Journal of Bacteriology and Virology 2008. Vol. 38, No. 2 p.77 – 87
Integrated Cell Culture-PCR Detection of Enteroviruses and Reoviruses in Water Sources in Gyeonggi-do
Kyung-A Kim
*, Jong-Chan Kim, Hoan-Uck Ko, Jung-Bock Lee, Young-Sug Kim, Yong-Bae Park, Myung-Jin Lee, Myung-Gill Kim, Jae-Kwan Kim, Eun-Mi Park
Gyeonggi-do Institute of Health and Environment, 324-1, Pajan-dong, Jangan-gu, Suwon, 440-290, Republic of Korea
Received : March 30, 2008 Revised : April 30, 2008 Accepted : May 19, 2008
The integrated cell culture-PCR (ICC-PCR) method has been suggested as an improved method for detection of viruses in water environments. We tested 57 source waters including finished water samples in Gyeonggi-do for enteric viral contamination using total culturable virus assay (TCVA) using BGMK cells and ICC-PCR. Nineteen of the 57 source water samples (33.3%) exhibited the cytopathic effect (CPE) on BGMK cells and no finished water did exhibited CPE. Nineteen samples (33.3%) of the 57 were positive for reoviruses. For the enteroviruses, only 3 samples (5.3%) of the 57 samples showed positive results. By using ICC-PCR method, 202 flasks from source water samples were positive for enteroviruses and reoviruses. Three samples from source water were positive for both viruses. However, any flasks tested was not co-infected with two types of viruses. While the enteric viral frequencies in TCVA and ICC-PCR were similar, the viral frequency for reoviruses at first passage in two type of method was higher in ICC-PCR (94.7%) than TCVA (56.9%).
Key Words: Integrated cell culture-PCR (ICC-PCR), Total culturable virus assay (TCVA), Enteroviruses, Reoviruses
서 론
포유동물의 분변에서 배출된 후 하수, 처리수, 지표수 또는 지하수 등에 오염되어 경구경로를 통해 인체에 유 입된 후 소화기계에 감염되는 바이러스를 총칭하여 장 관계바이러스 (enteric viruses)라고 한다 (4). 장관계바이러 스에 감염된 사람의 분변에는 1 g당 약 106~109개의 바 이러스 입자가 존재하며 분변을 통하여 배출되어 직 · 간 접적으로 음용수로 사용되는 상수원수를 오염시키게 된 다 (4). 특히, 지표수와 지하수는 다양한 경로를 통해 분 변에 의해 오염되고 있다. 분변에서 다량 분비되는 장관
계바이러스로는 폴리오바이러스 (poliovirus), 콕사키바이 러스 (coxsakievirus), 에코바이러스 (echovirus) 등으로 구 성된 엔테로바이러스 (enterovirus)가 있으며, 그밖에 아 데노바이러스 (adenovirus), 레오바이러스 (reovirus), 로타 바이러스 (rotavirus), A형 간염 바이러스 (hepatitis A virus;
HAV), E형 간염 바이러스 (hepatitis E virus; HEV) 그리고 노로바이러스 (norovirus)와 같이 급성감염성 장염을 일으 키는 바이러스 등이 포함된다 (5). 이러한 장관계바이러 스는 엔테로바이러스 (enteroviruses), 레오바이러스 (reo- viruses) 등과 같이 특이적인 세포주에서 배양하여 세포 독성을 나타내는 배양성바이러스가 있는가 하면 배양은 가능하나 현저한 세포독성을 나타내지 못하는 바이러스 도 존재한다 (9,13,30).
Enteroviruses는 positive sense ssRNA virus로서 Picorna- virus 과 (Familiy), Enterovirus 속 (Genus)에 속하며 Polio- virus, Coxsackievirus A group, Coxsackievirus B group, Echo- 77
*Corresponding author: Kyung-A Kim. Gyeonggi-do Institute of Health and Environment, 324-1, Pajan-dong, Jangan-gu, Suwon, 440-290, Republic of Korea.
Phone: +82-31-250-2641, Fax: +82-31-250-2635, e-mail: [email protected]
virus 및 New enterovirus 등을 일컫는데, 현재 약 70여종 이 알려져 있다 (7,25). 장관에서 증식할 수 있는 능력 덕 분에 이름 붙여진 엔테로바이러스는 사람이 유일한 자연 숙주이며, 주로 분변-경구 또는 경구 (호흡기) 경로를 통해 사람에서 사람으로 전파되어 소아의 경우 무균성 수막염, 수족구병, 급성 이완성마비 등과 같은 질환을 흔 히 일으킨다 (24). 감염의 발생률은 성별과 무관하나, 남 아에서 심한 증세를 보이며, 분변-피부-경구의 경로로 소아에게 쉽게 전파되고 가족내 전파도 쉽게 일어난다 (24,35).
Reoviruses (respiratory enteric orphan viruses)는 1959년 Sabin에 의해 poliovirus를 연구하는 중 분리되었다 (36).
이는 호흡기와 소화기 장관을 통하여 감염되나 알려진 어떤 질병과도 연관되어 있지 않은 (orphan) 새로운 집 단의 바이러스들로서 다른 알려진 엔테로바이러스보다 크기가 크고 원숭이 신장조직 세포배양에서 cytoplasmic inclusions을 생성하는 능력이나 신생마우스에 대한 감염 력, 인간O형 적혈구응집에 따라 구분된다 (23,42). 전형 적으로 무증상 또는 경미한 호흡기 감염을 유발하나 연 구에 의하면 잠재적으로 심각한 질병과 연관되어 있을 수 있다고 한다 (19,41). 일반적으로 자각증상을 느낄 수 없거나 가벼운 위장관염이나 호흡기 질환만을 나타낸다 (41). Reoviruses는 신생아 간염, 담관폐쇄증, 수막염 및 심근염 등과 관련되어 왔다. 그러나 면역기능 저하자나 어린이 혹은 노인 등이 감염될 경우 감염 초기 이후에 심각한 세균성 호흡기 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다 (12).
먹는 물에 사람을 숙주로 하는 장관계바이러스가 존재 한다는 것은 그 물이 사람의 분변에 오염되어 있음을 의 미한다. 그러나 실질적으로 모든 살아 있는 수인성 바이 러스를 검출할 수 있는 방법은 아직 존재하지 않으므로 (9,28) 지표바이러스를 설정하여 사람의 분변에 의한 바 이러스 오염여부와 수준을 감시, 판단하는 것은 오랜 시 간과 노력을 동원하지 않으면서 분변에 의한 수질오염사 고를 미연에 방지할 수 있다. 현재 총배양성바이러스 검 사법은 140여종이 넘는 수인성 바이러스 중 지표바이러 스로서 70여종의 혈청형을 포함하는 (35) Enteroviruses의 배양 및 검출을 목적으로 하고 있다. Reoviruses는 entero- viruses와 함께 수계에서 가장 많이 검출되는 바이러스로 서 분변오염의 이상적인 지표바이러스로 대두되고 있다 (13,18,27~29,41).
총배양성바이러스 검사법 (total culturable virus assay;
TCVA)은 수계환경에서 가장 높은 빈도로 검출되는 특정 바이러스가 세포배양을 통하여 검출될 경우 분변에 의한 오염을 나타내고, 다른 장관계바이러스도 오염되어 있을 수 있다는 것을 전제로 하여, BGMK 세포주를 사용하여 엔테로바이러스의 오염수준을 판단하고, 일반적인 지표 세균이나 박테리오파지의 존재여부만으로는 가늠하기 어 려운 바이러스 오염의 전반적인 수준을 정량적으로 가늠 하게 된다 (10,11,26).
환경시료에 있어서 장관계바이러스를 검출하는 대체 방법은 PCR (polymerase chain reaction)인데 총배양성바이 러스 검사법과 같은 세포배양법에 비해 시간과 비용이 덜 들고, 민감도도 더 높아 물 시료에 존재하는 바이러스 의 일상적인 모니터링에 유용하다 (4). 그러나 PCR로는 바이러스의 감염력을 구별할 수 없으며 세포배양법에 비 해 극히 적은 시료만 사용될 뿐 아니라 효소반응이기 때 문에 물 시료의 농축과정에서 농도가 높아지는 반응 저 해 물질에 의한 위음성 결과 (false-negative result)가 나타 날 수 있다는 단점이 있다 (30,33,38).
ICC-PCR (integrated cell culture-PCR)은 세포배양법과 PCR을 결합하여 바이러스를 동정하는 방법이며, 불활성 화된 바이러스의 핵산 증폭을 피할 수 있다. 세포단층에 농축된 시료를 접종하여 배양함으로써 존재하는 감염성 있는 바이러스의 복제를 가능하게 하고, 이것은 PCR에 의한 감염성 있는 바이러스를 검출할 수 있는 가능성을 증가시키며 또한 매우 적은 수의 감염성 있는 바이러스 를 복제, 증폭시킴으로써 검출 민감도를 높인다. ICC- PCR 방법으로 HAV와 같은 전형적인 세포병변을 일으키 지 않는 병원성 바이러스의 특이적인 검출과 정량적인 동정이 가능하다 (8,13~15,30,31).
본 조사연구는 경기도내 정수장의 상수원수에서 entero- viruses와 reoviruses를 검출하게 위해 ICC-PCR법을 이용 하였으며, 총배양성바이러스 분석법과 ICC-PCR법 비교 분석을 통하여 바이러스 오염실태와 분포특징을 파악하 고 취수원의 바이러스 모니터링을 위한 자료를 제시하고 자 하였다.
재료 및 방법
1. 시료채취 및 전처리
경기도내 팔당호, 한강수계, 임진강, 한탄강, 안성천,
계정천, 흑천, 진위천, 영평천 및 지하수 등을 취수원으 로 하는 43개 정수장의 원수에 대하여 조사를 실시하였 다. 1일 처리용량 5만톤 이상, 5만톤 이하인 정수장 각각 의 16개소, 27개소에 대하여 2006년 한해 동안 1~2회에 걸쳐 총 57건 원수를 채수하여 바이러스 분석에 사용하 였다. 시료채취는 미국환경청 (USEPA)의 ICR 바이러스 규정에 준하여 시행하였고, 원수는 200~300 ℓ의 시료를 10 μm 1MDS filter cartridge (CUNO Inc., Meriden, CT, USA) 에 흡착시켜 채수하였고, pH가 8 이상인 곳은 0.1 M HCl 을 이용하여 pH를 6.5~7.5사이로 조정하여 채수하였다.
탁도가 75 NTU (nephelometric turbidity unit)가 넘는 곳은 전필터 (prefilter)를 사용하였다. 시료채수 시 온도, pH, 탁 도, 잔류유리염소를 현장에서 측정하였다. 시료채취기구 는 고압증기멸균을 실시하였고 멸균기의 압력과 열을 견디지 못하거나 부피가 커서 멸균기에 넣을 수 없는 것 은 0.1% 염소용액으로 소독하여 멸균한 후 2% sodium thiosulfate 용액으로 염소를 중화하였다. 채수가 완료된 필터카트리지는 플라스틱백에 넣어 아이스박스에 담고 아이스팩으로 덮어 냉장상태로 만들어 준 후 즉시 바이 러스 분석실험실로 이송하였고, 냉장된 상태로 도착한 필터는 시료채취 시작시간으로부터 72시간 이내에 바이 러스 탈리과정 (elution) 및 유기응집 농축과정 (organic flocculation concentration)을 거쳐 최종 약 30 ml의 부피로 농축하였다.
2. 세포주 및 바이러스
Poliovirus type 3는 질병관리본부 국립보건연구원에서 분양받아 세포병변 양성대조군과 ICC-PCR 수행 시 양성 대조군으로 사용하였다. 총배양성바이러스를 분석하기 위해 사용된 숙주 세포주는 BGMK (buffalo green monkey kidney cell, Biowhitaker 117~250 passage와 국립환경연구 원의 분양세포)세포를 3~6일 증식배양하여 사용하였 다. MEM/L-15 배지 940 ml에 미리 준비한 penicillin- streptomycin (10,000 μg/ml, 25 μg/ml) 10 ml, 우태혈청 50 ml 을 첨가하여 세포배양용 배지로 사용하였다. 검출에 사 용한 양성대조군은 reovirus type 1 (ATCC VR-230, Lang), reovirus type 2 (ATCC VR-231, Jones), reovirus type 3 (ATCC VR-824, Dearing)를 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입 하여 사용하였다.
3. 총배양성바이러스 분석
총배양성바이러스의 분석은 ICR Microbial Laboratory Manual (USEPA, 1996a)을 따랐다 (43). BGMK 세포주는 바이러스 감염에 감수성이 높은 117~250번의 계대배양 세포로 3~6일간 배양하여 바이러스 분석에 사용하였다.
세포는 혈청이 포함되지 않은 MEM/L-15 배지로 세척한 후 시료접종에 사용하였다. 접종시료량은 assay sample volume을 20으로 나누어 사용하였다. 시료는 세포배양플 라스크 바닥면적 (cm2)당 접종량을 0.004 ml를 넘지 않도 록 BGMK 세포에 접종하였다.
음성대조군은 접종량에 해당하는 pH 7.0~7.5의 0.15 M sodium phosphate 용액을 접종하였으며, 세포변성 (cyto- pathic effect; CPE)이나 독성효과 (cytotoxicity)를 나타내지 않는 것을 확인한 후 결과를 판정하였다. 양성대조군 은 약독화된 poliovirus type 3으로써 약 20 PFU (plaque forming unit)/ml이 되도록 pH 7.0~7.5의 0.15 M sodium phosphate 용액으로 희석하여 세포에 접종하여 사용하 였다.
준비된 10개의 배양용기에 시료를 각각 접종하고 80~120분간 36.5±1℃ CO2 배양기에서 바이러스를 흡착 시킨 후 세포배양플라스크에 2% 혈청이 함유된 MEM/
L-15 배지를 각 배양용기의 크기에 따라 적절하게 분주 하여 36.5±1℃ CO2 배양기에서 각각 14일간 배양하면서 바이러스성 세포병변효과 (CPE)를 관찰하였다. 세포독성 효과가 일어나는지를 확인하기 위해 첫 3일간은 매일 관 찰하고, 14일 동안 2일 간격으로 관찰하였다. BGMK 세 포 monolayer의 75% 이상 양성을 보이는 경우에는 플라 스크를 -70℃의 냉동고에 보관하여 다음 계대에 사용하 였다. 세포독성이 없고 7일 이후까지 3개 이상의 플라스 크에서 음성으로 판정되면 subsample 1과 같은 방법으로 subsample 2도 접종하였으며, 7개 이상의 배양플라스크에 서 양성을 보이는 경우 1:5, 1:25, 1:125로 희석하여 계대 배양을 수행하였다. 확인시험 시 바이러스 배양으로 관 찰되는 플라스크는 다시 0.22 μm 필터를 사용하여 여과 후 계대배양 (passage 2 or 3)하여 세포변성의 발현을 관찰 하였다.
한편 시험에 사용된 모든 BGMK 세포가 mycoplasma 에 오염되었는지 여부를 mycoplasma test kit (EZ-PCR, Biological Industries, Beit Haemek, Israel)를 사용하여 검사 하였으며, thioglycollate medium (Difco, Sparks, MD, USA)를
사용하여 세균오염여부도 확인하여 오염이 없는 경우에 만 바이러스 분석에 사용하였다.
4. ICC-PCR
1) 핵산추출
총배양성바이러스 분석법에 의한 분석시료의 1차 계 대 후 플라스크 20개의 상등액 200 μl를 1.5 ml tube에 넣 은 후 Tri-reagent 600 μl를 넣고 진탕하여 잘 섞고 상온에 서 10분간 정치한 다음 chloroform (Sigma, St. Louis, MO, USA) 200 μl를 첨가하여 진탕한 후 15분간 상온에서 정 치시켰다. 14,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 후, 상등 액 500 μl를 새로운 1.5 ml tube에 옮기고 isopropyl alcohol 500 μl를 넣고 진탕하였다. -20℃에서 2시간 이상 정치 시켜 바이러스 핵산을 침전시킨 후, 4℃, 14,000 rpm에서 30분간 원심하였다. 상층액을 버리고 cold 70% DEPC- ethanol (Sigma) 500 μl를 넣어 섞고 다시 4℃, 14,000 rpm 에서 15분간 원심하였다. 상층액을 제거한 후 tube를 뒤 집어서 ethanol을 제거하였다. 약 20분간 건조시킨 후 DEPC로 처리한 증류수 20 μl를 넣어 바이러스 핵산을 녹여서 약하게 진탕한 후 실험에 사용하였다. 즉시 실험 할 수 없는 경우에는 -70℃에 보관하였다.
2) Primers
Enteroviruses와 reoviruses를 검색하기 위한 primer 설정 은 기존 문헌에 나온 것을 이용하였다. Enteroviruses의 유전자 검색을 위해 보존성이 높은 것으로 알려져 있는 5'-noncoding region (NCR) 의 436 bp region을 target으로 한 primer를 사용하였으며, 염기서열은 ENTF는 5'-CAAG- CACTTCTGTTTCCCCGG-3'이었으며, ENTR는 5'-ATTGT- CACCATAAGCAGCCA-3'이었다 (22). Reoviruses의 유전 자 검색을 위해 Reo1은 5'-GCGCTGCTGTCCTATTCAA- GACT-3', Reo2는 5'-TAGTTCATGATAAGCTGGTTCAC-3' 으로 반응 산물은 534 bp의 특정 밴드로 확인하였다 (3).
3) Enteroviruses와 reoviruses에 대한 ICC-PCR PCR 반응은 one step RT-PCR 방법을 사용하였다. RT- PCR primix (Bioneer, Deajeon, Korea)에 바이러스 RNA 10 μl, primer (10 pmol/μl)를 각각 2 μl, DEPC-treated DW로 총 부피를 20 μl로 맞추어 주었다. Enteroviruses의 핵산검출 을 위한 RT-PCR 반응조건은 48℃ 40분, 94℃ 3분의 역 전사반응 과정을 거쳐 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 45초 의 과정을 35회 반복하였다. 최종합성 단계로 72℃에서 7분간 반응시켜 유전자 산물을 증폭하였다. Reoviruses의
핵산검출을 위한 RT-PCR 반응조건은 48℃ 40분, 94℃
5분의 역전사반응 과정을 거쳐 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 45초의 과정을 35회 반복하였다. 최종합성 단계로 72℃에서 10분간 반응시켜 유전자 산물을 증폭하였다.
RT-PCR 과정을 PCR 증폭기 (Perkin Elmer Co., Norwalk, CT, USA)에서 수행하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% agarose gel에서 100 volt로 40분 동안 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 관찰하였다.
결 과
1. 총배양성바이러스 분석
경기도내 팔당호, 한강수계, 임진강, 한탄강, 기타하천 및 지하수 등을 취수원으로 하는 43개 정수장의 원수 57건에 대하여 총배양성바이러스 분석을 실시하였다.
경기도내 43개 정수장에 대해 연 1~2회씩 총 57개 물 시료의 총배양성바이러스를 BGMK 세포주를 이용하여 분석하였다. 57개 시료의 취수원별, 처리용량별 분포는 Table 1과 같다. 팔당호의 시료가 31.6% (18건), 한강의 시료가 21.1% (12건), 임진강의 시료가 5% (3건), 한탄강 의 시료가 5% (3건), 기타 하천이 16% (9건), 그리고 지하 수가 18% (10건)을 차지하였다. 일일 처리용량 5만톤 이 상 정수장의 경우, 팔당호가 17건으로 60.7%, 한강이 7
Table 1. Sampling distribution classified by source water and capacity
Capacity Source water ≥50,000
ton/day (%) <50,000 ton/day (%)
Total (%)
Paldang 17 (60.7) 1 ( 3.4) 18 (31.6) Han River 7 (25.0) 5 ( 17.2) 12 (21.2) Yimjin River 2 ( 7.1) 1 ( 3.4) 3 ( 5.3) Hantan River 2 ( 7.1) 1 ( 3.4) 3 ( 5.3) Anseongcheon 0 2 ( 6.9) 2 ( 3.5) Gyejeongcheon 0 1 ( 3.4) 1 ( 1.8) Heukcheon 0 3 (10.3) 3 ( 5.3) Jinwicheon 0 2 ( 6.9) 2 ( 3.5) Yeongpyeongcheon 0 1 ( 3.4) 1 ( 1.8) Groundwater 0 10 (34.5) 10 (17.5)
etc. 0 2 ( 6.9) 2 ( 3.5)
Total 28 29 57
건으로 25.0%, 임진강과 한탄강이 각각 2건으로 7.1%씩 을 차지하였다. 5만톤 미만 정수장의 경우, 팔당호가 1건 으로 3%, 한강이 5건으로 17.2%, 임진강과 한탄강이 각 각 1건, 1건으로 3%, 3%를, 지하수가 10건으로 34.5%, 기타 취수원이 2건으로 6.9%를 차지하였다. 57개 시료 중 19개의 시료가 BGMK 세포주에서 세포병변효과가
관찰되었다 (Table 2). 팔당호를 취수원으로 하는 정수장 의 경우 18개 시료 중 6개 (33.3%) 시료에서 바이러스가 검출되었다 (Table 3). 한강의 경우 12개 시료 중 3 (25%) 건에서 바이러스가 검출되었고, 취수원이 임진강인 3개 시료 중 3건 (100%), 모두에서 바이러스가 검출되었다.
취수원이 한탄강인 시료 3건 가운데 2건 (66.7%)에서 바 이러스가 검출되었다. 진위천, 안성천, 흑천 및 기타 취 수원의 경우, 각각 1건 (50%), 2건 (100%), 1건 (33.3%), 1 건 (05.%)에서 바이러스가 검출되었으며, 계정천, 영평천 과 지하수를 취수원으로 하는 12개의 시료에서는 바이러 스가 검출되지 않았다.
검출된 바이러스의 농도범위는 팔당의 경우 2.12~
113.5 MPN (most probable number)/100 ℓ로서 평균농도는 11.06 MPN/100 ℓ였으며, 한강은 2.11~88.98 MPN/100 ℓ로 서 평균농도는 8.67 MPN/100 ℓ였다. 경기북부의 임진강 과 한탄강을 취수원으로 하는 지점의 경우 각각 4.46~
105.65 MPN/100 ℓ와 15.97~86.0 MPN/100 ℓ의 농도분포 를 보였으며, 평균농도는 각각 52.92 MPN/100 ℓ와 34.0 MPN/100 ℓ로 상당히 높은 수준의 총배양성바이러스가 검출되었다. 진위천과 안성천의 경우 각각 5,744 MPN/
100 ℓ, 800 MPN/100 ℓ로 57개 지점 중 가장 높은 농도의 바이러스가 검출되었으며, 이후 재채수하여 분석하였을 때는 각각 불검출 및 1.01 MPN/100 ℓ의 농도로 현저히 낮아졌다. 흑천, 계정천, 영평천 및 저수지와 같은 기타 Table 2. Detection of enteroviruses and reoviruses in source water
by TCVA and ICC-PCR
Integrated cell culture-PCR (ICC-PCR) Source water Total culturable
virus assay
(TCVA) Enteroviruses Reoviruses Paldang 6/18 (33.3) 0/18 6/18 (33.3) Han River 3/12 (25.0) 0/12 3/12 (25.0) Yimjin River 3/3 (100.0) 1/3 (33.3) 3/3 (100.0) Hantan River 2/3 (66.7) 2/3 (66.7) 2/3 (66.7) Jinwicheon 1/2 (50.0) 0/2 1/2 (50.0) Anseongcheon 2/2 (100.0) 0/2 2/2 (100.0) Heukcheon 1/3 (33.3) 0/3 1/3 (33.3)
Gyejeongcheon 0/1 0/1 0/1
Yeongpyeongcheon 0/1 0/1 0/1 Groundwater 0/10 0/10 0/10 etc. 1/2 (50.0) 1/2 (50.0) 1/2 (50.0) Total (%) 19/57 (33.3) 3/57 (5.3) 19/57 (33.3)
Table 3. Distribution of culturable enteric viruses classified by source water and capacity
≥50,000 ton/day <50,000 ton/day Source water Total (%)
Positive (%) Negative Positive (%) Negative
Paldang 6/18 (33.3) 5 (41.7) 12 1 (100) 0
Han River 3/12 (25.0) 2 (40) 5 1 (100) 4
Yimjin River 3/3 (100.0) 2 (100) 0 1 (100) 0
Hantan River 2/3 (66.7) 2 (100) 0 0 1
Jinwicheon 1/2 (50.0) - - 1 ( 50) 1
Anseongcheon 2/2 (100.0) - - 2 (100) 0
Heukcheon 1/3 (33.3) - - 1 (33.3) 2
Gyejeongcheon 0/1 - - 0 1
Yeongpyeongcheon 0/1 - - 0 1
Groundwater 0/10 - - 0 10
etc. 1/2 (50.0) - - 1 ( 50) 1
Total 19/57(33.3) 11 (39.3) 17 8 (27.6) 21
취수원의 경우 1.03~7.15 MPN/100 ℓ의 농도분포를 보 였고, 평균농도는 1.17 MPN/100 ℓ로 낮은 수준을 유지하 였다.
Table 3는 정수장의 처리용량에 따른 총배양성바이러 스의 검출율을 나타낸 것으로 일일 처리용량 5만톤 이상 정수장은 팔당, 한강, 임진강, 한탄강 등을 취수원으로 하였고, 각각 41.7% (5건), 40.0% (2건), 100% (2건), 100%
(2건)의 양성율을 보였다. 일일 처리용량 5만톤 이하 정 수장에서는 팔당, 한강, 임진강, 한탄강, 진위천, 안성천, 흑천, 계정천, 영평천, 지하수과 기타 취수원 등을 취수 원으로 하였고, 각각 100% (1건), 20% (4건), 100% (1건), 0% (0건), 50% (1건), 100% (2건), 33.3% (1건), 0% (0건), 0%
(0건), 0% (0건), 50% (1건)의 양성율을 보였다.
총배양성바이러스가 검출된 지점들의 바이러스의 농 도분포는 Table 4와 같다. 경기도내 팔당호, 한강, 하천, 저수지 등을 취수원으로 하는 43개 정수장의 57개 시료 에 대한 총배양성바이러스 검사 결과 19곳 (33.3%)의 원수에서 바이러스가 검출되었으며 1~10 MPN/100 ℓ인 시료가 8건 (42.1%), 11~20 MPN/100 ℓ인 시료가 3건
(15.8%), 41~50 MPN/100 ℓ인 시료가 2건 (10.5%), 61~70 MPN/100 ℓ인 시료가 1건 (5.3%), 81~90 MPN/100 ℓ인 시 료가 1건 (5.3%), 100 MPN/100 ℓ를 초과한 시료는 팔당, 임진강, 진위천 안성천 등의 시료 4건 (21.1%)이었다. 이 들은 정수의 바이러스 검사를 실시해야 하는 기준인 100 MPN/100 ℓ를 초과하여 각각 113.5 MPN/100 ℓ, 105.65 MPN/100 ℓ, 5,744 MPN/100 ℓ, 800 MPN/100 ℓ이 검출되었 다. 팔당 및 임진강의 경우 정수의 총배양성바이러스를 분석한 결과, 모두 바이러스가 검출되지 않았고, 진위천 및 안성천의 경우 원수를 재채수하여 분석하였으나 바이 러스가 검출되지 않거나 100 MPN/100 ℓ 미만으로 검출 되었다.
바이러스가 검출된 19건 중 11건이 처리용량 5만톤 이상 정수장의 시료로 1~10 MPN/100 ℓ인 시료가 4건 (36.4%), 11~20 MPN/100 ℓ인 시료가 2건 (18.2%), 41~50 MPN/100 ℓ인 시료가 2건 (18.2%), 61~70 MPN/100 ℓ인 시료가 1건 (9.1%), 100 MPN/100 ℓ를 초과한 시료는 2건 (18.2%)이었으며, 처리용량 5만톤 미만이 정수장의 시료 의 경우 8개의 시료에서 바이러스가 검출되었고, 1~10 MPN/100 ℓ인 시료가 4건 (50%), 11~20 MPN/100 ℓ인 시료가 1건 (12.5%), 81~90 MPN/100 ℓ인 시료가 1건 (12.5%), 100 MPN/100 ℓ를 초과한 시료는 2건 (21.1%)이 었다.
월별 총배양성바이러스의 검출농도를 Table 5에 나타내 었다. 57개 시료에 대한 시기별 바이러스 검출현황은 농 도의 차이는 있었으나 전체적으로 연중 바이러스가 검 출되는 것으로 나타났다. 주로 겨울철인 2월에 바이러스 검출율이 높게 나타났다.
2. ICC-PCR
총배양성바이러스 분석법의 1차 14일 동안의 세포배 양단계를 마친 20개의 플라스크를 -70℃에서 얼리고 녹 이기를 3번 반복한 후 배양상등액 200 μl를 취하여 바이 러스의 핵산을 추출한 후 RT-PCR을 통해 enteroviruses와 Table 4. Distribution of virus concentration in source water
Concentration
(MPN/100 ℓ) Total
(%) ≥50,000
ton/day (%) <50,000 ton/day (%) 1~10 8 (42.1) 4 (36.4) 4 (50.0) 11~20 3 (15.8) 2 (18.2) 1 (12.5)
21~30 - - -
31~40 - - -
41~50 2 (10.5) 2 (18.2) -
51~60 - - -
61~70 1 ( 5.3) 1 ( 9.1) -
71~80 - - -
81~90 1 ( 5.3) - 1 (12.5)
90~100 - - -
above 100 4 (21.1) 2 (18.2) 2 (25.0)
Table 5. Monthly virus distribution of culturable enteric viruses, enteroviruses and reoviruses from source water in Gyeonggi-do
Month Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct
Positive 3 6 1 3 1 1 1 2 0 1
Enteroviruses - - - 1 1 - - 1
Reoviruses 3 6 1 3 1 1 1 2 0 1
Negative 3 2 3 3 5 3 1 6 6 6
reoviruses의 RNA를 확인하였다. 57개 시료 가운데 총배 양성바이러스 분석을 통해 세포병변효과를 나타낸 19개 의 시료는 모두 enteroviruses와 reoviruses에 특이적인 밴 드를 나타내었다. 각 시료 당 20개의 세포배양플라스크 에 대한 enteroviruses와 reoviruses의 검출 결과는 Table 6 과 같다. 57개의 시료 중 총배양성바이러스 분석법에서 양성을 나타낸 19개의 시료는 ICC-PCR법을 통해 entero- viruses에 대해서 3건, reoviruses에 대해서 19건 모두 양 성을 나타내었다. 시료 57개의 1,140개 세포배양플라스 크를 조사한 결과, 총배양성바이러스 분석법에서 세포 병변효과를 나타낸 209개 (18.3%)의 세포배양플라스크 중 enteroviruses와 reoviruses에 각각 4개 (0.4%), 198개 (17.4%)가 감염이 된 것으로 나타났다.
본 조사연구에서 총배양성바이러스 분석법을 통해 바 이러스가 검출된 총 19개 물 시료의 배양플라스크 380개 중 209개의 플라스크에서 세포병변효과가 관찰되었고, 그 중 119개의 플라스크 (56.9%)는 1차 배양에서, 90개의 플라스크 (43.1%)의 플라스크는 2차 계대배양에서 CPE 가 관찰되었다 (Table 7). 반면, 총배양성바이러스 분석법 과 역전사 중합효소반응 (RT-PCR)의 장점을 병합한 ICC- PCR법으로 1차 배양이 끝나는 14일 후 RT-PCR을 실시 했을 때 202개 (96.7%)의 플라스크에서 enteroviruses 또 는 reoviruses의 RNA가 확인되었다. 또한 202개 플라스 크 중에서 198개 (94.7%)의 플라스크는 reoviruses에 대하 여 양성밴드가 확인되었고 4개 (1.9%)의 플라스크에서는
enteroviruses에 대하여 특이적인 밴드가 확인이 되었다.
총배양성바이러스 분석법의 1차 세포배양에서 56.9%의 세포병변효과를 확인할 수 있었으나, 1차 세포배양 상등 액을 이용하여 ICC-PCR을 수행한 결과 enteroviruses와 reoviruses에 대한 바이러스 오염을 90% 이상 확인할 수 있었다 (Table 7).
총배양성바이러스 검출법에 의해 바이러스 오염이 확 인된 19건의 시료에 대한 ICC-PCR 결과, 19건은 모두 reoviruses에 오염된 것이 확인되었다. 이를 배양플라스 크별로 확인한 결과, 94.7%에 해당하는 198개의 플라스 크에서 reoviruses에 특이적인 PCR 산물이 확인되었다.
Enteroviruses의 경우, reoviruses와 동시에 감염된 시료가 3건이 있었으며 배양플라스크 수는 1.9% (4개)로 낮은 수준으로 오염되었음을 알 수 있었다. Enteroviruses와 reoviruses가 동시에 감염된 플라스크는 확인되지 않았다 (Table 8).
시기별로 reoviruses는 연중 꾸준히 검출되었고 특히 수온이 낮은 겨울철인 1, 2월에 9건 (47.4%)이 검출되어 Table 6. Comparision of viral analyses
No. of samples (%) No. of flasks (%) Type of assay No. of samples
tested Positive Negative Positive Negative
TCVA 57 19 (33.3) 38 (66.7) 209 (18.3) 931 (81.7)
ICC-PCR
Enteroviruses 57 3 ( 5.3) 54 (94.7) 4 ( 0.4) 1136 (99.6)
Reoviruses 57 19 (33.3) 38 (66.7) 198 (17.4) 942 (82.6)
Table 7. Comparision of TCVA and ICC-PCR for detection of enteric viruses, enteroviruses and reoviruses Total culturable virus assay (TCVA) Integrated cell culture-PCR (ICC-PCR) Passage
CPE (%) Enteroviruses (%) Reoviruses (%)
1st 119 (56.9) 4 (1.9) 198 (94.7)
2nd 90 (43.1) - -
Table 8. Enteroviruses and reoviruses detection by ICC-PCR
Virus (es) No. of positive
samples (%) No. of positive flasks (%) Enteroviruses 3 ( 15.8) 4 ( 1.9) Reoviruses 19 (100.0) 198 (94.7) Enteroviruses+reoviruses 3 ( 15.8) 0 ( 0.0)
겨울철에 검출빈도가 높았다 (Table 5).
고 찰
장관계바이러스는 분변-구강의 경로를 통해 사람의 장관에 감염되어 다시 분변을 통해 배출된 뒤 자연계에 서 장시간 감염성을 잃지 않고 견디면서 다시 사람의 소 화기를 통하여 감염되는 수인성 바이러스다 (4,6). 그 중 enteroviruses는 인간 병원체로서 70가지 이상의 혈청형이 존재하며 무균성 뇌수막염의 주된 원인이 되는 바이러스 로 알려져 있으나, poliovirus를 제외한 많은 혈청형에 대 해 예방접종이 불가능하여 이들 바이러스에 의한 질병 을 사전에 예방하기란 쉽지 않다 (25). 또한 reoviruses는 이중나선의 RNA를 가지는 바이러스로 한 가닥의 RNA 를 가지는 poliovirus에 비해 염소처리나 자외선 조사에 두드러지게 더 저항을 나타내며 면역력이 저하된 영아와 노인 등에서는 치명적인 감염을 일으킬 수 있다 (17). 그 러나 수처리에 전통적으로 사용되고 있는 물리화학적 항 목들과 분변오염의 지표로 대변되는 총대장균군 및 분원 성대장균군 등과 바이러스의 오염은 서로 연관을 나타내 지 않는 것으로 나타났다 (1,13,21,34,44). 이러한 장관계 바이러스들은 특별히 전문화된 실험실에서 한정된 종류 만이 검출이 가능하고 실험과정이 복잡하여 분석에 장 시간이 요구되므로 물 시료의 분원성 오염을 측정하는 것이 일반적인 세균학적 지표와 다르게 수행되고 있다 (2,29). 바이러스의 검출에 전통적으로 사용되는 세포배 양법은 감염성 있는 바이러스 입자를 검출할 수 있는 큰 장점을 가지는 동시에 많은 경비와 시간을 요하며 복잡 한 과정을 수반한다 (26,33,44). 게다가 장관계바이러스 가운데 대다수의 종들은 아직 적합한 숙주세포주를 발견 하지 못한 상태에 있어 다양한 바이러스의 검출이 어려 운 실정이다 (2,9,21,39).
PCR과 같은 분자생물학적 기법은 세포배양법의 이러 한 단점을 보완할 수 있다. 농축한 물 시료에 바로 적용 할 수 있어 빠르고 감도 높게 바이러스 핵산의 검출이 가능하다. 그러나 물 시료에 존재하는 바이러스의 감염 력에 대해 정보를 제공하지 못하는 큰 단점과 중합효소 를 사용하는 기법이므로 다량의 물 시료를 농축할 때 함께 농축되는 humic acid, fulvic acid, 중금속, 페놀화합물 등 저해 물질에 의해서 중합반응이 저해를 받고 반응용 량이 극소량이라는 문제점을 가진다 (4,16,30,33,40). ICC-
PCR법은 세포배양법과 PCR의 기술을 접목시켜 경비와 시간을 절약시키고 PCR을 저해하는 화합물의 효과를 저 하시키며 PCR 반응에 소요되는 동등용량을 직접적으로 증가시켜 감염성 바이러스 입자를 신속하게 검출할 수 있다 (14,15,32).
본 조사연구는 경기도내 팔당, 한강, 임진강, 한탄강, 기타하천 및 지하수 등을 취수원으로 하는 정수장의 원 수를 채수하여 총배양성바이러스에 대한 오염도를 조 사하였으며, ICC-PCR을 통해 장관계바이러스 가운데 enteroviruses와 reoviruses의 분포도를 알아보았다. 총배양 성바이러스 분석법은 많은 시간과 노력을 필요로 한다.
즉, 농축한 물 시료를 BGMK 세포주에 접종 후 14일간 배양 (1차 배양)하면서 관찰한 후 세포병변효과를 나타 낸 플라스크와 세포병변효과를 나타내지 않은 플라스크 모두를 -70℃ 이하에서 freezing-throwing을 3회 거친 후 그 배양상등액을 새로운 BGMK 세포주에 재접종 (2차 계대배양)하여 14일간 배양, 관찰하며 바이러스 양성플라 스크와 음성플라스크를 확인하게 된다. 이때 1차 배양에 서 세포병변효과를 나타내지 않았으나 2차 배양 결과 세 포병변효과가 관찰되었을 경우에는 다시 3차 계대배양을 통한 재확인이 필요하다. 본 조사연구에서는 enteroviruses 와 reoviruses의 신속한 검출과 확인을 위해 총배양성바 이러스 분석법의 1차 14일 배양플라스크의 상등액을 사 용하여 PCR을 실시하였다.
본 조사연구에 사용된 57건의 물 시료 중 19건이 총배 양성바이러스 분석법에서 세포병변효과를 확인하여 장 관계바이러스에 의한 오염을 확인하였다. ICC-PCR법을 통하여 enteroviruses의 유전자가 검출된 물 시료는 57건 중 3건이었으며, reoviruses의 유전자가 검출된 검체는 57 건 중 19건이었다. 총세포배양법에서 장관계바이러스로 오염이 확인된 19건의 시료는 ICC-PCR법에 의해 모두 reoviruses의 유전자가 검출되어 ICC-PCR법과 총배양성 바이러스법의 결과와 일치하는 것으로 나타났다. 이로써 ICC-PCR에 의한 장관계바이러스의 검색이 신속하고 편 리하며 세포배양결과와 연관성 있는 신뢰할 만한 기법임 을 확인할 수 있었다.
Reoviruses가 검출된 19건 중 3건은 enteroviruses의 유 전자도 검출되어 두 가지 바이러스에 의해 동시에 오염 되어 있음을 알 수 있었으나, 하나의 플라스크에 동시에 감염되지는 않은 것으로 확인되어 두 바이러스가 종 특 이성 및 숙주세포내에서의 발현 및 증식 등 특성의 차이
에 기인하는 것으로 생각된다. Enteroviruses는 single-strand RNA를 핵산으로 가지며 숙주세포에 흡착하여 침입한 후 바이러스의 RNA는 그대로 번역되어 필요한 단백질 을 만들게 된다. 이때, 얻어진 단백질을 이용하여 계속적 으로 복제가 일어나고 복제된 genome은 그대로 mRNA 로 이용되어 번역되며 단백질이 만들어지는, 복제와 유 전자 발현과정이 거의 동시에 일어나게 된다. 반면, reo- viruses의 경우 이중나선 RNA을 유전자로 가지는 바이러 스로 전사초기의 mRNA들은 번역되어 필요한 단백질을 생산하고 이들이 또한 음성극성 가닥의 RNA를 합성하 는 주형 (template)으로 작용하게 된다. 이처럼 두 바이러 스는 종을 구분하게 되는 유전자형이 서로 다르기 때문 에 총배양성바이러스 분석시 세포병변효과를 나타내는 시기 또한 차이를 나타내었다.
현재 분원성바이러스 오염의 모니터링에 지표바이러스 로서 enteroviruses가 널리 사용되고 있으나, 본 연구에서 는 검출율 (15.8%)이 낮았다. 그러나 염소소독이나 자외 선 등에 가장 저항성이 높은 reoviruses의 오염은 총배양 성바이러스법에서 바이러스가 검출된 19건의 시료에서 100% 검출되어 높게 나타났다. 일반적으로 enteroviruses 의 경우 BGMK 세포주에서 증식과 복제가 빠르고 세포 변성효과가 reoviruses보다 일찍 나타나는 것으로 보고되 어 있다. 이 때문에 reoviruses에 의한 세포변성효과가 나 타나기 전에 enteroviruses에 의해 세포단층이 파괴되므로 reoviruses에 대한 오염도가 과소평가될 수 있다는 의견 이 제기되고 있다 (29). Reoviruses의 경우 염소처리와 같 은 정수처리과정에서 enteroviruses보다 저항성이 높고 장관계바이러스 중 유일하게 DNA를 핵산으로 가지는 enteric adeonviruses보다 더 저항성을 띠므로 효율적으로 제거가 어렵다고 알려져 있다 (18). 또한 바이러스의 경 우 분변오염의 지표로 사용되고 있는 총대장균군, 분원 성대장균군 및 대장균에 비해 염소처리에 더 저항성이 있고 세균과는 달리 감염성 있는 하나의 입자에 의해서 도 감염을 일으킬 수 있으므로 (13,20,37) 상수원수 및
정수의 관리대상으로 항상 주의를 기울여야 할 것으로 사료된다.
ICC-PCR의 경우 세포배양법보다 민감도가 더 높고 신 속하며 편리한 장점을 가지고 있으나, primers의 제작에 따라 위양성과 위음성의 결과를 가져올 가능성이 높은 것이 단점이다. 본 조사에서 57건의 시료의 1140개 배양 플라스크에 대하여 ICC-PCR을 실시하였고, 그 결과 19 건의 시료의 202개 배양플라스크에서 enteroviruses 혹은 reoviruses의 감염을 확인하게 되었다. 총배양성바이러스 검출법을 통해 209개의 플라스크에서 세포독성효과를 확인하였으나 그 중 196개에서만 (93.8%) ICC-PCR에서 enteroviruses 혹은 reoviruses의 핵산이 검출되었다 (Table 9). 나머지 13개의 플라스크는 enteroviruses와 reoviruses에 대한 ICC-PCR에서 음성을 나타냈다. 이는 본 조사에서 사용한 primers와 맞지 않은 다른 종류의 장관계바이러 스에 의해 BGMK 세포단층이 감염되어 세포독성을 나 타내었음을 의미한다. 이것은 새로운 enteroviruses에 의 한 감염 혹은 세포주에 따라 세포병변효과를 나타내는 adenoviruses의 감염으로 추측된다. 총배양성바이러스 배 양법에서 음성이었던 6개의 플라스크는 ICC-PCR을 통 해 reoviruses의 핵산이 검출되었다. 이것은 환경에서 손 상을 입어 CPE를 생성할 수 없는 불활성화된 바이러스 의 핵산이 검출된 것으로 생각되며, 비록 감염성은 확인 되지 않았을지라도 바이러스의 핵산이 검출되었다는 것 은 바이러스로 인한 오염의 가능성을 의미하므로 각별 한 주의가 필요할 것으로 사료된다. 총배양성바이러스 배양법에서 음성으로 결정된 38개의 시료의 925개의 배 양플라스크는 enteroviruses와 reoviruses에 대한 핵산이 검 출되지 않아 바이러스 오염이 없었던 것으로 확인되었다.
그러나 현재 알려진 장관계바이러스 가운데 다양한 세포 주에서 증식과 복제는 가능하나 뚜렷한 세포병변효과를 나타내지 않거나 증식과 복제에 위해 숙주가 되는 세포 주를 찾지 못한 바이러스들이 대부분을 차지한다. Entero- viruses와 reoviruses와 같이 세포주에서 증식과 동시에 세 포병변효과를 일으킬 수 있는 cytopathogenic virus는 소 수에 불과하며, 그 중 BGMK 세포주에서 세포독성효과 를 확실하게 나타내지 않는 바이러스도 존재하므로 안 심할 수 없다. 그러므로 바이러스 검출을 위해 많은 시 간와 노력이 소요되고 복잡한 과정을 거치는 세포배양법 에 PCR법의 장점을 결합시키는 노력은 매우 효율적이며 중요한 과정이 아닐 수 없다.
Table 9. Comparison of enteric viruses assays No. of flasks with the following reaction
in the ICC-PCR CPE in
TCVA
Positive Negative
Positive 196 13
Negative 6 925
참 고 문 헌
1)정용석: 수인성 바이러스의 수계환경내 분포실태 및
검색방법론. 지구환경논문집 9: 88-95, 1998.
2)정현미: 바이러스 수질분석과 정도관리. 지구환경논문
집 10: 55-72, 1999.
3)지연숙, 이희숙, 남세희, 이기종: 수인성 바이러스 분 석에서 RT-PCR (Reverse transcription Polymerase Chain Reaction)과 IFA (Immunofluorescence Assay)를 이용한 총배양성바이러스 분석법의 보완. 대한환경공학회 추 계학술연구발표회논문집 1464-1469, 2003.
4) Abbaszadegan M, Stewart P, LeChevallier M: A Strategy for detection of viruses in groundwater by PCR. Appl Environ Microbiol 65: 444-449, 1999.
5) American Public Health Association: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed. American Public Health Association, Washington D. C., 1995.
6)Berg D, Metcalf TG: Indicators of viruses in water. In Indicatiors of viruses in water and food, Berg G (Ed), Ann Arbor Scinece, Ann Arbor, MI, 1978.
7) Berlin LE, Rorabaugh ML, Heldrich F, Roberts K, Doran T, Modlin JF: Aseptic meningitis in infants < 2yr of age:
diagnosis and etiology. J Infect Dis 168: 888-892, 1993.
8) Blackmer F, Reynolds KA, Gerba CP, Pepper IL: Use of integrated cell culture-PCR to evaluate the effectiveness of poliovirus inactivation by cholrine. Appl Environ Microbiol 66: 2267-2268, 2000.
9) Chapron CD, Ballester NA, Fontatine JH, Frades CN, Margolin AB: Detection of astroviruses, enteroviruses, and adenovirus types 40 and 41 in surface waters collected and evaluated by the information collection rule and an integrated cell culture-nested PCR procedure. Appl Environ Microbiol 66: 2520-2525, 2000.
10) Dahing DR, Wright BA: Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment. Appl Environ Microbiol 51: 790-812, 1986.
11)Fout GS, Martinson BC, Moyer MW, Dahling DR: A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater. Appl Environ Microbiol 69: 3158-3164, 2003.
12) Fraenkel-Conrat H, Kimball P, Levy J: Virology, 2nd ed.
Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ, 1988.
13) Grabow WO, Botma KL, de Villiers JC, Clay CG, Erasmus
B: Assessment of cell culture and polymerase chain reaction procedures for the detection of polioviruses in wastewater.
Bull World Health Organ 77: 973-980, 1999.
14) Greening GE, Hewitt J, Lewis GD: Evaluation of integrated cell culture-PCR (C-PCR) for virological analysis of environ- mental samples. J Appl Microbiol 93: 745-750, 2002.
15) Grimm AC, Cashdollar JL, Williams FP, Fout GS: Develop- ment of an astrovirus RT-PCR detection assay for use with conventional, real-time, and integrated cell culture/RT-PCR.
Can J Microbiol 50: 269-278, 2004.
16) Gurrman-Bass N, Catalano-Sherman J: Effects of humic materials on virus recovery from water. Appl Environ Microbiol 49: 1260-1264, 1985.
17) Harris GD, Adams VD, Sorensen DL, Curtis MS: Ultra- violet inactivation of selected bacteria and viruses with photo- reactivation of the bacteria. Water Res 21: 687-692, 1987.
18) Irving LG, Smith FA: One-year survey of enteroviruses, adenoviruses, and reoviruses isolated from effluent at an activated-sludge purification plant. Appl Environ Microbiol 41: 51-59, 1981.
19) Johansson PJ, Sveger T, Ahlfors K, Ekstrand J, Svensson L: Reovirus type 1 associated with meningitis. Scand J Infect Dis 28: 117-120, 1996.
20) LaBelle RL, Gerba CP: Influence of estuarine sediment on virus survival under field conditions. Appl Environ Microbiol 39: 749-755, 1980.
21) Lee CH, Lee SH, Han ER, Kim SJ: Use of cell culture-PCR assay based on combination of A549 and BGMK cell lines and molecular identification as a tool to monitor infectious adenoviruses and enteroviruses in river water. Appl Environ Microbiol 70: 6695-6705, 2004.
22) Leparc I, Aymard M, Fuchs F: Acute, chronic and persistent enterovirus and poliovirus infection: detection of viral genome by seminested PCR amplification in culture-negative samples.
Mol Cell Probes 8: 487-495, 1994.
23) Lerner AM, Cherry JD, Klein JO, Finland M: Infection with reoviruses. N Engl J Med 267: 947-952, 1962.
24) Melnick JL: Enteroviruses: polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses and newer enteroviruses. pp 549-605. In Virology.
Fields BN (Ed), Raven Press, New York, 1990.
25) Minor PD, Morgan-Capner P, Schild GC: Enteroviruses.
pp 417-439. In Principles and practice of clinical virology, 3rd ed, Zucherman AJ, Pattison JR (Ed), Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1994.
26) Morris R, Waite WM: Evaluation of procedures for recovery of viruses from water. II. Detection systems. Water Res 14:
795-798, 1980.
27) Muscillo M, Aulicino FA, Patti AM, Orsini P, Volterra L, Fara GM: Molecular techniques for the identification of enteric viruses in marine waters. Water Res 28: 1-7, 1994.
28) Muscillo M, Carducci A, La Rosa G, Cantiani L, Marianelli C: Enteric virus detection in Adriatic seawater by cell culture, polymerase chain reaction and polyacrylamide gel electro- phoresis. Water Res 31: 1980-1984, 1997.
29)Muscillo M, La Rosa G, Marianelli C, Zaniratti S, Capobianchi MR, Cantiani L, Carducci A: A new RT-PCR method for the identification of reoviruses in seawater samples.
Water Res 35: 548-556, 2001.
30) Puig M, Jofre J, Lucena F, Allard A, Wadell G, Girones, R:
Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Appl Environ Microbiol 60:
2963-2970, 1994.
31) Reynolds KA: Integrated cell culture/PCR for detection of enteric viruses in environmental samples. Methods Mol Biol 268: 69-78, 2004.
32) Reynolds KA, Gerba CP, Abbaszadegan M, Pepper LL:
ICC/PCR detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples. Can J Microbiol 47: 153-157, 2001.
33) Reynolds KA, Gerba CP, Pepper IL: Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.
Appl Environ Microbiol 62: 1424-1427, 1996.
34) Rigotto C, Sincero TCM, Simões CMO, Barardi CRM:
Detection of adenoviruses in shellfish by means of conventional- PCR, nested-PCR, and integrated cell culture PCR (ICC/
PCR). Water Res 39: 297-304, 2005.
35) Rusin P, Enriquez C, Johnson D, Gerba C: Enteric viruses.
pp 472-484. In Environmental microbiology, 1st ed, Maier
RM, Pepper IL, Gerba CP (Ed), Academic Press, San Diego, CA, 2000.
36) Sabin AB: Reoviruses. a new group of respiratory and enteric viruses formerly classified as ECHO type 10 is described.
Science 130: 1387-1389, 1959.
37) Sellwood J, Dadswell JV, Slade JS: Viruses in sewage as and indicator of their presence in the community. J Hyg 86:
217-225, 1981.
38) Shieh YS, Wait D, Tai L, Sobsey MD: Methods to remove inhibitors in sewage and other fecal wastes for enterovirus detection by the polymerase chain reaction. J Virol Methods 54: 51-66, 1995.
39) Sobsey MD: Methods for recovering viruses from shellfish, seawater, and sediments. pp 77-108. In Methods for recovering viruses form the environment, Berg G (Ed), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1987.
40) Sobsey MD, Hickey AR: Effects of humic and fulvic acids on poliovirus concentration from water by microporous filtration. Appl Environ Microbiol 49: 259-264, 1985.
41) Spinner ML, Di Giovanni GD: Detection and identification of mammalian reoviruses in surface water by combined cell culture and reverse transciption-PCR. Appl Environ Microbiol 67: 3016-3020, 2001.
42) Tyler KL: Mammalian reoviruses. In: Fields virology, 4th ed, Knipe DM, Fields BN, Howley PM, Griffin DE (Ed), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2001.
43)United States Environmental Protection Agency: ICR Microbial Laboratory Manual: Office of Research and Development, EPA/600.R-95/178. 1996.
44) Vantarakis AC, Parapetropoulou M: Detection of entero- viruses and adonoviruses in coastal waters of SW Greece by nested polymerase chain reaction. Water Res 32: 2365-2372, 1998.
