Synthesis and Evalution of a Quinolone Derivative as the Fluorescent Probe for a Cupric Ion.

DOI 10.17480/psk.2018.62.3.153

구리 양이온을 탐지하기 위한 퀴놀론 형광 프로브의 합성 및 검증

이석범 · 이남걸 · 최성욱^# 충남대학교 신약전문대학원

(Received March 2, 2018; Revised April 26, 2018; Accepted April 26, 2018)

Synthesis and Evalution of a Quinolone Derivative as the Fluorescent Probe for a Cupric Ion.

Seok Beom Lee, Nam-Geol Lee, and Sungwook Choi^#

Graduate School of New Drug Discovery and Development, Chungnam National University, Daejon, Korea

Abstract — A fluorescent probe based on a quinolone scaffold was investigated as selective fluorescent copper ion probes under aqueous environment. The fluorescence intensity of probe 6 was significantly enhanced in a Cu²⁺-concentration dependent manner and it can selectively detect Cu²⁺ among various other metal cations including Zn²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, Fe³⁺, Cd²⁺ and Pb²⁺.

Keywords Probe, Quinolone, Copper, Fluorescence

서 론 (Introduction)

인체에 존재하는 금속 원소들은 효소 작용에 있어 중요한 구 성 성분으로써 생리 과정에서 직접 참여하여 산화, 환원반응을 일으키며 신진 대사와 세포 활성화에 관여한다.¹⁾

구리(Copper)는 신체 내에 세번째로 풍부하게 존재하는 금속 으로 주로 세포, 조직, 간, 뇌, 심장 등에 존재한다.²⁾그리고 구 리는 세포 내에서 에너지 생산에 필요한 4가지 주요 미네랄 중 의 하나로써 혈관벽의 탄력조성, 신경막의 보호작용, 면역유지, 멜라닌 색소형성 등의 중요한 역할을 한다.³⁾

구리는 페노옥시다아제(phenoloxidase)⁴⁾의 구성 성분으로써 철 분을 산화시켜 세포막을 통과할 수 있게 하고, 시토크롬 산화효 소의 일부분으로 구리의 결핍증상은 드문 편이지만 심장질환, 성 장장애, 빈혈증, 백혈구의 감소, 뼈의 손실 같은 증세가 나타나 며 또한 프리온 질병⁵⁾, 루게릭병⁶⁾과 연관이 있다. 유전적 결함에

의한 윌슨병⁷⁾은 구리가 담즙을 통해 배설되지 않고 간, 뇌, 신장 에 축적되어 뇌를 손상시킨다고 알려져 있다. 또한, 구리는 치매 의 가장 흔히 형태인 알츠하이머병⁸⁾과 연관이 있는 아밀로이드 (Amyloid) 형성 과정에도 연관되어 있다. 알츠하이머는 베타아밀 로이드가 과도하게 응집 및 섬유화가 일어나 기억력, 사고력 및 추진력의 점진적 감퇴을 야기하는 치명적인 뇌 질환이다. 이때 베타아밀로이드 단백질이 구리 이온과 결합하게 되면, 베타아밀 로이드를 제거하는 LRP1(Low density lipoprotein receptor- related protein 1)의 기능을 막고, 축적되면서 산화 환원반응을 통해 ROS(Reactive oxygen species)를 생성하여 아밀로이드 섬 유화를 가속화한다고 알려져 있다.⁹⁾이와 같이 구리와 관련된 여 러 질병들을 고려해 볼 때 우리 몸 속의 구리 양이온을 효과적 으로 측정하여 미리 질병을 예방하는 방법을 찾아야 한다. 현재 여러 장비를 이용하여 진단이 가능하지만 비용이 많이 들고 시 간이 오래 걸리는 단점이 있다. 따라서 이러한 목적으로 본 연구 에서는 퀴놀론(Quinolone)을 기반으로 한 저분자화합물을 이용 한 형광 프로브를 고안하고 합성하였다.

실험 방법 (Experimental Methods)

시약 및 분석기기

#Corresponding Author Sungwook Choi

Graduate School of New Drug Discovery and Development, Chun- gnam National University, Daejeon, 34134, Republic of Korea Tel.: 042-821-8625 Fax.: 042-821-8927

E-mail: [email protected] Short Report종설

시약은 Aldrich, Acros, TCI 그리고 삼전화학 등의 제품을 사 용하거나 필요한 경우 합성하여 사용하였다. 본 실험에서 사용 한 용매 및 언급하지 않은 시약은 부차적인 정제과정을 거치지 않고 시판품을 이용하였다. TLC(Thin Layer Chromatography) 는 Kieselgel 60 F₂₅₄ plate(Merk)을 사용하여 합성 과정을 관찰 하였고 합성 후 화합물의 정제는 MPLC(Biotage)을 이용하였다.

모든 화합물의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR spectra는 Bruker 300 MHz spectrometer(Fourier 300, ¹H=300 MHz, ¹³C=75 MHz)로 측 정하였으며, chemical shift는 ppm(parts per million)으로 나타 내고 spectra는 내부표준물질인 TMS(tetra methyl silicone), CDCl₃, 그리고 DMSO를 참조하였다.

N-(3-Bromo-phenyl)-acetamide (1)

3-Bromo-phenylamine(4.5 g, 26.16 mmol)과 Et₃N(7.3 mL, 52.32 mmol)을 CH₂Cl₂(13 mL)에 녹인 뒤, Ac₂O(3.7 mL, 39.24 mmol)를 0^oC에서 적가하고 상온에서 5시간동안 교반하였 다. 반응액에 CH₂Cl₂와 1 M HCl을 가하고 포화 식염수로 유기 층을 씻어주었다. 유기층을 Na₂SO₄를 이용하여 건조 및 감압 농 축하였다. 별도의 정제 과정 없이 살색 고체 N-(3-bromo-phenyl)- acetamide(1, 5.2 g, 92%)을 얻었다. ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ 8.68(s, 1H), 7.78(s, 1H), 7.37(d, 1H, J=7.5 Hz), 7.07- 7.12(m, 1H), 2.14(s, 3H); ¹³C NMR(75 MHz, CDCl₃) δ 168.67, 139.28, 130.39, 127.40, 122.91, 122.71, 118.42, 24.70.

7-Bromo-2-chloro-quinoline-3-carbaldehyde (2) DMF(4.4 mL, 56.04 mmol)에 POCl₃(20.8 mL, 224.16 mmol) 를 0^oC에서 적가하고 5분간 교반한 후 N-(3-bromo-phenyl)- acetamide(1, 4 g, 18.68 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 80^oC에 서 가열 교반하고 16시간 후 상온으로 식혔다. 얼음물에 혼합물 을 넣은 후 1 M NaOH 수용액으로 중화시켜 pH 7을 맞추고 감 압여과장치를 통해 고체를 얻었다. 고체를 EtOAc로 재결정하여 상아색 고체 7-Bromo-2-chloro-quinoline-3-carbaldehyde(2, 1.8 g, 36%)을 얻었다. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ 10.37(s, 1H), 8.98(s, 1H), 8.27(s, 1H), 8.22(d, 1H, J=8.8 Hz), 7.9(dd, 1H, J=8.7 Hz); ¹³C NMR(75 MHz, DMSO-d₆) δ 189.51, 150.62, 149.38, 141.91, 132.34, 131.96, 130.42, 128.07, 127.33, 125.76.

7-Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde (3) 7-Bromo-2-chloro-quinoline-3-carbaldehyde(2, 1.5 g, 5.55 mmol) 에 70% acetic acid를 가하고 95^oC에서 14시간 동안 가열 교반 하였다. 혼합물을 상온으로 식힌 후 얼음물에 넣어주고 30분 동 안 교반하고 감압여과장치를 통해 거른 후 동결건조 시켜 살색 고체 7-Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde(3, 1.2 g, 90%)을 얻었다. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ 12.14

(s, 1H), 10.23(s, 1H), 8.47(s, 1H), 8.47(s, 1H), 7.86(d, 1H, 8.5 Hz), 7.56(d, 1H, J=1.5 Hz), 7.42 (dd, 1H, J=8.4 Hz); ¹³C NMR(75 MHz, DMSO-d₆) δ 189.91, 161.60, 142.39, 133.06, 127.60, 126.53, 126.13, 118.27, 117.70.

7-Bromo-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3- carbaldehyde (4)

7-Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde(3, 1.2 g, 4.76 mmol)을 DMF(19 mL)에 녹인 뒤, 0^oC에서 60%

sodium hydride(266 mg, 6.66 mmol)을 넣고 20분간 교반한다.

Methyl iodide(449μL, 7.14 mmol)을 적가하고 상온에서 12시간 동안 교반한다. 혼합물에 H₂O을 넣어 반응을 종결시키고 감압 여과장치를 통해 거른 후 동결건조 시켜 노란색 고체 7-Bromo- 1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde(4, 1.2 g, 97%)을 얻었다. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ 10.26(s, 1H), 8.46(s, 1H), 7.91(d, 1H, J=8.4 Hz), 7.81(d, 1H, J=1.1 Hz), 7.51 (dd, 1H, J=8.4 Hz), 3.65(s, 3H); ¹³C NMR(75 MHz, DMSO-d₆) δ 190.20, 161.11, 143.14, 141.14, 133.84, 128.52, 126.33, 125.58, 118.30, 29.77.

7-Diethylamino-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline- 3-carbaldehyde (5)

7-B romo-1-methyl -2-oxo-1,2-dihydro-q ui noli ne -3- carbaldehyde(4, 200 mg, 0.752 mmol)을 DMSO(3 mL)에 녹인 뒤, copper(I) oxide(53.8 mg, 0.376 mmol), sodium tert-butoxide (144.7 mg, 1.504 mmol), 그리고 diethylamine(233 μL, 7.52 mmol) 를 넣고 90^oC에서 60시간 동안 가열 교반한다. 혼합물을 상온으 로 식힌 후 혼합물에 H₂O을 넣어 반응을 종결시켰다. EtOAc로 추출하고 유기층을 MgSO₄를 이용하여 건조 및 감압 농축하였 다. 농축된 혼합물을 MPLC를 이용하여 정제하여 붉은색 고체 7- Diethylamino-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3- carbaldehyde(5, 58.2 mg, 30%)을 얻었다. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ 1.26(m, 6H), 3.54(q, 4H, J=7.1 Hz), 3.68(s, 3H), 6.31(s, 1H), 6.68(d, 1H, J=9.1 Hz), 7.48 (dd, 1H, J=6.8 Hz), 8.23(d, 1H, J=7.8 Hz),10.38(s, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ 189.73, 164.40, 162.23, 144.11, 142.68, 133.11, 123.25, 113.06, 112.84, 98.40, 56.20, 22.67.

7-Diethylamino-1-methyl-3-(pyridin-2-ylmethylene- hydrazonomethyl)-1H-quinolin-2-one (6)

7-Diethylamino-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3- carbaldehyde(5, 50 mg, 0.193 mmol)을 EtOH(1 mL)에 녹인 뒤, pyridin-2-ylmethylene-hydrazine(27 mg, 0.231 mmol)을 넣어주고 상온에서 8시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압 농축시킨 후

MPLC로 정제하여 붉은색 고체 7-Diethylamino-1-methyl-3- (pyridin-2-ylmethylene-hydra-zonomethyl)-1H-quinolin-2- one(6, 15 mg, 22%)을 얻었다. ¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆) δ 8.89(s, 1H), 8.7(d, 1H, J=6.3 Hz), 8.58(s, 1H), 8.49(s, 1H), 8.12(d, 1H, J=7.8 Hz), 7.93(d, 1H, J=8.5 Hz), 7.69(d, 1H, J=8.9 Hz), 7.5(dd, 1H, J=6.8 Hz), 6.78(d, 1H, J=9.1 Hz), 6.41(s, 1H), 3.63(s, 3H), 3.54(q, 4H, J=7.1 Hz), 1.19(t, 6H, J=6.9 Hz); ¹³C NMR(75 MHz, DMSO-d₆) δ 169.2, 165.7, 163.7, 152.5, 149.9, 147.1, 143.5, 138.2, 135.8, 132.9, 127.6, 123.1, 121.9, 118.1, 108.9, 107.4, 58.2, 45.1, 14.3; HRMS (EI): m/z, calcd for C₂₁H₂₃N₅O (M⁺): 361.1903; found:

361.1912.

형광 프로브 6의 형광 세기 측정

구리 양이온의 농도에 따른 프로브 6의 형광 세기를 측정하기 위해 프로브 6(1 mM, 40 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7)과 1 mM부터 5 mM까지 Cu(ClO₄)₂· 6H₂O를 acetonitrile 에 녹여서 준비한다. 당량 별로 2 μL씩 구리 용액을 프로브 6가 녹아 있는 인산완충용액(1998 μL)에 넣어주고 10분 동안 복합체 가 형성될 시간을 주었다(프로브 6의 최종농도=1 μM, 구리 이 온의 최종농도=1~5 μM).

프로브 6의 선택성을 확인하기 위해 프로브 6(1 mM, 40 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7)과 Cu(ClO₄)₂· 6H₂O,

Zn(ClO₄)₂·6H₂O, Hg(ClO₄)₂·3H₂O, Ni(ClO₄)₂·6H₂O, CoCl₂·6H₂O, FeCl₂·6 H₂O, Cd(ClO₄)₂·6H₂O, Pb(ClO₄)₂·3H₂O을 각각 acetonitrile 에 녹여 각각 5 mM 금속 용액을 준비한다. 각각의 금속 용액 2μL를 프로브 6 가 녹아 있는 인산완충용액(1998 μL)에 넣어주 고 10분 동안 복합체가 형성될 시간을 주었다(프로브 6의 최종 농도=1 μM, 금속 양이온의 최종농도=5 μM).

프로브 6와 구리 양이온 복합체의 결합 화학양론을 알아보기 위해 Job plot 실험을 수행하였다. 프로브 6(1 mM), 인산완충용 액(40 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7)과 Cu(ClO₄)₂ 5·6H₂O(1 mM)을 준비하고 인산완충용액(190 μL)에 프로브 6와 구리 양이온을 첨가하여 10분 동안 복합체가 형성될 시간을 주 었다. 구리양이온의 몰분율 범위는 0.0부터 1.0까지 조절하여 형 광 세기를 측정하였고 프로브 6와 구리 양이온의 전체농도는 50μM을 유지해야한다.

Thermo Genesis 10S UV-Vis spectrum를 이용하여 여기 (excitation)파장을 측정하였고, 얻은 파장 값을 Perkin Elmer LS55 fluorescence detector를 이용하여 형광 세기를 측정하였다.

실험결과 및 고찰 (Results and discussion)

본 연구에서 퀴놀론 유도체 화합물은 출발물질로 3-Bromo- phenylamine을 이용하여 아세틸화(acetylation) 반응을 통해 1번 화합물을 92% 수율로 얻었고 Vilsmeier-Haack¹⁰⁾반응을 통해 2

Scheme 1− Synthesis of probe 6

번 화합물을 36% 수율로 얻었다. 2번 화합물을 산화(Oxidation) 반응을 통해 3번 화합물을 90% 수율로 얻었고 3번 화합물을 메 틸화반응(Methylation)시켜 97% 수율로 4번 화합물을 얻었다. 5 번 화합물은 Buchwald-Hartwig 반응과 Ullmann 반응을 이용하 여 30%, 21% 수율로 얻었다(Table I). 마지막으로 프로브 6을 하이드라존화(hydrazonation) 반응을 통해 22% 수율로 얻었고

1H NMR과 ¹³C NMR 분석방법을 통해 합성한 화합물의 명확성 을 파악하였다.

합성한 퀴놀론 프로브 6을 이용한 수용액상의 구리 양이온 검 출을 위해 구리 양이온을 당량 별로 첨가하여 형광 측정을 한 결 과, Fig. 2와 같이 구리 양이온의 농도가 증가함에 따라 형광의 세기가 증가하는 것을 관찰하였다. 인체내의 구리 양이온과 선 택적으로 결합하는지 알아보기 위해 아연, 수은, 니켈, 코발트, 철, 카드뮴, 납과 같은 7종의 금속 양이온을 추가로 첨가하여 형 광 측정하였다. Fig. 3과 같이 수용액 상에서 프로브 6와 구리양

이온이 있을 경우가 다른 금속 양이온들이 있을 때보다 형광의 세기가 5배정도 차이가 나는 것을 볼 수 있고 다른 금속 양이온 이 복합체의 형광의 세기에 영향을 주지 않는 것을 검증하였다.

프로브 6와 구리양이온의 결합 화학양론값을 알아보기 위해 일 반적으로 사용하는 Job’s plot 실험을 시행하였다. Fig. 4와 같이 프로브 6와 구리양이온은 1:1로 결합하는 것을 알 수 있다. LOD 값은 4.3 × 10^-7 M로 측정되었고 그래프는 일정하게 증가하는 것 을 확인하였다.

결 론 (Conclusion)

현재 퀴놀론은 형광 물질 개발 연구에서 많이 이용되는 발색 단이며 의약품개발에서도 중요한 유도체로 많이 이용되고 있다.

본 연구에서 사용된 퀴놀론 유도체는 N-(3-bromo-phenyl)- acetamide을 출발 물질하여 아세틸화(acetylation) 반응, Vilsmeier- Table I− Synthesis of 7-diethylamino-1-methyl-2-oxo-1, 2-dihydro-

quinoline-3-carbaldehyde via Buchwald-Hartwig reaction and Ullmann reaction.

Entry Condition Yield

(%) 1 Et₂NH, Pd₂(dba)₃, BINAP, Cs₂CO₃, Toluene, 100 ^oC 16 h 7 2 Et₂NH, Pd₂(dba)₃, BINAP, Cs₂CO₃, Toluene, 100 ^oC 48 h 21 3 Et₂NH, CuI, Hydroxysuccinimide, NaOt-Bu, 110 ^oC 38 h 21 4 Et₂NH, Cu₂O, NaOt-Bu, DMSO, 90 ^oC, 60 h 30

Fig. 2− Fluorescence responeses of probe 6 (1 μM) toward different concentration of copper cation in a buffer solution (40 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7, λ_ex=430 nm, λ_em=482 nm).

Fig. 3− Fluorescence responeses of probe 6 (1 μM) in the presence of various metal ions (5μM Cu²⁺, Zn²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Co²⁺, Fe³⁺, Cd²⁺, Pb²⁺ in a buffer solution (40 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7, λ_ex=430 nm, λ_em=482 nm).

Fig. 4− Job’s plot for determining the stoichiometry of complex (Probe 6 – Cu²⁺). The total concentration of complex was 50μM in a buffer solution (40 mM phosphate buffer, 0.1 M NaCl, pH 7, λ_ex=430 nm, λ_em=482 nm).

Haack 반응, 산화(Oxidation) 반응 등을 통해 합성하였고 합성한 퀴놀론 유도체를 이용하여 수용액상에 존재하는 구리 양이온 존 재하에서의 특정 파장의 형광을 측정하였으며 구리 양이온에 대 한 선택성을 형광 세기 변화로 확인하였다. 구리 양이온의 농도 가 증가함에 따라 형광의 세기가 증가하는 것이 관측되었으며 이 는 구리 양이온과의 복합체 형성으로 인한 화합물의 C=N 이성 질체화(Isomerization)가 억제되어 형광의 세기가 증가한다라고 생각된다.¹¹⁾다음 실험으로 몸 속에서 구리 양이온이 아닌 다른 금속 양이온과 결합을 했을 때 형광을 낼 수 있기 때문에 선택 성이 있는지, 또는 프로브 6와 구리 양이온이 복합체를 형성하 고 다른 금속 양이온이 형광 세기에 영향을 미치는지를 알아보 려고 7종의 금속 양이온을 프로브 6에 첨가하여 형광의 세기를 측정했다. 그 결과 다른 금속들과 복합체를 형성하지 않아 형광 의 세기가 높게 나타나지 않았고, 다른 금속 양이온들이 복합체 의 형광세기에 영향을 미치지 않는 것을 검증하였다. 마지막으로 프로브 6와 구리양이온의 결합 화학양론을 측정하기 위해 Job’s plot 실험을 하였다. 최고 발광파장은 몰분율이 0.5일 때 가장 강 한 형광세기를 나타냈으며 이를 통해 프로브 6와 구리 양이온은 1:1의 비율로 결합하여 우리가 고안한 복합체를 형성하는 것을 알 수 있었다. 그러므로 합성된 프로브는 서론에서 언급한 것처 럼 금속의 양을 측정하여 질병의 정확한 진단과 효과적인 치료 에 도움을 줄 수 있을 것이다.

감사의 글 (Acknowledgement)

본 연구는 충남대학교의 학술연구비 지원을 받아 수행되었으 며 이에 감사 드립니다.

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