택란의 비만세포 매개 즉시형 알레르기 반응의 억제 효과
김숙현 • 김대근 • 임종필 • 채병숙* • 신태 용#
우석대학교 약학대학,*우석대학교 이공대학
(R eceived Septem ber 2 5
,
20 0 2; R e vise d D e ce m b e r 4,
2002)Inhibitory Effect of Lycopus lucidus on Mast Cell-Mediated Immediate-Type Allergic Reactions
Suk-Hyun Kim, Dae-Keun Kim, Jong-Pil Lim, Byeong-Suk Chae* and Tae-Yong Shin#
College of Pharmacy, Woosuk University, Wanju, Jeonbuk 565-701, Korea
^College of Science and Engineering, Woosuk University, Wanju, Jeonbuk 565-701,Korea
Abstract — The effect of aqueous extract of Lycopus lucidus Turcz. (Labiatae)(LLAE) on mast cell-mediated immediate-
type a lle rg ic reaction s w as in vestigate d . L L A E (0 .0 1 to 1 m g/g) d o se -d e p e n d e n tly in h ib ite d s y ste m ic a n a p h y la x is in d u ce d b y com pound 48/80. L L A E (0 .0 01 to 1 m g/g) a lso d o se -d e p e n d e n tly in h ib ite d local an ap h yla xis activate d b y a n t i-d in i- trop henyl (D N P ) Ig E . W h e n L L A E w as p retreated at the sam e con cen tratio n w ith s y s te m ic a n ap h ylaxis, s e r u m h is ta m in e le v e ls w ere red uced in a dose-d ep endent m anner. L L A E (0 .0 01 to 1 m g/m /) d o se -d e p e n d e n tly in h ib ite d h is ta m in e re le a s e from rat p erito n eal m ast c e lls ( R P M C ) activated b y com pound 48/80. T h e le v e l o f c A M P in h um an m ast c e ll lin e ( H M C - 1 ) ce lls, w h en L L A E ( 1 m g/m /) w as added, sig n ifica n tly w as incre ase d , com pared w ith that of n o rm a l con trol. T h e s e r e s u lts provide e vid e n ce s that L L A E m a y be b e n e ficia l in the treatm ent of a lle rg ic d ise a se s.Keywords □ Lycopus lucidus, anaphylaxis, compound 48/80
,anti-dinitrophenyl (DNP) IgE, cAMR histamine, mast cells.
비만세포는피부
,
호흡기,림프관주위,
혈관주위,
위장관의 점막,
뇌등전신의 장기에 널리 분포하고 있으며,알레르기 반 응의 유발에필수적인세포로 알려져 있다.1> Ishizaka
등2>은비 만세포로부터 히스타민의 유리가즉시형 알레르기 반응의 병리 학적진행과정에필수적 단계임을밝혔으며, Saito
둥3>은즉시형 피부알레르기빈움의 전형적인실험모델인수동피부아나필락 시반응을확립하였다.
초기즉시형 알레르기 반응은대부분비 만세포를매개로하여 일어난다.
비만세포의 탈과립을유도하는비만세포의 활성화는
IgE
수용 체에 항원, anti-IgE, lectin
둥의 결합이나anaphylatoxin
등에 의한 자극, calcium ionophore, compound 48/80,codeine
및 합성부신피질자극호르몬과같은약리학적 복합물에의하여 일 어난다.4ᅦ비만세포의 탈과립을유도하는여러가지 물질중
compound
48/80
은비만세포내의 칼슘수준을증가시켜 아나필락시 반응#본 논문에 관한 문의는 저자에게로 (전화) 063-290-1572 (맥스) 063-290-1567 (E-mail) [email protected]
을일으키는가장 많이사용되는 약물이다
.8)
이러한비만세포의 탈과립을유도하는자극에 의하여 세포내과립에 저장되어 있는 히스타민등의 화학적 매개물질이 유리되고,
그결과 말초혈관 에대한투과성 항진과확장작용,
점막표면에 대한선세포의 분 비항진작용,
기관지 평활근에 대한수축작용등을 일으켜 알레 르기 빈응이 발현하게 된다.
택란
[Lycopus lucidus Turcz
.)은 꿀풀과(Labiatae
)에속하는 다년생초본으로 어혈에의한무월경,
월경불순,월경통,산후부 종,타박에 의한내출혈 등에사용되며,
민간에서는 항염중약으 로사용•되고있는약물이다.9-12>
본연구에서는
disodium cromoglycate (DSCG
)를 비교 약물 로사용하여13) compound 48/80
유발 전신성 아나필락시, anti-
DNP
I g E에의한국소성 아나필락시 및흰쥐 복강 비만세포로부터 히스타민의유리에 미치는택란의영향을분석하였으며
,
세포내
cAMP
양을측정하여 이들의 작용기전을검토하였다.
실 험 방 법
시약 및기기
- Compound 48/80, anti-dinitrophenyl (DNP)
405
406 김숙현 • 김대근 • 임종필 • 채병숙 • 신태용
IgE, DNP-human serum albumin (HSA), o-phthaldialdehyde
및metrizamide
는Sigma
사 제품을 사용하였다. tx-minimal essential medium (oc-MEM
)은Flow Laboratories
에서구입하였 다. cAMP kit
는Amersham
사에서구입하여 사용하였으며 기타 시약은시판시약특급을사용하였다.
기기는spectrofluorometer (Shimadzu, RF-5301 PC), spectrophotometer (Shimadzu, UV-
1 2 0 1)를사용하였다
.
실험동물
- Wistar
계흰쥐및ICR
계생쥐는대한바이오링크(
충북)에서 구입하여 실험에시용할 때까지온도22±2
0C,
상대습도
55±5%
로유지되는항온,
항습사육실에서시육하였다.
人
h
용약제(L L A E )-
택란은2000
년7
월전북순창에서 채집 하여 음건후중류수로수욕상에서5
시간씩2
회추출하고감압농축한다음동결건조하며
-40C
에서 보관하였다.
이추출물을人}용직전에 생리식염수또는
Tyrode buffer A (10 mM HEPES, 130 mM NaCl, 5 mM KC1, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5.6 mM glucose, 0.1% bovine serum albumin)
를사용하여 일 정농도로조제하였다.
Compound 48/80
에의한전신성아나필락시-Shin
등14>의방 법에따라실험하였다.
즉비만세포의 탈과립제로compound 48/
80 (0.008 mg/g,
체중)을흰쥐의복강내에주사하였으며, LLAE (0.001-1 mg/g,
체중)는생리식염수에 녹인디음compound 48/
80
주사 1시간전에복강내에주사하였다.
또시간의존실험으 로compound 48/80
을투여하고5
분및10
분후에각각LLAE
( 1
mg/g,
체중)을복강내에주사하였다.
치사율실험은아나필 락시 속을유발시킨후1시간동안관찰하였으며 관찰후 생쥐 의심장에서 채혈하고혈청을분리하여 히스타민을정량하였다.
48
시간동종수동피부아나필락시(PCA)-Kawabata
등15의 방법에따라실험하였다.
즉anti-DNP IgE 100
함유한생리식염수
50 _
생쥐의등의털을제거한부위에피하주사하여감작시킨 다음
48
시간 후에 꼬리 정맥에DNP-HSA 1 mg
과evans blue 16 mg
을포함한생리식염수를주사하여 항원항체 반응을야기시켰다. anti-DNP IgE
로감작시킨비만세포를DNP- HSA
로 탈감작시키기1
시간 전에 생리식염수로 조제한LLAE (0.001-1 mg/g)
를경구투여 하고30
분후에 치사시켰다. Evans blue
로염색된피부부위를잘라1 M-KOH 1 m/
를가하고5%
C0
2incubator
에서 하룻밤동안방치하여 피부조직을용해시킨 다음0.6 M
인산과 아세톤(5:13)
의혼액9 m/
를가하여 진탕 추출한후Katayama
등16석 방법에 따라620
뼈에서 색소량을 정량하였다.
혼!쥐복강비만세포의분리
-Kanemoto
등17ᅵ의방법에 따라 분리하였다.
즉흰쥐를에테르로마취시킨후실온에서Tyrode buffer B (137 mM NaCl, 12 mM NaHC03, 2.7 mM KC1, 0.3 mM NaH
2P 04,
1mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 5.6 mM dextrose,
0
.
1% bovine serum albumin)
약2 0m
/를복강 내에주입하고90
초간복벽을가볍게마사지하였다.
복벽중앙선을주의 깊게 절개하고pasteur pipette
으로복강세척액을채취하고원심분리(150Xg, 10
분)하여상징액을분리 제거한후비만세포부유액을Tyrode buffer B
에재부유시켰다.
세포부유액 중비만세포는Yurt
동181의방법으로 정제하였다.
즉Tyrode buffer B 1 m
/에 재부유시킨비만세포부유액을22.5% metrizamide 2 m
/에가하 여원심분리(400 Xg, 15
분)
하였다.
완충액과metrizamide
의접 촉면에남아있는세포는수집하여 제거하고Tyrode buffer B 1 m
/에재부유시켰다.
고순도의 복강비만세포를 얻기위하여 이 과정을반복하였다.
히스타민의정량
-
세포배양액및혈청중에있는히스타민은Shore
등19>의방법에따라 정량하였다.
즉에펜돌프튜브에시 료500|ji
를 취하여0.1 M HC1 450
피와60%
과염소산 용액50
10/를 혼합한후 원심분리(
4 0 0x g, 20
분)
하였다.
그상징액800 |i
/를취해5 M NaOH
용액500 pi,
증류수3 ml, w-butanol 10 m/
및NaCl 1.2
혼합한시험관에넣고진탕후원심분리(500Xg,
1 0분•)
하였다. butanol
층8 취해0.1 M HCI 3 ml, w-heptane
1 0m ®
가하여진탕후원심분리(500xg,
1 0&)하였 다.
여기에서얻어진수층2 1 M NaOH
용액400|oZ
와1% o-phthaldialdehyde
용액100 m
/를가하고37°C
수욕상에서3
분 간반응시킨다음3 M HC1
용액200
峰 가하여혼합하고2
분 동안방치한다음^x=353 nm, ^ ^ =
4 3 8 1 1 1 1 1에서상대형광강도 를측정하여 정량하였다.
세포내
cAMP
측정-Peachell
등20>의방법에따라실험하였 다.
즉, Tyrode buffer A
에부유시킨사람비만세포(5X10
5cells/
m
/)에Tyrode buffer A
로조제한LLAE (1 mg/m
/)를기하고5%
C02 incubator
로37°C
에서 배양하였다.
산성화 에탄올(
8 6% ethanol 0.9 m i: 1 M HCI = 99 : 1
)을가하고 혼합하여 반응을 정지시킨후 액체질소에서 동결시켰다.
이시료를녹여서 혼합 한후원심분리(400Xg, 4°C, 5
분)하여 침전물을제거하고상징 액0.9 m
/를 취해 감압 건조시켰다.
이건조 시료중의cAMP
함량은assay buffer 200
^에 용해시킨후cAMP
정량k itl
:사 용하여 측정하였다.
히스타민의유리억제율
-
히스타민의 유리 억제율은다음식 에의하여구하였다.
히스타민의 유리 억제율
(%) = (A-B)x 100/A
A: LLAE
를가하지 않았을때의히스타민의 양B: LLA E*
가하였을때의히스타민의양통계학적 분석 _실험 결과는
mean±S.E
■로표시하였으며Student's t-test
에의해유의성을검정하며p<0.05
인결과를얻 었을때유의성이 있는것으로하였다.
/.
Pharm . Soc. Korea결 과
Compound 48/80
에의해 유도된 아나필락시 반응에 대한LLAE
의효과ᅳ즉시형 과민반응에 대한LLAE
의효과를검토 하기 위하여 비면역학적자극물질인compound 48/80i:
사용하 여전신성아나필락시를유도하였다. 치사§ ■은compound 48/80
(0.008 m^g, 체중)fr 생쥐에투여한후 1시간동안관찰하여결
정하였다.
Table I
에서와같이 생리 식염수200
여를투여한대조군은
100%
치시율i: 나타내었다. 그러나compound 48/80
을 투여하기1
시간 전에LLAE (0.001-1 mg/g,
체중) 및DSCG
(
0.
0 0 1 - 1mg/g,
체중)를투여한후치사율을관찰한결과농도의Table I - Effects of LLAE on compound 48/80-induced systemic anaphylaxis.
Dose (mg/g)
Compound 48/80 (0.008 mg/g)
Mortality (%)
None (saline) +
1 0 0LLAE 0.001 + 100
0.01 + 60
0.1 + 30
1 + 0
1 - 0
DSCG 0.001 + 100
0.01 + 80
0.1 + 40
1 + 0
1 - 0
Groups of mice (n=10/group) were intraperitoneally pretreated with saline (200 ji/) or drugs. Drugs were given at various doses
1 hr before the compound 48/80 injection.
The compound 48/80 solution was intraperitoneally given to the group of mice.
Mortality (%) within 1 hr following compound 48/80 injection was represented as the number of dead mice x
1 0 0/total number of experimental mice.
Table II - Time-dependent effects of LLAE on induced systemic anaphylaxis.
compound 48/80-
Dose (mg/g)
Compound 48/80 (0.008 mg/g)
Mortality(%) 5 min after 10 min after
None (saline) +
1 0 0 1 0 0LLAE 1 +
040
1
-
0 0DSCG 1 +
060
1
-
0 0Groups of mice (n=10/group) were intraperitoneally pretreated with saline (200 |j/) or drugs. Drugs (1 mg/g) were given at 5 min and 10 min after compound 48/80 injection.
The compound 48/80 solution was intraperitoneally given to the group of mice.
Mortality (%) within 1 hr following compound 48/80 injection was represented as the number of dead mice x
1 0 0/total number of experimental mice.
존적으로치사율이 감소하였으며, 특히 1 m^g의농도에서는치
사율이 0%이었다. 시간의존 실험으로 compound 48/80을투여
하고 5분및 10& 후에 LLAE (1 mg/g, 체중) 및 DSCG (1 mg/
g, 체중)을투여한결과 Table II에서와같이 5분후에 LLAE 및
DSCG1:투여한군은 0%의치사율을나타내었으나 10분후에
투여한군에서는치사율이 LLAE는 40%, DSCG^r 60%이었다.
아나필락시 억제율은 LLAE와 DSCG가 비슷한효과를 나타내
었다.
이러한결과는 LLAE의전신적투여에 의해다양한형태의 아
나필락시 반응이 조절될수있음을시사하고 있다.
혈청 중히스타민유리에 미치는
LLAE
의효과- LLAE
의투여에의해 전신성아1+필락시가억제되므로혈청중히스타민 양
을측정하여
LLAE
의효과를 검토하였다.Compound 48/80
을 투여하기1
시간전에LLAE
및DSCG
를투여하고치사율" 실험이끝난후심장에서 채혈하여 혈청을분리한다음 히스타민 양 을측정하였다.
Table
III에서와같이LLAE
및DSCG
에의한혈청중히스타민의 유리는
compound 48/80
에의해유도된아나필 락시반응과유사한양상으로억제되었으며,특히 1 m^g의농도에서 유의성 있는억제 효과를나타내었다. 이는
LLAE
가히스타민등화학적 매개물질의 유리를 억제한결과로시료된다.
수동피부아나필락시
(PCA)
에미치는LLAE
의효과-PCA
에미치는
LLAE
의영향을검토하기위하여DNP-HSA
와evans
blue
의혼합액을투여하기1
시간 전에LLAE (0.001-1 mg/g)
및DSCG (0.001-1 mg/g)
를경구투여하였다.Table IV
에서와같이수동피부아나필락시 빈응은
LLAE
및DSCG
에의해농도 의 존적으로 억제되었으며, 특히 0 . 1mg/g
및 1mg/g
의농도에서유의성 있는억제효과를나타내었다. 수 동 피부아나될락시의 억
제율은
DSCG
의경우가더우수하였다.비만세포로부터 히스타민유리에미치는
LLAE
의효과 - 비만Table III - Effects of LLAE on compound 48/80-induced serum histamine release.
Dose (mg/g)
Amount of histamine (|ig/m/)
Inhibition (%)
None (saline) 0.105 ±0.022
-LLAE 0.01 0.103 ±0.016 1.9
0 . 1
0.074 ±0.008 29.5
1
0.028 ±0.004* 73.3*
None (saline) 0.178 ±0.018
-DSCG 0.01 0.151 ±0.020 15.2
0 . 1
0.136 ±0.002 23.6
1
0.053 ±0.004* 70.2*
Groups of mice (n=10/group) were intraperitoneally pretreated with saline (200 [d) or drugs. Drugs were given at various doses 1 hr before the compound 48/80 injection. Each datum represents the mean
土S.E. of three independent experiments. *p<0.05 : significantly different from the saline value.
Vol. 46,No. 6,2002
408 김숙현 • 김대근 • 임종필 • 채병숙 • 신태용
Table IV -Effects of LLAE on the 48 hr PCA.
Dose (mg/g)
Amount of dye
(나g/site)
Inhibition (%)
None (saline) 5.723 ±0.503
ᅳLLAE 0.001 5.151 ±0.547
1 0 . 00 . 0 1
4.350 ±0.415 24.0
0 . 1
3.148 ±0.401* 45.0*
1
2.336 ±0.296* 59.2"
None (saline) 5.562 ±0.433 -
DSCG 0.001 5.018 ±0.380 9.8
0 . 0 1
4.973 ±0.521
1 0 . 60 . 1
1.749 ±0.271*
6 8.
6*
1
1.506 ±0.347* 72.9*
Drugs were administered orally 1 hr prior to the challenge with antigen. Each datum represents the mean
士S.E. of three independent experiments. *p<0.05 : significantly different from the saline value.
Table V - Effects of LLAE on compound 48/80-induced histamine release from RPMC.
Dose (mg/m/)
Amount of histamine Inhibition (%)
None (saline) 0.263 ±0.031 -
LLAE 0.001 0.247 ±0.025
6 . 10 . 0 1
0.203 ±0.022
2 2 . 80 . 1
0.113 ±0.018* 57..0*
1
0.045 ±0.006* 82.9*
None (saline) 1.738 ±0.162 -
DSCG 0.001 1.295 ±0.099 25.5
0 . 0 1
0.722 ±0.084* 58.5*
0 . 1
0.681 ±0.071* 60.8*
1
0.310 ±0.039* 82.2*
The cells (2 x 10
5cells/ml) were preincubated with drugs at 37°C for 10 min prior to incubation with compound 48/80. Each datum represents the mean
土S.E. of three independent experiments.
*p<0.05 : significantly different from the saline value.
세포에
compound 48/80
을처리하면세포막이 파괴되면서 세포 내의 주함유물질인히스타민이 유리된다.
흰쥐의복강 비만세포 에미치는LLAE
의효과를검토하기 위하여compound 48/80
을 투여하기10
분전에LLAE (0.001-1 mg/m/)
및DSCG (0.001-1 mg/m
/)를 처리하였다. Table V
에서와 같이LLAE
및DSCG
는 비만세포에서compound 4S/80
에의한히스타민의 유리를농도 의존적으로 억제시켰으며,LLAE
는0.1 mg/m/
및1 mg/m
/의 농도에서, DSCG
는0.01-1 mg/ml
의농도에서 유의성 있는억 제효과를나타내었다.
히스타민유리 억제율은LLAE
와DSCG
가비슷하였다.
사람비만세포의
cAMP
함량에미치는LLAE
의효과-
사람 비만세포에LLAE (1 mg/m
/)를가하고배양하였을때Table VI
에서와같이
cAMP
의증가는순간적이었으며 최고치가LLAE
을가하였을 때는
LLAE
를가하지 않았을때보다3
배정도증가하Table VI - Time-dependent effects of LLAE on cAMP level of HMC-1 cells.
LLAE treatment (mg/m/)
Incubation time (min)
cAMP content (p mol)
None (saline)
03.259 ±0.412
1 1
7.883 ±0.901*
2
4.305 ±0.552
3 3.681 ±0.418
4 3.116 ±0.524
HMC-1 cell (5 x 10
5cells/m/) were pretreated with LLAE (1 mg/
ml) at 37°C. Each datum represents the mean
土S.E. of three independent experiments. *p<0.05 : significantly different from the saline value.
였다
. LLAE
을첨가한1
분후에 정점에이르다가2
분후에는급 격히감소하였다.
이사실은CAMP
가히스타민의 유리조절인자 로서 작용하고있음을시사하고 있다.2w
고 찰
LLAE
는compound 48/80
유도전신성 아나필락시와혈청및RPMC
의히스타민유리를 현저하게 억제하였다. compound 48/
80
에의한비만세포의 자극은히스타민의 유리를일으키는신호 전달경로를활성화시킨다. compound 48/80
및다염기성화합물 들은직접적으로G-protein
을활성화시킬수 있으며,
이활성화 는benzalkonium chloride
에억제될수있다.
2 2ᅵ24)
최근의연구는 비만세포활성화동안 칼슘유입에 대한염소 채널의중요성을 강조하고있다.25)
항알레르기약물인nedocromil sodium0]
배양 점막형비만세포에서 염소채널을차단할수 있음이 밝혀져 있 으며,염소채널은비만세포로부터 화학적 매개물질의 유리에중 요한 역할을한다.26)
또한compound 48/80
은세포막의 지질이 중막의투과성을증가시키며27)
세포막의 투과성증가는비만세 포로부터 화학적매개물질의유리를위한촉발인자가될수있 다.
결국compound 48/80
은비만세포의세포질내로Ca2+
유입 을증가시켜혈관작동성아민을유리하는물질이므로전신성아 나필락시는이러한기전과관계가깊은 것으로사료되며,
신호 전달과정의 활성화 기전은compound 48/80
이직접G-protein
을활성화한다는이론이증명되고 있다. LLAE
는이러한반응에 현저한효과를나타냄으로써즉시형 알레르기 란§세 대한중요 한임상적 의의를갖는다고할수있다.
LLAE
는IgE
매개수동피부아나필락시반응을억제하였다.
FceRI
을경유하는비만세포의 자극은다양한매개물질의분비를일으키며
, 28’29)
이러한 매개물질들은즉시형또는 지연형 알레르기 빈응을유도한다
. LLAE
는피부에서 세포막의 유동성을안정화시켜 비만세포의 탈과립을조절하는작용이 있을것으로
^
누료된다.
J. Pharm . Soc. Korea
LLAE
는HMC-1 cell
에서cAMP
의양을증가시켰다. cAMP
를중가시키는약물은화학적 매개물질의 유리를억제하며,이 는adenyl cyclase
의활성화나cAPM phosphodiesterase
의억제 에기인한다.21,30'31)다수의 생약에 대하여 항알레르기 작용과cAMP
양의증가에 대한관계가연구되어 있으며,HMC-1 cell
과
RPMC
에서cAMP
는같은양상으로증가되고있다.32-34)
본연구에서 얻어진결과들은
LLAE
가비만세포매개 즉시형알레르기 반응을
DSCG
와비슷한수준으로억제시키고 있으므로비만세포매개 즉시형 알레르기 반응의 예방과치료에 사용 될수있음을시사하고있다
.
결 론
비만세포매개 알레르기 반응에미치는
LLAE
의효과를심험한결과다음과같은결론을얻었다
.
1. LLAE는 compound 48/80
에의해유도된 전신성 아나필락 시및anti-DNP IgE
로유도된국소성 아나필락시를농도의존 적으로억제하였다.
2. LLAE
는compound 48/80
에의한흰쥐의복강비만세포로 부터 히스타민의유리를농도의존적으로억제하였다.
3. LLAE
는비만세포의cAMPS]
양을최고3
배까지증가시켰다.
이러한결과로미루어 볼때
LLAE
는비만세포매개 즉시형알레르기반응을
DSCG
와비슷한수준으로억제하였으며, LLAE
의알레르기반응억제효과는세포내cAMP
함량의 증가에 의한 것으로사료된다.
감사의 말씀
본연구는우석대학교학술연구비로연구되었으며 이에 감사 드린다
.
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