사상체질학회지 J.of Sasang Consl. Med Vol. 15. No 1. 2003
훌빠훌훌少홉이 低훌훌훌性 大8톨神꿇細뼈 손싱에 미치는 影훌
박수정. .
김혈순. .
배영춘. .
이상민.
김경요. .
원경숙.. .
심규헌...
I
AbstractI
Influence of Yeoldahanso-tang on the Hypoxic Damage of
Cultured Cerebral Neurons from mouse and SK-N-MC cells
Park Su-jeong. . Kim Hvoung-soon. . Bae Young-chun. . Lee Sang-min. . Kim Kvung-vo.
Won Kvoung-sook. Shim Gvue-hearn".
. Dept. of Sasang Constitutional Medicine, College of Oriental Medicine, Wonkwang Univ
. Dept. of Nuclear Medicine, College of Medicine, Keimvung Univ
... Dept. of Sasang Constitutional Medicine, College of Oriental Medicine, Sang-ji Univ
To elucidate the neuroprotective effect of Yeoldahansc ←tang(YH 끼 on nerve cells damaged by hypo 잉a,
the cytOtOxic effects of exposure to hypoxia were determined by XTT(SODIUM3,3'-{ 1-[(PI 표NYLAMINO)
CARBONYLJ-3,4-TETRAZOUUM}- BIS (4-METHOXY- ιNITRO) BENZENE SULFONIC ACID
HYDRATE), NR{Neutral red), M1T(3-(4,5- φmethylrhiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and
SRB(S 띠forhodamin B) asssay. The activiry of catalase and SOD(Superoxide dismutase) was measured by
spectrophometry, and 1NF-a(Tumor cell necrosis fector-a) and PKC(Protein μn양e C) activiry was
measured after exposure to hyp 뼈a and treatment of YHTWE. Also the neuroprotective effect of
YHTWE was researched for the elucidatioion of neuroprotective mechanism. The results were as follows;
1. Hypoxia decreased cell viabiliry measured by XTT, NR assay when cultured cerebral neurons were
exposed to 95% N2/5% C02 for 2 - 26 minutes in these culrures and YHTWE i버ubited the decrease
of cell viabiliry.
2. H202 treatment decreased cell viabiliry measured by MTT, and SRB assay when culrured cerebral
neurons were e앤osed to 1-80 11M for 6 hours, but YHTWE inhibited the decrease of cell viabiliry.
3. Hypoxia decreased catalase and SOD aaiviry, and also 1NF-a and PKC activiry in these cultured
cerebral neurons, but YHTWE inhibired the decrease of the cat 쇠ase and SOD activiry in these cultUres.
4. Hypoxia triggered the apoptosis via caspase activarion and internucleosomal DNA fragmentation. Also
hypoxia stimulate the release of cytochrome c forom mitochondria. YHTWE i빼bited the apoptOsis via
caspase activation induced by hypoxia.
From these results, it can be suggested that brain ischemia model induced hypoxia showed neurotOxiciry
on cultUred mouse cerebral neurons, and the YHTWE has the neuroprotective effect in blocking the
neuroro 씨ciry induced by hypoxia in cultUred mouse cerebral neurons
Key word: Y ∞ldahansc ←tang, Hypo 피cD 없nage
원광대학교 한의과대학 사상체질과 .. 계영대학교 의과대학 핵의학과 ...상지대학교사상체질의학과 대학원 교신저자 : 박수정 주소)
전냥 해남군 해냥읍 우리한의원 전화) 061-536-9977 E-mail)[email protected]
- 72 -
- 多흉少훌이 低M윷{
호 大腦 j$ 細D8 손상에 미치는 影흩-
I. 績 論
뇌허혈로 인한 혈류 감소는 현기증. 기억상
실. 지남력상실 , 학습능력의 저하 등의 치매.
마비 , 의식불명과 같은 치명적인 증상을 초래 한다. 최근에 뇌허혈을 비롯한 중풍 및 치매 와 같은 뇌질환에 산소자유기가 관여한다는 것이 밝혀지면서 뇌허혈을 비롯한 뇌병변의 기전을 산소자유기의 산화적 손상측면에서 규 명하려는 연구가 많이 진행되고 있다. 뇌허혈 시 세포 내의 산소결핍은 세포내 산화적인산화 반웅을 차단하고. mitochondria 의 ATP 생성 작용을 둔화시키며 . 이로 인한 세포독성으로 뇌 조직의 괴사나 세포의 손상을 초래하게 된다1-2) 또한 호기성세포에서는 mitochondria 내의 전 자전달계에 의하여 산소자유기가 과량 생성되며 , 이들이 세포 내의 glutathione peroxidase.
catalase. superoxide dismutase(SOD) 동
에 의하여 치환되지 못하여 축적되면 뇌세포의 손상을 유발하게 된다3-5)
따라서 뇌허혈은 산소자유기에 의한 산화적 손상과 밀접한 관 련이 있으며. 산소자유기는 뇌졸중을 비롯한 여러 가지 신경의 퇴행성 병변과 밀접한 관련 있다고 보고되고 있다1.6.7)
특히 , 과량 생성 된 산소자유기는 세포막의 지질과산화반응을 촉진시켜 세포의 노화와 사멸을 초래하게 되
며. phospholipase A2 의 활성 을 촉진시 켜
새로운 산소자유기의 생성을 유도하고 . 세포
내의 칼습의 양을 증가시켜 세포손상을 가속화 시킨다고 한다,8.9)
또한 산소자유기는 nitric
oxide(NO) 와 작용하여 peroxyni tri te 라는 독
성물질을 만들며
.
aspatate 와 같은 홍분성 아미노산을 분비한다고 보고되었다10) 세포내의
glutamate 수용체중의 하나인 N-methyl-D-
aspartate(NMDA) 수용체는 Ca2+ 의 ion
-channel 과 밀접한 관계가 있으며. NMDA
수용체는 여러가지 흥분성아미노산의 자극에 의해 활성화되고3)
세포 내 Ca2+ influx 를 증가시키며, 이차적으로 세포 내 각종 효소나 이차 신호전달물질에 영향을 주고. 특히 세포내
칼숨의 증가는 이차전달자인 Ca2+ -dependent
protein kinase C(PKC) 의 활성을 촉진시
킴으로서 결국 세포를 팽창시키거나 변형시켜 세포의 고사를 초래하고 , 세포의 퇴행성 변화 를 유발하며 신경병변을 가속화 시킨다11)
또 한 산소자유기가 혈관내피세포에서 cytokine 이 나 intracellular adehision moleculeOCAM)
과 같은 물질들을 생성하여 동맥질환을 유발하 고. 허혈시 생성된 산소자유기가 TNF-a 의
활성을 촉진시킬 것으로 보고된 바 있다 . 이 러한 이유로 최근에 산소자유기의 산화적 손 상과 관련된 병변의 치료에 항산화제를 비롯 한 NMDA 수용체의 길항제2) 나
.
Ca2+ 의 길항제를 사용한 치료법이 모색되고 있다 12) 특 히, 항산화제나 산소자유기의 제거제 등은 직 접 과량 생성된 산소자유기를 제거하므로써 병변을 회복시키는데 중요한 역할을 한다는 연구결과에 의하여13)
산소자유기의 산화적 손상과 이에 대한 산소자유기 제거제의 퇴행 성 병변의 회복 및 손상방어효과에 대한 기전 을 밝히려는 연구가 진행되어 왔다.4. 14)
이러한 연구와 관련하여 최근에 뇌허혈이나 치매와 같은 각종 뇌질환에 한약이 뇌질환 치 료에 유효하다는 연구가 보고되고 있으며 최 근의 四象醫學 연구에서는 四象處方의 效果를 과학적으로 입증하고자 하는 여러 가지 시도 가 이루어지고 있다. 본 연구에서는 太陰A
의 腦硬塞효 초기에 熱多寒少場의 加味方들이 활용되고 있다는 점에 착안하여 , 흰쥐의 大腦 神經細뼈를 배양하여 일정시간 저산소증으로 인한 in vitro 허혈 상태를 유도하여 발생하 는 신경세포독성과 이에 대한 熱多寒少傷의 신경세포보호효과를 확인하였으며
.
산소자유기의 일종인 Hydrogen peroxide(H202) 로 유발되는 독성효과와 熱多寒少場의 신경세포 보호효과를 관찰하였다. 또한 熱多寒少場의 신경세포 보호효과의 기전을 분석해보기 위하
여 SK-N-MC 세포를 이용하여 저산소증에
의한 신경세포의 세포고사에 미치는 熱多寒少 場의 효과를 분석하였기에 그 결과를 보고하
- 73 -
훌根 Radix Puerariae 16
黃흑 Ra¼„x Scurellariae 8
훌本 ÅÆlizoma Ligusrici 8
羅홉子 Semen Raphani 4
結t更 Radix PlarycÅìi 4
升麻 Rhozoma Gmicifugae 4
81£ Radix Angelicae DÀ¶mClcae 4
Total amount 48
- 사상셰질의학회지 저115 권 제 1 호 2003 -
는바이다.
ll. 實驗材料 및 方法
1. 材 料
1) 實驗動物
本 實驗에 使用한 동물은 ICR 계통의 건강상 태가 양호한 생후 3 일 된 생쥐를 使用하였다 .
2) 藥 材
本 實驗에 사용한 熱多寒少場의 處方은 李濟 馬의 東醫露世保元 15)
에 근거하였으며 . 1 칩
의 분량은 다음과 같다 .
Prescription of Yeoidahanso-tang(YlIT) Herbal
Name Scientific Name Weight(g)
2. 훌驗方法
1) 檢浪의 調햄l
檢滾의 調했j 를 위하여 熱多寒少場의 구성 성
분 100 g 을 증류수 lL 와 함께 환저플라스크
에 넣고 冷최쟁융를 附휠:
하여 2 시간 동안 電熱 器로 前‘場한후 前‘場浪을3.000 rpm 에서
20 분 간 원심분리하여 여과지로 여과하고 , 진공 농축기로 감압농축한 후 i 東結乾操器에서
24 시간 i縮솜乾操하여 분말 시료를 얻었다. 2) 훨뺑j 製造
本 實驗에 사용한 약제로는 dimethylsulfoxide
(OMSO. Merk), X"π、 (Sigma). NR (Sigma).
trypsine (Sigma) 등은 각각 증류수에 녹여
저장액을 만들어 냉암소에 보관한 후 實驗 당 일 적당한 양으로 희석 사용하거나 펼요한 양 을 직접 培養浪에 첨가하여 사용하였다. 熱多 寒少場 추출물의 투여는 분말을 증류수에 녹
여 0.22 μm의 micro pore filter 를 이용하여
멸균하여 사용하였다 . 3) 細뼈 培養
대뇌神經細뼈의 분리는 田 등(998) 16) 의 方 法에 따라 施行하였다 . 즉. 생후 3 일 된 생쥐
에서 적출한 뇌조직을 trypsin 을 이용한 해리
술에 의하여 분리한 다음 phosphate buffered
saline(PBS) 으로 세척하였다. 세척완료 후
Eagle's minimum essential medium
(EMEM. Gibco) 으로 3회 세척 후 분리된 세
포들은 poly-L-lysine (Sigma) 으로 코팅된
96-multiwell 에 3x 106cells/well 의 밀도로
세포를 분주하였다 . 분주된 세포는 36 °C.
95% air/5% C02 로 조절된 정온기 내에서
培養하였으며 3 일 간격으로 새로운 培養浪으 로교환하여주었으며 7 일동안培養後本 實驗에사용하였다. 또한 SK-N-MC 세포는
37 °C. 습도 C02 5%. 95% air. FCS 10%
의 DMEM 에서 유지시켰다 .
4) 虛血 設導
허 혈유도를 위하여 세 포를 glucose-free
Hanks ’ balanced salt solution(HBSS.
Gibco) 으로 교환후 95% nitrogen/5% C02
로 조절된 정온기 내에서 일정시간 동안 노출시 킨 후 허혈을 유도하였다. 대뇌신경세포나
SK-N-MC 세포가 80 % 차게될 때 세포는 자
유산소를 제거하기 위해 혐기성 glove cabinet 이 용해져 있는 습도가 있는 3TC incubator
에 5% C02 와 95% N2 균형상태에서 배양했 다 . 산소농도는 blood gas analyzer 로 측정 하
- 74
- 多흉少훌이 低훌훌↑호大腦M 엎1m! 힌 손상에 미치는 影훌 -
였으며. chamber 내의 산소 농도는 배양 기
간 동안 10 ppm 이내로 유지했으며 , 반연
medium 의 산소분압은 hypoxic chamber
로 옮긴후 15 분
.
30 분. 1 시간.
6 시간.48 시간에서 4.3. 3.0. 2.2. 2.0 그리고
2.0:!:0.2% 까지 각각 떨어지는 상태를 유지
했다 .
5) 산소자유기 처리
H202 가 생쥐의 대뇌신경세포에 미치는 영향 을 조사하기 위하여 일정 시간 배양한 대뇌신
경세포를 0.6% D-glucose 가 함유된 MEM 으
로 3 회 세척한 다음 10-80 11M 을 여러 농도 로 조합하여 혼합한 다음 이들 각각의 배양액 에서 2-16 시간 동안 처리한 후 분석하였다 .
6) 虛血의 쩌TI脫毒性 측정 및 熱多寒少場추 출물의 防쩔效果 分析
(D XTT. NR assay
XTT 의 定붐을 위하여 뇌허혈이나 한약추 출풀을 處理한 t 곰養 대뇌神經細脫를 PBS 로
3 회 세척한 후 전날 제조한 3 mg/ml 의
XTT 를 well 당 最終獨度로 희석하여 넣어 3 7'C. 5% CO2 로 조절된 정온기에서 培養하 였다 }. 숍養이 完了된I 후 이를 DMSO 로 處理
한 다음 spectrophotometer 로 530 nm 에
서 홉광도를 생 定 後 對照群과 比較 調쭉하였 다 . NR 의 定量은 Mosmann ( 1983) 의 방법 에 따랐다 . 즉 허혈이나 한약추출물을 처리한 培養 대뇌神經細뼈를 phosphate buffered
saline (PBS) 으로 3 회 세척 후 전날 제조한
5 mg/ml 의 NR 을 well 당 최종 繼度로 회석
하여 넣은 다음 3시간 동안 37'C. 5% CO2
로 조절된 정온기에서 t 숍養하였다 . 培養 완료
후 PBS 로 3 회 세척후 1% formalin 으로
處理한 다음 spectrophotometer 로 540
nm 에서 흡광도를 뼈定하여 對照群과 比較 調 효하였다 .
CZ) MTT. SRB assay
MTT 정 량은 Mosmann3) 의 방법 에 의 하였 다 . H202 나 약재추출물을 처리한 배양 신경세
포를 PBS 로 3 회 세척한 후 전날 제조한 50 mml 의 MTT 를 well 당 최종농도로 회석하
여 넣어 37'C. 5% CO2 로 조절된 정온기에서
배양하였다 . 배 양 완료 후 dimethylsulfoxide
<DMSO. Merk) 를 처리한다음 spectrophotometer
로 590 nm 에서 홉광도를 측정 후 대조군과 비 교 조사하였다 . 산소자유기나 한약재 추출물로 일정시간 동안 처리한 대뇌신경세포에 0.4%
sulforhodamine B를 200 μ씩 첨가하여 1
시간 동안 실온에 방치한 다음 1.0% acetic acid 로 3 회 세척하였다 . 세척 완료후 10 mM Tris base 를 이용하여 SRB-bound protein 을 녹인 후 ELISA reader 로 540nm 에서 홉 팡도를 측정하여 대조군과 비교 조사하였다 .
Q) catalase 및 SOD 활성 측정
catalase 활성의 分析은 130 mM phosphate
buffer(pH 7.0) 와 12 mM H202 로 구성된
반응액에 효소액을 40 따를 가하여 잘 혼합 하였다. 혼합완료후 반응을 정지시킨 후
catalase 의 양적변화를 홉광광도계로 240 nm
에서 측정을 하였으며 효소의 활성은 백 분율 로 환산하였다 .
허혈이나 한약추출물에 대한 SOD 활성의
測定은 1.5 ml Tris-buffer 에 0.1 ml 효소
용액과 효소반응액을 넣고 25 "C에서 10 분
동안 반응시켰다. 반응완료 후 0.05 ml
1N-HCI 을 가하여 잘 혼합한 후 420 nm 에
서 홉광도를 측정하여 대조군파 비교 조사하 였다 .
@ PKC 및 TNF-a 활성 측정
저산소나 한약추출물을 일정 시간 동안 처 리한 대뇌신경세포에서 TNF-a 변화에 미치 는 영향을 조사하기 위하여 대뇌신경세포를
일정 시간 동안 처리한 후 anti-rabbit
TNF-a 와 phosphatase-conjugated goat
anti-rabbit IgG 및 2.2' -azinobis 를 처리
한 다음 450 nm 에서 정량 분석하였다 . 또한 저산소나 한약추출물을 일정 시간 동안 처리한 대뇌신경세포를 변형된 Hu. Chakravarthy
등 0990 )의 방법에 따라 분석하였다 . 세포
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- 사상채질의학회지 제15 권 제1호 2003 -
를 냉각한 PBS 로 세척하고 0.5 ml 의 냉각
한 hypotonic lysis medium 0 mM
NaHC03. 5 mM MgC12. and 100 11M
phenyl methyl sulfonylfluoride) 에 2 분
동안 현탁하고 다시 2 분 동안 vortexing 하여 용해시킨다 . 이러한 반응은 4"C 하에서 실시 한다. 핵파 용해되지 않은 세포는 600 x g 에 서 5 동안 침전시킨다. Membrane 과 cytosol 분획은 100.000 x g에서 10 분 동안 초원심 분리 (Beckman TL-lOO ultracentrifuge)
한다. 막의 PKC 활성은 MARCKS protein 에 특이적인 PKC- 인산화에 해당하는 peptide
substrate 인 Ac- FKKSFKL- NHz 을 이용하
여 측정하였다 .
이 기 질 peptide 는 모든 주요한 PKC
isoforms 에 의해 동둥하게 인산화되는 것으
로 밝혀졌다 . assay 를 위한 반웅액에는 assay
buffer[50 mM Tris-HCI (pH 7.5), 5
mM MgC12. 1 11M CaCho 100 11M sodium
vanadate. 100 11M sodium pyrophosphate.
1 mM sodium fluoride. and 100 11M
phenyl methyl sulfonyl fluoride] 에 3-8 μg
의 단백질을 포함하는 20-50 때의 membrane
suspension 용액과 10 뼈의 750 11M PKC
기 질 peptide (50 mM Tris-HCl buffer.
pH 7.5) 를 가하고 총 용량을 50 mM
Tris-HCl buffer(pH 7.5) 로 90 뼈가 되게
최종적으로 조정하였다. 반응은 10 μg의 50011
M [3zp]ATP (220 cpm/pmol in Tris
buffer: 0.5 mCi/tube) 로 시작하여. 25 °C
에서 10 분 동안 반응하고. 10 때의 5%
acetic acid 로 반웅을 정지시 켰다 . 반응액을
16.000 x g 에서 5 분 동안 원심분리하였다 .
90 III의 상청액을 P81 Whatman paper 에
옮기 고 건조하였다 . 그것을 5% acetic acid
로 10 분 동안 가볍게 stirring 하여 세척하 였다 . P81 종이 에 부착한 radioactivity 는 섬 광계수기에 의하여 측정하였다. 기질 peptide 에 환합된 radioactivity 를 계산하기 위하여 비특이적 결합은 peptide 가 없는 상태의 결
과로서 결정하였다.
(5) LDH 측정 및 DNA 분절현상
LDH 활성은 200 mM Tris-HCI buffer.
1.5 mM NAD. 0.32 mM HCl 과 시료를 혼 합한 후 3TC 에서 5 분 동안 처리한 다음 0.1 N HCI 을 넣어 잘 혼합한다. 혼합 후 반응이 완료된 다음 500nm 에서 홉광도를 뼈IJ定하여 對 照群과 比較 調효하였다 . DNA 분절현상을 관 찰하기 위하여 세포들은 PBS 로 세척하고 ,
lysis bufferOOmM Tris-HCl: pH7.4.
5mM EDTA. 0.5% Triton X-100) 를 이용
하여 4 °C에서 20 분 간 용해시킨 후 4"C 에서 15
분 간 27000xg 에서 원심분리 하였다 . 상층액 의 DNA 는 페놀. 페놀/ 클로로포름O:l,v!v),
그리고 클로로포름의 세 단계로 추출되었다 . 그
리고 DNA 는 0.1 vol. 3M sodium acetate
(pH 5.2) 와 2 vol. ethanol 로 침전되었다.
DNA 는 TE buffed 10mM Tris-HCl
(pH 8.0): 1mM EDTA) 로 용해하였고 3TC
에서 1 시 간 동안 40 μg/m£ RNase A 를 처 리 했다 .DNA 농도는 260 nm 에서 홉광도로 확 인하고. 20 뼈 DNA 를 TAE buffer(40mM
Tris-Hcl: pH 8.5. 2mM EDTA) 로 1.5%
gel 상에서 전기 영동 하였다 . 전기영동 후 15 분 간 0.5 뼈/m£ ethidium bromide 로 염색 하여 UV transilluminator 를 통하여 확인하 였다.
@ 형태학적 변화
DNA 의 염색은 5 x 105 개의 세포를 2 μg
/m£ DAPI (Sigma) 로 30 분 동안 37 "C에
서 시행하고
.
형광현미경으로 관찰하였다. DAPI 염색은 원형질막을 투과하여 염색체를 푸르게 염색한다. 살아있는 세포는 정상적인 핵 크기와 푸른 형광을 보이고, 반면에 세포 고사가 일어난 세포는 응축된 염색체와 분절 된 핵을 관찰할 수 있다.(]) Caspase 활성 측정 및 Western Blot
측정법
SK-N-MC 세포는 60 mm plates 에서 지
정된 시간 동안 저산소증 상태의 chamber 에
- 76 -
- 多흉少훌이 低u윷{
효 大腦 J$a 댈IiIIR 생 손상에 미치는 彩8-
서 배양되었다 . 저산소증 처치 후 배양액을 제거하고 세포를 PBS 로 씻은 후 50 μ
lysis buffed 50mM Tris-HCl: pH7.4.
1mM EDTA. 10 mM digitonin) 을 첨가했
다. 그 세포들을 37'C 에서 10 분 간 배양했
다. 배양 후. 부유물을 10 분 간 15,000
rpm 에서 원심분리했다 . 다음으로 분리한
lysate (50 μg protein) 를 30 분 간 50 uM
Ac-DEVD-MCA 나 60 분 간 Ac- YV AD-
MCA 와 함께 배양했다. 분비된 7-amino-4-
methylcoumarin (AMC) 의 양은 380 nm 에
서 excitation 하고 460 nm 에서는 emISSIOn 하는 spectrofluorometer 를 이용하여 측정 했 다 . 한 단위는 37'C 에서 분당 AMC 1 pmol
분비하는 것을 효소 요구량으로 정의되었다 .
Western Blot 측정법에 의해 5xlQS 세포를
냉각된 PBS 로 두 번 씻고
.
buffer A 500뼈 ( 50 mM Tris: pH 7.4. 1 mM
EDTA. 1 mM EGTA. 250 mM sucrose
2 뼈/m£ leupeptin. 1 mM PMSF. and 1
mgjm£ pepstatin) 를 첨가 했다. 세 포들은
Dounce homegenizer 를 이용하여 분쇄하였
으며 , 분쇄물은 초원심분리에 의해 cytosol 과
membrane 조각으로 분리되었다. 분해물과
membrane 은 SDS sample buffer 와 함께
5 분 간 끓였다. 동량의 각각의 생플들은(20
μg) 4.C 에서 1 시간 동안 100 V로 12%
SDS-PAGE 를 했고 , nitrocellulose filter 에
transfer 했다. filter 는 상온에서 l 시간 동안
5% non-fat milk 가 들어있는 TBST(lOmM
Tris-HCl: pH 7.5, 100mM NaCl. 0.1%
Tween 20) 으로 처리하였다. Human antHch-1
(caspase-2, Santa Cruz). anti-caspase-
3(PharMingen). anti-PARP (Clontech) 를
1 차 항체로 사용응} 였고, horseradish pero 잉dase
-labeled goat 또는 mouse Ig 를 2 차 항체로
사용흠얹다. 항체반응 밴드는 chemil uminescence
(ECL Western detection kit) 로 보여졌다.
Cytochrome c 단백질은 mouse 단일클론성
anti-cytochrome c 항체를 이용하여 Western
blot 분석을 하였다. 7) 統計 處理
휩쫓웠 結果에 대한 유의성의 검정은 Student-t test 에 의하였으며 p 값이 0.05 와 0.01 이 하인 것만 유의한 것으로 하였다 .
m. 實驗成續
1. 저산소증메 의한 대뇌신경세포의 손 상과 熟多寒小場의 보호작용
저 산소증에 따른 in vitro ischemia 에 노 출된 시간 및 熱多寒少場의 처리가 배양된 대 뇌신경세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여 저산소 상태로 조절된 정온기에서 세포를 각 각 2시간에서 16 시간 동안 노출시켰다. 그 후 세포의 생존율을 XTT 법에 의하여 대조 군과 비교 조사한 결과 2 분 간 노출군에서는 정상군에 비하여 세포생존율이 10.9% 감소 하였으며, 또한 4 시간 8시간. 16 시간 노출군
에서는 각각 30.9. 47.3(p(0.05), 76.4%
(p(O.OU 로 감소하였다. 특히 8시간 간 노출
군에서 XTTso 값을 나타냈다 . 또한 NR 정 량 으로 측정한 결과도 이와 유사한 결과를 보였
q(Table 1A). 熱多寒少場을 투여한 실험
에서는 이러한 세포 생존률의 감소가 농도 의 존적으로 억제되는 경향을 보였다 ( (Table 1B). 이러한 결과는 저산소증의 세포독성효 과를 보여주는 것이며 熱多寒少場가 저산소증 세포독성을 완화하는 효과를 나타낸 것이다 .
-77
ExperimentÅÐ Time of exposure to in vitro ischemia (ho·`) Group
0 2 4 8 16
XTI ¿otbance
0.55:!006 0,49:!0.03 0.38tO.05 0.29:!0.03 0.13:!0.0IU
뼈이
NR ¿¿ance
0.56:!O.06 0,47:!O03 0.36:!0.03 0.28ÅÐ02* 0.14:!0.02U
뻐m
ExperimentÅÐ Cancenµ0tJon 이YHIWÅ|l¼¿)
Group
0 2’ ,。 l때 200
xπ¿orbance
0.59:!O.05 0.51:!O.Åì 0,43:!O.Åì 0,49:!O.03* 0.42:!O.03U
¾|(U NRa¿¿nee
O.60:!O.Åì 053:!0.06 0,42tO.OS OJ9:!O.Q3* OJ ÅÐ.Åìu
뼈m
Hz02 Concencrarion(jl®h
&say Met¿
0 10 20 40 80
Mπ¿or¿nee
100 724t6,3 .1 ¼63.5 u 46.7i4.3* Ãh8H9**
(% of concroO
S뻐assay
100 71.1:!:6.5 61.3:!:6.5 48.5!3.8* 6.9:!:3.3U
(% of conrroO
- 사싱채질의학회지 제 15 권 세1호 2003 -
Table I. Analysis of hypoxic injury
after in vitro ischemia in cultured
mouse cerebral neurons and the
neuroprotective effect of YHTWE
(A) Time-dependent relationship of
cell viability after exposure to in vitro
ischemia
(B) YHTWE dose-dependent relationship
of cell viability after exposure to in
vitro ischemia
Cultured cerebral neurons were treated
with hypoxia with various time intervals
and various concentration. YHTWE:
Yeoldahanso-tang water extract. Data of
(A) and (B) were measured by XTT and
NR assay. The values are the mean:tSE
for 6 experiments. Significant differences
between groups are marked with asterisks.
pv 외 ue. .p(0.05: "p(O.Ol.
2. 산소자유기 처리로 인한 대뇌신경세 포의 손상과 웠多훌少훌의 보호작용
H202 로 유도된 산소자유기가 배양된 대뇌 신경세포에 미치는 영향을 조사하기 위하여 H202 가 10 uM 에서 80 uM 까지의 농도로 조 절된 배양액에서 대뇌신경세포를 6 시간 동안 배양한 후 H202 의 독성 효과를 MTT assay 법 에 의하여 조사한 결과 10. 20 uM 의 H202 처리군에서는 세포의 생존율이 정상군( 100%)
에 비하여 각각 72.4. 63.5% 로 나타났다 .
40. 80 uM 의 H202 처리군에서는 세포의 생
존율이 46. 7(p(0.05). 34.8%(p(0.on 로 정
상군과 비교하여 유의성있는 감소 결과를 보였 으며. SRB 법으로 결과도 이것과 유사한 경향 을 보였다 (Table 2A). H202 처리시간에 따른 영향도 역시 8 시간 이상 처리한 실험군에서는 유의성있는 세포생존률의 감소를 확인할 수 있 었다 (Table 2B). MTTso 값에 준하는 40
uM 의 H202. 8 시간을 처리하고 熱多뽕少楊
를 투여한 실험군에서는 100 μgjr 뼈를 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 유의성있는 세포 생존률의 감소가 억제되는 결과를 보였다
(Table 3C).
Table 2. Analysis of H202-induced
neuotoxicity in cultured mouse cerebral
neurons and the neuroprotective effect
of YH1 ’WE
(A) Concentration-dependent relationship
of cell viability by 많Ot-induced neuoto 잉city
78 -
H2Dz Incubarion Time À•c)
Assay Me0hµ
4 16
0
Mπ¿%¿nee
100 SO.3:t7.\ .6 6\.4 43.6!4.\ 22 :t\.9
(% of comrol)
SRB assay
l때 74.9:t6.4 I (iJ.l:t5.5 4l.4!4.0 29.H3.1
(% of conrrol)
Coneenrration 이
YHIWÅ|l¼¿)
Assay Method
50 100 200
0 CONT
Mπabsocbance
100 42.8!3.3 1.7! 5.5 3.Å8 / U 9. H3.9
(% of comrol)
SRB assay
l매 44.4!4.7 “2찌” 69)!4.\ 62.6:t6.8
(% of comrol)
Exposure time to hypoxia(¿)
Enzyme ACtivation
% 120
0 10 30
Ur¾|seaetiµLnon
100 83.6:t7.8 53.7:t6.6U 46.7:t8.4** 27.6!4.6U
(% of cancrol)
SOD aetivµ0Jon
100 79.4!8.3 7.8m. 43.2:t4.8U 32.6:t46U
(% of concrol)
- 多흉少훌이 M쫓↑효 大앓 .i$tfii1illffi 손상에 미치는 影흩-
(B) Time-dependent relationship of cell
viability by H202-induced neuotoxicity
(C) YHTWE dose-dependent relationship
of cell viability by lli02-indu ∞d neuoto 잉city
Cultured cerebral neurons were treated
with hydrogen peroxide(lli02) and YH'IWE
with various time intervals and variuos
concentration. YHI ’WE: Yeoldahanso-tang
water extract. Data of (A). (B). and (C)
were measured by MT ’rand SRB assay.
(A) Cultured cells were exposed to 10.
20. 40. 80 따t1 for 6 hours. respectively.
(B) Cultured cells were exposed to 40 μ
M for 1. 3. 6. 12 hours. respectively.
(C) The cultured cells were preincubated
with various concentration of YHTWE.
25. 50. 100.. and 200 μgI 뼈, respectively,
for 2 hours before exposure to 40 11M
H202 for 8 hours. All values represented
the mean 土SE for 6 experiments. Significant
differences between groups are marked
with asterisks. p value. . p(0.05: ..
p(O.OI.
3. 항산화효소(Catalase. SOD> 의 활 성 측정
저 산소증이 catalase 와 SOD 동의 항산화 효소에 미치는 영향을 관찰하였다 . 저산소증 처리 시간이 30 분 이상 경과하면 catalase 는
정상군에 비하여 53. 7(p(0.0l). 46.7(p
(O.OU. 27.6(p(0.On% 로 활성이 유의성있게
감소하는 경향을 보였으며. SOD 는 57.8(p(0.05)
.
43.2(p(0.OI), 32.6(p(0.01)% 로 활성이 유의성
있게 감소하는 경향을 보였다 (Table 3A).
세 포생 존률 50 에 준하는 값인 저 산소증의 30
분 처리와 熱多寒少場을 2 시간 동안 전처 리한 실험군에서 熱多寒少場 추출물을 100
μg/ 뼈 이상 투여한 실험군에서 catalase 는
정상군에 비하여 63.1. 82.l(p(0.OO.
78.4(p(005) % 로 증가하는 경향을 보였으며,
SOD 는 68.3. 85.l(p(0.on, 77.3(p(0.05)%
로 활성이 증가하여 유의성있는 감소의 억제를 관 찰할 수 있었다(Table 3B).
Table 3. Analysis of antioxidant
enzyme activation in cultured mouse
cerebral neurons exposed to in vitro
ischemia and the neuroprotective
effect of YHTWE
(A) Time-dependent change of catalase
and SOD activation in hypoxia-induced
neurotoxici ty
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