Determination of Agricultural Pesticides in Raw Material of Milk with High Performance Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry

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LC-MS/MS를 이용한 우유 중 농약 성분 동시 분석법 개발 및 유효성 검증

한유경․최영내․강경원․김정년․김정복 한국식품과학연구원

Determination of Agricultural Pesticides in Raw Material of Milk with High Performance Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry

Yu Gyeong Han, Young Nae Choi, Gyeong Won Kang, Jung Nyen Kim, and Jung Bok Kim Korea Advanced Food Research Institute

ABSTRACT Carbamate pesticides are compounds obtained by the reaction of carbamic acid and amine. These pesti- cides are often used as insecticides and herbicides. Especially, bendiocarb, carbaryl and carbofuran are popular carbamate pesticides LC-MS/MS using liquid-liquid extraction (LLE) and C

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cartridges was used to identify and quantity the levels of bendiocarb, carbaryl and carbofuran in raw material milk with high sensitivity and specificity. A calibration curve was obtained from 5 to 100 ng/mL with a satisfactory correlation coefficient of 0.999. The limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) for bendiocarb, carbaryl and carbofuran in the matrix were 0.8 ng/mL to 1.5 ng/mL and 3.0 ng/mL to 6.0 ng/mL, respectively. The recovery of the three pesticides from spiked samples at 15 ng/mL ranged from 103.6 to 110.7% with a relative standard deviation (RSD) between 4.6 to 4.9%. The measurement of uncertainty of the LC-MS/MS method developed for the three pesticides was based on the analytical process and quantification. Thus, the current study has established a fase and easy method for the analysis of bendiocarb, carbaryl and carbofuran in raw material milk by LC-MS/MS.

Key words: carbamate pesticides, milk, method validation, C

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cartridge, LC-MS/MS

Received 8 May 2020; Accepted 27 July 2020

Corresponding author: Jung Bok Kim, Korea Advanced Food Research Institute, Uiwang-si, Gyeonggi 16001, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-2-3470-8276

서 론

최근 기후와 환경 변화로 인하여 잔류농약의 광범위한 사 용으로 다양한 안전성 문제들이 야기되어 국내외적으로 많 은 관심이 집중되고 있다(Castro 등, 2000; Castro 등, 2001;

Vahl 등, 1998; Nunez 등, 2002).

우리나라 농림축산식품부 자료에 의하면 최근 5년간 국 내 1인당 연간 유제품 소비량 중 흰 우유의 소비량은 전체 25% 이상 차지하였으며, 유제품 전체 소비량은 5년간 계속 증가하고 있는 추세이다. 이러한 이유에서 우유에 잔류할 수 있는 여러 유해한 물질 중 잔류농약의 관리는 소비자의 안전 뿐 아니라 안전한 먹거리 제공을 위해 유효성이 검증된 우유 중 농약 성분의 분석법을 확립하고, 선제적으로 연구되어져 야 할 필요가 있다. Food and Agriculture Organization (FAO), European Union(EU) 및 Food and Drug Admin- istration(FDA)(Bogialli 등, 2004) 등에서 살충제로 사용한 carbofuran은 50~100 ng/mL, carbaryl의 경우 100~300 ng/mL로 소비자가 우유 중에 잔류할 수 있는 살충제의 최대

잔류 한계를 설정하여 관리하고 있다.

한국작물보호협회에서 발간한 2019년 농약 연보 자료에 의하면 2014~2018년 농약의 약제별 생산 및 출하 현황 중 살충제가 가장 많은 것으로 보고되어 있다. 또한 동일 연도 의 수입현황도 제초제 다음으로 살충제가 많이 수입되는 것 으로 조사되었다. 특히 카바메이트계 농약은 카바민산(carbamic acid)과 아민(amine)의 반응에 의하여 얻어지는 화 합물로 주로 살충제로 사용되나 일부 제초제로 개발된 것도 있다. 카바메이트계 농약은 생물학적 효과가 좋아 살충제, 살 균제 및 구충제 등 다양하게 사용되고 있다(Hassall, 1982).

우유와 우유 가공품에서 organochlorine(OC), organo- phosphorous(OP) 및 pyrethroid insecticides(Filek 등, 1995; Muccio 등, 1997; Muccio 등, 1996)의 분석이 있으 나 우유 중 카바메이트계 살충제 분석은 단 한 가지 방법만 보고되었다(Li와 Wang, 1997). 카바메이트계 농약의 일부 는 높은 급성 독성을 가지고 있기 때문에 식품에 사용하는 것을 주의해야 하며, 일부 농약 물질의 경우 발암물질을 발 생시키고 돌연변이를 야기할 수 있다고 보고되었다(Li 등, 1991).

기존의 연구에서 우유 중 bendiocarb, carbaryl과 car- bofuran의 분석을 위해 LLE 추출법과 C18 sorbent를 이용 하여 LC-MS/MS를 통해 분석하였으며, 3가지 물질의 정량

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한계는 0.2 ng/g으로 비교적 낮은 정량한계를 확인하였다 (Jadhav 등, 2019).

Carbaryl의 분석법으로는 지하수, 우유, 벌꿀과 과일주스 중에서 C18 카트리지를 이용한 GC-MS 분석법이 조사되었 으며, 검량선의 범위는 10~10,000 ng/kg, LOD의 경우 1 ng/kg으로 확인되었다(Shamsipur 등, 2016).

Bogialli 등(2004)의 연구에서는 우유에서 SPE 카트리지 를 이용하여 carbaryl, carbofuran을 전처리한 후 LC-MS 의 SIM 모드를 이용하여 분석했으며, carbaryl과 carbofu- ran의 검출한계는 4 ng/mL, 정량한계는 4 ng/mL로 비교적 높은 검출한계와 정량한계를 확인하였다. Goulart 등(2010) 의 연구에서는 음용수 또는 시판 음용수 중에 carbaryl, car- bofuran의 분석을 위해 C₁₈ 컬럼을 이용하여 HPLC-PDA를 이용하여 분석하였다. 그 결과 carbaryl과 carbofruran의 검출한계는 17~33 μg/L, 정량한계는 17~33 μg/L로 본 연구 의 분석법보다 높은 검출한계와 정량한계값을 확인하였다.

따라서 본 연구에서는 다양한 카바메이트계 농약 중 국내 에서 많이 사용되고 있는 살충제의 3가지 농약을 선정하여 우유 원료 중 bendiocarb, carbaryl과 carbofuran에 대한 효율적이고 효과적인 분석법을 개발하였고 유효성 검증을 실시하여 기존의 논문보다 낮은 검출한계와 정량한계값을 갖는 분석법을 확립하였고, 공시료를 적용하여 유효성 검증 을 실시하였다. 또한 식품공전에 제시한 3가지 잔류농약 분 석법보다 효과적인 시료 전처리 방법을 개발하여 전처리 시 간을 획기적으로 단축하였고, 향후 본 논문의 결과를 이용하 여 우유 중 bendiocarb, carbaryl과 carbofuran의 동시 분 석뿐만 아니라, 기준규격 설정 및 관리에 좋은 참고 자료가 될 수 있다고 판단된다.

재료 및 방법

시약 및 재료

분석법 개발과 정량분석에 사용된 표준품은 순도 98.0%

bendiocarb, 순도 98.5% carbofuran, 순도 99.5% carbaryl(Dr. Ehrenstorfer GmbH, Augsburg, Germany)을 구매 하여 사용하였다. 전처리 및 분석에 사용된 acetonitrile, dichloromethane 등(J.T Baker, Phillipsburg, NJ, USA)은 HPLC 등급으로 구매하여 사용하였다. 무수황산마그네슘은 Junsei(Tokyo, Japan) 제품을 사용하였고, petroleum ether, sodium chloride은 덕산약품공업(Ansan, Korea)으로부터 구입하였다. Ammonium acetate와 formic acid는 Sigma- Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하여 사용하 였다. SPE 카트리지는 C18(6 mL, 500 mg)로 Waters(Mil- ford, MA, USA) 제품을 구입하여 사용하였다. 그 외 시험에 사용된 일반 시약들은 특급시약 및 HPLC 등급을 사용하였다.

시료 전처리 방법

시료 21.0 g을 500 mL 원심분리용 용기에 칭량하여 무수

황산나트륨 60 g과 디클로로메탄 300 mL를 넣고 30분간 진탕추출 하였다. 이후 여과지와 무수황산마그네슘을 도포 한 뷰흐너깔때기로 감압 여과하였다, 여액을 무수황산나트 륨에 통과시켜 탈수한 뒤 감압회전농축기로 농축하였다. 이 를 헥산 30 mL로 재용해하고, 헥산포화아세토니트릴 30 mL 를 가하여 5분간 진탕하였다. 아세토니트릴층을 취한 뒤, 잔류물에 헥산포화아세토니트릴 30 mL를 가하여 위의 과 정을 반복하였으며, 취한 아세토니트릴층은 40°C 이하의 수 욕상에서 농축하였다. 농축된 시료를 사이클로헥산 2 mL로 재용해한 뒤 15 mL 시험관에 옮겼다. 이후 디클로로메탄과 사이클로헥산을 1:1로 혼합한 용매로 용량 플라스크를 씻은 다음 시험관에 합쳐 총량이 7.5 mL가 되도록 하였다. 이 중 5 mL를 질소 농축한 뒤 디클로로메탄 2 mL로 재용해하 였다. 디클로로메탄 5 mL로 활성화한 C18(500 mg, 6 cc) 카트리지에 시험용액을 유출하였다. 이후 용출액(MeOH : DCM＝1.5:98.5,

v/v

) 10 mL로 용출한 뒤 질소 농축하였다.

건조된 시료는 아세토니트릴 2 mL로 재용해하여 0.2 μm syringe filter로 여과한 뒤, LC-MS/MS에 주입하여 분석하 였다(Fig. 1).

기기분석 조건

LC-MS/MS(AB Sciex 5000, Framingham, MA, USA) 분석 조건은 분석용 컬럼 Capcell pak C₁₈(MG, 2.0 mm×

150 mm×5 μm), 이동상 A는 10% ACN in 10 mM ammonium acetate, 0.1% formic acid, B는 90% ACN in 10 mM ammonium acetate, 0.1% formic acid를 이용하였고 gradient로 분석하였다(Table 1), 온도는 40°C, 유속은 0.2 mL/min, 주입량은 2 μL로 하였다. Mass ionization mode 는 ESI이며 positive ion을 사용하여 정량하였다. MRM 조 건은 bendiocarb m/z=108.9 이온 CE(13), m/ z=167.1 이 온 CE(27), carbaryl m/z=145.0 이온 CE(16), m/z=127.0 이온 CE(39), carbofuran m/z=165.0 이온 CE(29), m/z=

123.0 이온 CE(17)이다(Table 1).

Method validation

본 연구에서는 시중에 유통되고 있는 가공 우유제품을 이 용하여 ICH 가이드라인의 method validation 방법을 참고 하여 실시하였다. Method validation 항목으로는 분석물질 과 matrix의 방해와 간섭을 확인하기 위해 선택성과 특이성 을 확인하였다. 10~100 ng/mL의 직선범위에서 직선성을 확인하였고, 검량선 내 농도를 선택하여 정밀성, 정확도 및 회수율을 확인하였다. 추가적으로 method validation의 항 목 중 하나인 측정불확도 산출을 위해 불확도 요인을 선정하 였다. 불확도 요인은 총 6가지로 표준품의 순도, 표준품의 제조, 검량선 3가지 농도, 검량선(회귀분석), 시료의 반복 측정 등으로 불확도 요인을 Fig. 2와 같이 설정하여 각 과정 에서 오차 각각의 표준불확도를 산출하여 합성측정불확도 를 산출하는 방법을 이용하여 우유 원료 중 3가지 농약 성분

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Fig. 1. Sample preparation of pesticides in raw material of milk.

Table 1. Instrumental conditions of carbamate pesticides with LC-MS/MS

Instrument LC-MS/MS (API 5000)

HPLC

Column Oven temp.

Mobile phase

Capcell pak C18 (MG, 2.0 mm×150 mm×5 μm) 40°C

A: 10% ACN in 10 mM ammonium acetate, 0.1% formic acid B: 90% ACN in 10 mM ammonium acetate, 0.1% formic acid

Gradient

Time (min) 0.0 3.0 10.0 15.0 18.0 20.0 A (%)

B (%)

80 20

0 100

80 20

80 20 Flow rate

Injection vol.

200 µL/min 2 µL

MS/MS

Ionization type Source

ESI (positive ion mode) Turboionspray source Curtain gas

Ion source gas 1 Voltage

20 50 5,500

Collision gas Ion source gas 2 Temperature

8 50 550°C Fragment ion (CE) Bendiocarb (MW＝224.1)

m/z＝108.9 CE (13), m/z＝167.1 CE (27) Carbaryl (MW＝202.0)

m/z＝145.0 CE (16), m/z＝127.0 CE (39) Carbofuran (MW＝220.0)

m/z＝165.0 CE (29), m/z＝123.0 CE (17)

의 정량분석법 결과에 대한 측정불확도를 산출하였다.

결과 및 고찰

시료전처리 및 분석법 확립

식품의 기준 및 규격에 분산되어 기재된 분석 방법을 적용 하여 회수율이 낮은 분석법들의 감도와 회수율을 높이고 우

유 및 우유 가공품 시료에 적용이 가능한 유효성이 검증된 bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran 분석 방법 개발을 위 해 액체-액체 추출법과 C18 카트리지를 이용하여 LC-MS/

MS 분석법을 확립하였다. 또한, 기존의 방법보다 낮은 검출 한계와 정량한계값을 산출하는 신속하고 정확한 시료 전처 리법을 Fig. 1과 같이 시료전처리법을 확립하여 분석한 크 로마토램은 Fig. 3과 같다. 확립된 분석 방법의 유효성 검증

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Fig. 2. Fish bone diagram of uncer-

tainty.

Fig. 3. Total ion chromatogram

(TIC) and chromatogram of bendiocarb, carbaryl and carbofuran standard (0.1 ug/mL) with LC-MS/MS.

을 실시하였다.

선택성 및 특이성

선택성 확보를 위해 잔류농약인 bendiocarb, carbaryl과 carbofuran의 대상 시료 중 잔류허용기준이 가장 낮은 시판 우유를 이용하여 선택성과 특이성을 확인하는 blank로 사용 하였다. 3가지 농약의 선택성과 특이성을 확인하기 위해 확 립된 시험방법의 시료 전처리법을 적용하여 분석한 결과, 공시료 중 bendiocarb, carbaryl과 carbofuran의 머무름시 간과 질량 대 전하비(m/z)가 같은 방해물질의 간섭과 분석 물질이 검출되지 않는 것을 확인하였다.

직선성

직선성 확인을 위해 matrix를 적용한 표준용액을 이용하 여 직선성(linearity)을 확인하였다. Bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran의 blank를 선정하여 matrix effect를 확인하 였다. 5개 검량선의 농도 5, 10, 20, 50, 100 ng/mL를 계열 희석한 표준용액으로 이용하여 검량선을 측정하였다. 그 결 과 3가지 분석물질 각각의 결정계수(r²) 0.999 이상의 직선 성을 확인하였다(Table 2).

일내, 일간 정밀성 및 정확성

Bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran의 일간 및 일내 정 밀성과 정확성을 확인하기 위해 검량선내 3가지 농도 5, 20, 100 ng/mL를 선정하여 측정하였다. 그 결과 bendiocarb의

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Table 2. Linearity result of 3 mixture pesticides in matrix

Analytes STD range Day R² Slope Intercept

Bendiocarb 5∼100 ng/mL

1 day 2 day 3 day Mean (n＝3)

0.9996 0.9978 0.9993 0.9989

44,903.4 33,905.8 27,556.6 35,455.3

38,774.3 58,684.5 33,404.5 43,621.1

Carbaryl 5∼100 ng/mL

0.9996 0.9999 0.9998 0.9998

72,774.8 71,971.4 61,288.0 68,678.0

68,534.0 17,259.7 57,343.0 47,712.2

Carbofuran 5∼100 ng/mL

0.9998 0.9981 0.9991 0.9990

146,243.4 117,294.8 93,629.4 119,055.9

206,595.5 229,891.6 82,710.4 173,065.8

Table 3. Result of accuracy and precision in intra and inter-day

Analytes Parameter Conc. (ng/mL, n=3)

5 20 100

Bendiocarb

Intra-day

Mean (n=3) Precision (%) Accuracy (%)

4.8 4.0 96.2

20.8 1.6 103.9

99.2 3.3 99.2

Inter-day

4.5 6.5 90.1

20.7 0.9 103.7

101.2 5.0 101.2

Carbaryl

Intra-day

4.8 4.3 96.9

20.9 3.5 104.5

99.1 4.4 99.1

Inter-day

4.8 10.5 95.3

20.7 4.1 103.3

98.0 4.4 98.0

Carbofuran

Intra-day

4.5 5.3 90.9

21.8 3.4 109.1

100.0 3.8 100.0

Inter-day

4.7 14.8 94.2

21.7 6.8 108.5

101.2 2.7 101.2

Table 4. Result of recovery and LOD＆LOQ in matrix

Analyte Conc.

(ng/mL) Recovery

(%)±RSD LOD

(ng/mL) LOQ (ng/mL) Bendiocarb

Carbaryl Carbofuran

15

110.7±4.6 103.6±4.9 103.6±4.9

1.5 1.5 0.8

6.0 6.0 3.0 일내 정밀성은 4.0% 이하, 정확성은 96.2~103.9%, car-

baryl의 정밀성은 4.3% 이하, 정확성은 96.9~104.5%, car- bofuran의 정밀성은 5.3% 이하, 정확성은 90.9~109.1%로 확인되었고, bendiocarb의 일간 정밀성은 6.5% 이하, 정확 성은 90.1~103.7%, carbaryl의 정밀성은 10.5% 이하, 정 확성은 95.3~103.3%, carbofuran의 정밀성은 14.8% 이하, 정확성은 94.2~108.5%로 확인되었다(Table 3).

회수율, 검출한계(LOD) 및 정량한계(LOQ)

확립된 분석법의 회수율 측정을 위해 농약 기준 규격의 잔류허용기준(maximum residue limit: MRL＝0.02~0.05 mg/kg)을 고려하여 15 ng/mL 농도를 선정한 후 한 가지 농도에서 bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran의 회수율 실 험을 2반복으로 수행하였다. 그 결과 bendiocarb, carbaryl

및 carbofuran의 평균 회수율은 103.6~110.7%였으며, 이 때 상대표준편차는 모두 4.9% 이하로 확인되었다(Table 4).

확립한 분석법을 적용하여 저농도 시험용액의 반복 분석 결과를 이용해 signal/noise(S/N) ratio 법을 적용하여 bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran의 검출한계 및 정량한계를 산출하였다. 각각의 성분의 저농도를 반복 분석하여 bend- iocarb의 정량이온(m/z=108.9)과 정성이온(m/z=167.1), carbaryl의 정량이온(m/z=145.0)과 정성이온(m/z=127.0)

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Table 5. Expanded uncertainty of 3 mixture standard in sample

Analytes Parameters of uncertainty Result Unit

Bendiocarb

Certified concentration The result of uncertainty Expanded uncertainty (U)

14.17

14.17±0.82 (k=2, 95% confidence level) 0.82

mg/kg mg/kg mg/kg

Carbaryl

14.34

mg/kg mg/kg mg/kg

Carbofuran

14.28

mg/kg mg/kg mg/kg

및 carbofuran의 정량이온(m/z=165.0)과 정성이온(m/z=

123.0) 각각의 peak area 값과 peak height를 확인한 후, S/N ratio를 이용하여 산출한 검출한계와 정량한계는 Table 4와 같다. 정량이온 상대표준편차(RSD)는 bendiocarb 4.6

%, carbaryl 4.9% 그리고 carbofuran 4.9%로 확인되었다.

그 결과 3가지 성분의 검출한계는 0.8~1.5 ng/ mL, 정량한 계는 3.0~6.0 ng/mL로 확인되었다(Table 4).

측정불확도 산출 결과

Bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran 각각의 측정불확 도를 산출하기 위해 설정된 불확도 요인은 총 6가지로 표준 품의 순도, 표준품의 제조, 검량선 3가지 농도, 검량선(회귀 분석), 시료의 반복 측정으로 불확도 요인을 설정하였다. 설 정된 불확도 요인과 자유도를 이용하여 합성상대표준불확 도, 합성표준불확도, 포함인자 및 시료 측정 결과로 확장불 확도를 산출하였다. 그 결과 bendiocarb의 측정불확도는 14.17±0.82 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2), carbaryl의 측정 불확도는 14.34±0.91 mg/kg(신뢰수준 95%, K=2), 마지막 으로 carbofuran의 측정불확도는 14.28±0.79 mg/kg(신뢰 수준 95%, K=2)로 확인되어 낮은 측정불확도 값을 확인하 였다(Table 5).

요 약

해마다 연간 우유 소비량이 증가하는 우리나라의 경우, 유해 물질 관리와 안전은 더욱 중요하다. 한국작물보호협회에서 자료에 의하면 2014~2018년 농약의 약제별 생산 및 출하 현황 중 살충제가 가장 많은 것으로 보고되어 있다. 카바메 이트계 농약은 생물학적 효과가 좋아 살충제, 살균제 및 구 충제 등 다양하게 사용되고 있다. 카바메이트계 농약은 일부 는 높은 급성 독성을 가지고 있기 때문에 식품에 사용되는 것을 조심해야 하고, 일부 물질의 경우 발암물질을 발생시키 고 돌연변이를 야기할 수 있다고 보고되었다. 본 연구에서는 다양한 카바메이트계 농약 중 국내에서 많이 사용되고 있는 살충제의 3가지 농약을 선정하여 우유 원료 중 bendiocarb, carbaryl과 carbofuran 등에 대한 효율적이고 효과적인 분

석법을 개발하였고 유효성 검증을 실시하였다. 시료를 무수 황산나트륨과 디클로로메탄을 넣고 진탕추출 후 탈수한 뒤 농축하였다. 이를 헥산과 헥산포화아세토니트릴을 이용하 여 지방을 제거하고 C18 카트리지를 이용하여 정제 후 LC- MS/MS에 주입하여 분석한 결과, bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran의 표준원액을 blank를 이용하여 5~100 ng/mL 범위에서 결정계수(r²) 0.999 이상의 직선성을 확인하였다.

Bendiocarb의 일내 정밀성은 4.0% 이하, 정확성은 96.2~

103.9%, carbaryl의 정밀성은 4.3% 이하, 정확성은 96.9~

104.5%, carbofuran의 정밀성은 5.3% 이하, 정확성은 90.9

~109.1%로 확인되었고, bendiocarb의 일간 정밀성은 6.5

% 이하, 정확성은 90.1~103.7%, carbaryl의 정밀성은 10.5

% 이하, 정확성은 95.3~103.3%, carbofuran의 정밀성은 14.8% 이하, 정확성은 94.2~108.5%로 확인되었다. Ben- diocarb, carbaryl 및 carbofuran의 평균 회수율은 103.6~

110.7%였다. 이때 상대표준편차는 모두 4.9% 이하로 확인 되었다. 3가지 성분 각각의 검출한계는 0.8~1.5 ng/mL, 정 량한계는 3.0~6.0 ng/mL로 확인되었다. 측정불확도를 산 출한 결과 bendiocarb는 14.17±0.82 mg/kg, carbaryl은 14.34±0.91 mg/kg, carbofuran은 14.28±0.79 mg/kg(신 뢰수준 95%, K=2)으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 우 유 중 bendiocarb, carbaryl 및 carbofuran의 정성 및 정량 분석을 위해 유효성이 검증된 동시 분석법을 확립함으로써 향후 우유 중 잔류물질 기준규격 설정 및 관리에 참고 자료 가 될 수 있다고 판단된다.

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