 값을 로그 값(log)으로 치환한 후 그 분포를 그렸다(Fig. 1). 선형회귀 분석을 시행하여 유 의한 직선적인 상관 관계에 있음을 확인할 수 있었고(r2 = 0.8413, p < 0.05), 그 분포를 가장 잘 나타내는 선형적인 관 계식(1)을 구할 수 있었다(Fig. 1).
Log10(conc) = Log10(OD)×1.1299+1.5829 식 (1)
배양 농도와 배양 시간에 따른 세포 내 iron oxide 양의 변화 각각의 농도(224, 112, 56, 28 μgFe/mL) 와 배양 시간(3h, 6h, 12h, 24h, 48h)에 대해 각각 2회의 흡광도를 측정했고, 그 평균을 구했다. 이 평균값을 식(1)을 이용해 세포 내 SPIO 의 평균 농도를 계산할 수 있었다. 또 분석한 용액 내의 세포 수가 200×103개이므로, 한 개의 세포에 있는 SPIO 농도를 계산하여 구했다. 28 μgFe/mL 의 배양액 농도에서 배양했을 때, 배양 시간당 대식 세포 내 농도를 보면 배양 시간 3시간 에서 1.356 μg/mL (0.006778 pg/cell), 48시간에서 5.670 μ g/mL (0.02835 pg/cell)까지 점진적으로 증가하는 경향이 있 었다. 56, 112, 224 μgFe/mL 의 배양액 농도에서도 마찬가 지로 배양 시간이 길어질수록 세포 내 SPIO 농도가 증가했 다. 또 24시간 동안 28, 56, 112, 224 μgFe/mL의 SPIO 용 액으로 배양한 경우 각각 6.176 μg/mL (0.03088 pg/cell), 7.542 μg/mL (0.03771 pg/cell), 16.64 μg/mL (0.08321 pg/cell), 22.95 μg/mL (0.1148 pg/cell)의 농도를 보여 배양 액의 농도가 짙어질수록 대식 세포 내로 표지된 철의 농도도 역시 증가했으며, 배양 시간이 3, 6, 12, 48시간이 경우에도 마찬가지로 배양 농도가 높아 질수록 세포 내 철의 농도가 증 가했다. 28 μgFe/mL 의 농도로 3시간 배양했을 때는 평균 흡 광도(OD) 값이 최소인 0.052(1.356 μgFe/mL)를, 224 μ gFe/mL의 농도로 48시간 배양했을 때는 평균 OD 값이 최대 인 0.697(25.45 μgFe/mL)을 보였다. 배양시킨 후 대식 세포 내 철에 대해서 구한 흡광도의 대부분이, 오차가 크지 않은 0.1에서 0.6사이에 있었고(Fig. 1), 이는 log(OD) 값으로는 - 1.0 에서 -0.22 사이에 해당되어 식(1)을 통해 대식 세포 내 농도를 추정하는데 문제가 없었다.
24시간 동안 각각의 농도에서 배양한 대식 세포 들을 철 염 색(Prussian blue staining)을 하고 400 배율의 광학현미경으 로 관찰하였다(Fig. 2). 이 결과를 삼차원 막대 그래프를 이 용하여 표현하였다(Fig. 3).
반복이 있는 이원배치법을 이용한 분산분석에서도 배양 용 액의 농도와 배양 시간 모두 통계적으로 흡광도에 유의한 영 향을 주었다(배양 용액의 농도; p < 0.001, 배양 시간; p <
0.001). 또한 배양 농도와 배양 시간 사이에는 유의한 상호작 용이 존재하지 않았다(p = 0.570). 즉, 배양 농도가 흡광도
Table 1. Correlation between the Optical Density and the Concentration of the Standardized SPIO Suspension
Concentration (μg/mL) Log10(conc) OD Log10(OD)
112 2.049 0.918 -0.03715
056 1.748 0.891 -0.05012
028 1.447 0.865 -0.06298
014 1.146 0.679 -0.1681
007 0.8451 0.417 -0.3799
3.5 0.5441 0.241 -0.6180
01.75 0.2430 0.116 -0.9355
000.875 -0.05799 0.023 -1.638 0000.4375 -0.3590 0.060 -1.222 OD: Optical Density
Fig. 1. Distributions of the Optical Density (OD) according to the nine SPIO suspensions with the certain concentrations.
There was the significant linear correlation between Log10(conc) and Log10(OD) through linear regression (r2 = 0.8413, p < 0.05). The formula 1, Log10(conc) = Log10(OD)×
1.1299+1.5829, was derived from the linear regression.
에 미치는 영향이 배양 시간에 따라 달라지지 않는 것으로 나 타났다. Tukey-HSD 방법을 이용한 사후분석에서 배양농도 의 결과를 보면 3개의 소집단으로 묶을 수 있는데, 농도가 28 μg/mL, 56 μg/mL 인 것들끼리는 유의한 차이가 없고, 56 μ g/mL, 112 μg/mL 사이에도 유의한 차이가 없었으며, 112 μ g/mL, 224 μg/mL 사이에도 유의한 차이가 없었다. 그 외의 조합에 대해서는 유의한 차이가 존재한다. 배양시간의 결과를 보면 역시 3개의 소집단으로 묶을 수 있는데, 시간이 3시간, 6시간, 12시간인 것들끼리는 유의한 차이가 없고, 12시간, 24 시간 사이에도 유의한 차이가 없었다, 24시간, 48시간 사이에 도 유의한 차이가 없었다. 그 외의 조합에 대해서는 유의한 차이가 존재했다.
SPIO 표지 대식 세포의 생체 내 자기 공명 영상의 신호 강도 측정 한 집단 내에 있는 여섯 마리의 마우스의 농양의 크기는 농
양의 직경이 최대인 축상면 영상에서 그 최대 직경을 측정하 여 비교하였는데, 그 평균값은 각각 28, 56, 112 μgFe/mL 집단에서 각각 3.6 mm×2.7 mm, 3.0 mm×2.9 mm, 2.8 mm×3.8 mm로 거의 비슷했다. 농양 벽과 근육의 신호 강도 를 측정했고(Fig. 4), 그 비인 rSI값(relative SI of abscess) 를 계산한 결과는 다음과 같다. 112 μgFe/mL 의 경우 평균 relative SI의 값은 0.5233 에서 0.7647 사이에 있었고, 그 평균은 0.634이었다. 56 μgFe/mL 의 경우 평균 relative SI 의 값은 0.6445와 0.8465 사이에 있었고, 그 평균은 0.763 이었다. 28 μgFe/mL 의 경우 평균 relative SI 의 값은 0.7498 와 1.012 사이에 있었고, 그 평균은 0.8870 이었다(Fig. 5).
세 집단간 상대적인 신호강도(relative SI) 값에 대해 Kruskal-Wallis test 의 결과, 각 집단간 분산의 동질성이 확 인되었고, 세 집단의 relative SI의 평균 값은 유의한 차이가 났다(κ2=10.526, p < 0.005). 또, Tukey-HSD test를 이용
A B
C D
Fig. 2. Photographs of macrophages, incubated with different SPIO concentrations for 24 hours on the light microscopy (A; 28 μ g/mL, B; 56 μg/mL, C; 112 μg/mL, D; 224 μg/mL, respectively). A-D show that the higher incubation concentration led to the more dense staining of iron within the cytoplasm of the macrophages on Prussian blue staining, suggesting increased iron concentrations (×400).
한 사후 검정에서는 각각 112 μgFe/mL과 28 μgFe/mL 농도 에서 배양된 대식 세포 집단 간에만 상대적인 신호 강도 (relative SI) 값에 유의한 차이가 있었고(p < 0.001), 그 외 의 집단간에는 유의한 차이가 없었다.
고 찰
이번 실험 결과, 같은 조건이라면 대식 세포질 내로 탐식된 철 농도는 배양 시간이 길수록, 또한 배양액의 농도가 높아질 수록 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 통계적으로도 배양 액의 농도와 배양 시간이 각각 대식 세포 내 철의 농도에 영 향을 미치는 것이 확인되었다. 그러나 배양액의 농도와 배양 시간 사이에는 서로 영향을 미치지 않았다. 각각의 SPIO 농 도(224, 112, 56, 28 μgFe/mL)에 대해 배양 시간(3h, 6h, 12h, 24h, 48h)을 달리하여 배양한 결과, 28 μgFe/mL의 농 도로 3시간 배양했을 때는 평균 흡광도(OD) 값이 최소인 0.052(1.356 μgFe/mL)를, 224 μgFe/mL 의 농도로 48 시간 배양했을 때는 평균 OD 값이 최대인 0.697(25.45 μgFe/mL) 을 보였다. 흡광도 값이 위의 범위 내에 있을 때, 배양 농도 와 배양 시간이 증가할수록 세포 내 철의 농도가 증가했다 Fig. 3. Diagram of iron amount per macrophage according to
the incubation time and incubation concentration of SPIO so- lution. Both of incubation time and concentration increased the iron amount per macrophage, independently on the re- peated two-way ANOVA (incubation time; p<0.001, incuba- tion concentration; p<0.001).
A B
C
Fig. 4. Axial images for the abscess in the thighs of the mice on MR (4.7T, T2*-weighted gradient echo, TR: 365.5msec, TE: 10.3 msec, FA: 30°).
A-C. show abscesses (arrow) in the thighs of mice injected with macrophages which were incubated with different concentrations of 28 mgFe/mL, 56 mgFe/mL, 112 mgFe/mL, respectively. We measured the signal intensities of abscess wall and adjacent muscle with 5 mm2rectan- gular ROIs (□), respectively and calculated the relative signal intensity.
The subtle differences of signal intensity were identified, visually, be- tween three groups with the different concentrations of iron within a macrophage. There were also significant differences of relative signal in- tensities between three groups, statistically (p<0.005).
(Fig. 3). 식(1)을 유도한 첫 번째 실험의 OD 값이 0.060에 서부터 0.918 사이에 있으므로(Table 1), 식(1)을 적용하는 데 문제가 없었다. Fig. 1에서 평균 OD 값이 최소인 값과 최 대인 값 근처에서 측정의 오차가 약간 커지지만, 배양시킨 후 대식 세포 내 철에 대해서 구한 흡광도의 대부분이 0.1에서 0.6사이에 있었고, 이는 log 값으로 치환하면 log(OD) 값으로 는 -1.0 에서 -0.22 사이에 해당했다. Fig. 1에서 비교적 직 선 식과 상관관계가 높은 가운데 부분에 데이터가 위치해 있 었다.
생체 내 실험에서는 농양 주변으로 모여든 대식 세포가 같 은 수와 같은 밀도를 보인다면, 세포질 내 철의 농도가 다른 경우, T2* 강조 경사 에코 기법을 이용한 자기 공명 영상에 서 신호 강도가 달라진다는 것을 확인할 수 있었다. 즉 배양 시간을 가능한 길게 하고, 배양액 농도를 가능한 높게 하는 것이 자기 공명 영상을 이용한 대식 세포의 생체 내 추적(in vivo tracking)에 있어 주변 조직과의 대조도를 증가 시키는 이득이 있을 것으로 보인다. In vivo 실험에서는 28, 56, 112 μgFe/mL 의 SPIO 농도에서 24시간 배양된 대식 세포를 선 택했는데, 이는 평균 흡광도 값이 0.199(6.176 μgFe/mL)에 서부터 0.479(16.64 μgFe/mL) 에 해당하고 log(OD) 값으로 는 -0.70에서부터 -0.32까지 해당한다(Table 1) (Fig. 1).
배양액 농도가 224 μgFe/mL에서 24시간 배양한 경우는 log(OD) 값이 -0.19 정도되는데, Fig. 1에서 log(OD) 값이 -0.2 이상부터는 흡광도를 이용한 대식 세포 내 철의 농도 추정에 측정오차가 커지기 때문에 in vivo MR 실험에는 제외 했다.
즉, SPIO가 많이 표지될수록, 주변 조직과의 대조도가 높아 져 시각적 탐지가 더 쉬워지기 때문에, 생체 내 추적의 민감 도(sensitivity)를 올릴 수 있다고 생각된다. In vitro 실험에서 Fleige 등(4)은 neutral carboxydextran-coated USPIO로 표 지 된 대식세포가 1×106개 있을 때, MR 신호 강도의 감소 를 눈으로 감지할 수 있다고 하였다(4). 이 등(5)에 의하면 1.5 T 자기 공명영상에서 SPIO로 표지 된 대식세포가 488개 이상부터 자기 공명 영상에서 신호강도가 감소 되는 것을 확 인했다(5). 그러나 실제 생체 내에서는 주변 조직과의 낮은 대조도에 의해 그 민감도가 더 감소될 것으로 보여, 가능한 한 대식 세포 내 표지된 SPIO 농도를 높이는 것이 목표가 되 는 세포(targeted cell)의 탐지에 도움이 될 것으로 생각된다.
이 번 연구는 SPIO 용액 112 μgFe/mL 에서 24 시간 배 양하여 대식 세포 내 철의 최대 농도가 16.64 μgFe/mL 인 경우까지 MR의 신호강도를 측정했고, 그 이상의 농도는 포함 되어 있지 않다. Raynal 등(6)은 SPIO 농도 100과 500 μ gFe/mL 에서 48시간 동안 대식세포를 배양하였을 때, 대식 세포가 분비한 인터루킨-1의 농도가 소량이어서, 대식세포에 섭취된 SPIO는 대식세포를 자극하지 않는다고 주장했다(6).
Arbab 등(10)과 Bulte 등(11)은 SPIO 의 잠재적 독성이 대 식 세포의 생존과 증식에 영향이 없다고 하였다(10, 11). 그 러나 SPIO 농도가 200 μgFe/mL 이상인 용액에서 표지 된 대식 세포를 이용하여 생체 내 MR 신호를 측정해 본적이 없 기 때문에, 이에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 다만, 이 등 (5)은 시행한 in vitro 연구에서 SPIO 현탁액의 농도가 28 μ gFe/mL 이상부터는 신호 강도 감소가 비례적이지 않았다고 하였다(5). 이를 감안하여 적절한 세포 내 SPIO 농도를 위한 적절한 배양 조건을 맞추어야 한다.
비슷한 실험을 한 Raynal등(6)은 62.5와 250 μgFe/mL 의 SPIO 농도에서 대식세포를 2시간 동안 배양했을 때, 각각 한 개의 세포당 5와 7.7 pg의 철(Fe)이 있었다고 보고 했다. 본 실험에서 비슷한 조건인 56 과 224 μgFe/mL의 SPIO 농도로 3시간 배양했을 때 0.01331 과 0.03281 pg/cell 을 보여 약 250 배에서 400배 가량의 세포 내 농도차이를 보였다. 또 Raynal 등(6)에 의하면 100 μgFe/mL의 배양액에 대식세포 를 24와 48시간 배양하였을 때, 대식세포 내에는 각각 2.5, 2.9 pg의 철(Fe)이 있었다. 이는 112 μgFe/mL 에서 24, 48 시간 배양한 비슷한 조건의 본 실험 결과인 0.08321과 0.1056 pg/cell 과 비교할 때 역시 30 배 가량 차이가 났다. 이러한 차이는 실험에 사용된 세포의 종류와 SPIO의 성상에 따른 차 이라고 생각된다.
이번 연구에서 생체에서 시행한 자기 공명 영상은 철의 농 도가 다를 때 신호 강도 감소의 차이를 시각적으로 인식할 수 있어 대식 세포의 존재를 추정할 수 있었고, 통계학적으로도 집단 간에 유의한 차이가 있었다.
결론적으로 대식 세포 내로 표지 된 철의 농도는 배양에 쓰 이는 SPIO 용액을 고농도로 할수록, 배양 시간을 길게 할수 록 증가하는 경향이 있다. 또한, 주어진 범위 내에서 대식 세 포 내 철의 농도가 증가하면, 자기 공명 신호 강도도 증가하 Fig. 5. Distribution of relative signal intensities according to
three groups with different incubation concentrations of SPIO solution (28 mgFe/mL, 56 mgFe/mL, 112 mgFe/mL). The up- per and the lower lines of central large boxes show 25 per- centile and 75 percentile of distribution within each group, repectively. The upper and the lower transverse lines of the three longitudinal lines show the maximal and minimal values of relative signal intensities (rSIs) within three groups. Mean values of them were 0.887, 0.763, 0.634, respectively and showed significant differences between three groups, statisti- cally (p<0.001).
므로 대식 세포 내 SPIO 농도를 증가시키는 것이 생체 내 대 식 세포 추적에 도움이 될 수 있다.
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Address reprint requests to : Jin Seong Lee, M.D., Laboratory for Molecular and Functional Image, Department of Radiology and Research Institute of Radiology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center
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The Impact of the Amount of Intracellular SPIO on MR Signal Intensity during In Vivo Tracking of Macrophage Homing
1Dae Yoon Kim, M.D., Jin Seong Lee, M.D., Juhee Kang, Jin Young Sohn, Sang Tae Kim2, Chul Woong Woo2
1Department of Radiology and Research, Institute of Radiology, University of Ulsan College of medicine, Asan Medical Center
2Asan Institute for Life Science, University of Ulsan College of Medicine
Purpose: To determine whether the amount of intracellular superparamagnetic iron oxide (SPIO) in macrophages influences MR signal intensity during in vivo celluar tracking.
Materials and Methods: Peritoneal macrophages harvested from thioglycolate-treated mice were labeled with SPIO using concentrations of 112, 56, and 28 μgFe/ml, and different incubation times of 3h, 6h, 12h, 24h and 48 h, respectively. The iron concentration was quantified with the use of absorption spectrophotometry. Each group of macrophages labeled with different concentrations of SPIO was intravenously injected into 18 mice, after inoculation with S. aureus to the thigh. The relative signal intensity (SI) of the abscess wall (SI of the ab- scess wall/SI of muscle) was measured on MR and was analyzed by the use of the Kruskal-Wallis test.
Results: A higher concentration of SPIO in the labeling solution and a longer incubation time resulted in a higher concentration of SPIO in the macrophages. The relative SI of the abscess wall (0.63 for 112 μgFe/mL;
0.67 for 56 μgFe/ml; 0.89 for 28 μgFe/mL) significantly decreased with an increase of SPIO concentration (κ2= 10.53, p < 0.005).
Conclusion: The amount of intracellular SPIO influences the MR signal intensity by the susceptibility effect, and it is recommended to use sufficient iron-oxide label as long as it does not affect cellular function and viabil- ity.
Index words :Superparamagnetic iron oxide Macrophage
Magnetic resonance (MR) Mouse
