사랑과 열정으로 더불어 함께 하는 세상 만들기 - 율촌재단(栗村財團)

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(1)지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발 김건희. 덕성여자대학교 식품영양학과. 1. 서론 1.1. 연구의 목적 및 필요성 ●●. 세계보건기구 (WHO: World Health Organization)가 최근 비만을 ‘21세기 신종 전염병’으로 지목하면서 전 세계가 비만은 개인의 문제일 뿐만 아니라 사회적인 경향성을 갖는 질병으로 그 위협에 주목하고 있다. 선진국에서 신흥국으로 급속히 확산되는 추세이며 보건의료비 상승 등 다양한 사회·경제적 비용을 유발하고 있음. 2015년에는 전 세계 인구의 약 23.4%, 10년 후에는 비만인구가 현재보다 50% 증가 할 것으로 전망하고 있다.. Fig 1. OECD 주요국가 비만율(성별) 28. 2016년 기초연구과제 총서.

(2) ●●. 한국은 비교적 날씬한 국가군에 속하지만 과체중과 비만 비율이 상승하는 추세이며,최근 중년 남성을 중심으로 비만인구가 늘어나고 있다. 더욱이 젊은 여성들의 ‘마른비만’ 문제까지 고려해본다면 한국에서도 비만은 향후 중요한 사회적 이슈가 될 것으로 예상된다.. Fig 2. 우리나라 연령대별 비만율. ●●. 비만은 지나친 칼로리 섭취와 부적절한 칼로리 소모로 인해 일어나는 에너지 불균형 상태로, adipokine의 생산과 분비를 통하여 adipogenesis 과정으로 분화가 일어나 하며 지방세포의 크기 증가 (hypertrophy) 와 숫자 증가 (hyperplasia)로 체지방이 피하조직이나, 장간막에 축적되어 체중이 증가하게 되고 유전적, 영양적, 환경적 및 사회적 요인 등 다양한 원인들이 관여하는 복합증후군이다. 비만은 단순히 외형상의 문제뿐만 아니라 체중증가와 더불어 당뇨, 동맥경화, 심혈관질환, 고혈압, 고지혈증 등의 심각한 성인병을 유발할 확률이 높아지는 것으로 보고되고 있다.. ●●. 비만의 근본적인 예방과 치료를 위해서는 식사요법이나 운동요법이 가장 적절한 방법이나 최근에는 식욕억제제, 열 생산 촉진제, 흡수억제제 등의 약물요법과 외과적 치료가 증가하고 있다. 특히, 바쁜 현대인들의 경우 약물 치료 방법이 활성화 되어 지난 수십 년 동안 다양한 종류의 항비만제가 개발되고 있다.. ●●. 비만은 지방전구세포의 분화 및 지방생성과정에 의하여 지방세포 내 중성지방 (triglyceride, TG)의 축적으로 발생하므로 지방생성기전을 조절하는 것이 비만 치료에 효과적인 방법으로 알려져 있으며 특히, 지질을 분해하는 lipase를 저해하여 지질의 소화 및 흡수를 저해하는 pancreatic lipase 저해제에 대한 연구가 활발하다.. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 29.

(3) Fig 3. Lipase inhibitor system. ●●. Pancreatic lipase는 식품을 섭취했을 때 지방인 triacylglycerol를 2-mono acylglycerol과 fatty acid 로 가수분해하는 효소이다. 일부의 2-monoacylglyerol과 fatty acid는 소장의 점막 세포에서 흡수되어 에너지원과 인체 내 구성성분으로 사용되며 대부분은 다시 tryacyglyceol로 합성되어 체내의 지방세포에 축척되어 비만을 유발한다. 이때 지방대사의 key enzyme으로 작용하는 pancreatic lipase의 활성을 저해하면 triglyceride가 분해되지 못하고 배설되어 체내의 지방축적을 예방하여 비만을 예방할 수 있다.. ●●. 대표적인 pancreatic lipase inhibitor는 Streptomyces toxitricini로부터 유래된 lipstatin의 유도체인 tetrahydrolipstatin (orlistat)로서 구조적으로 중성지방과 비슷하여 pancreatic lipase의 활성부위와 공유결합을 형성하여 지질의 가수분해를 방해한다. 섭취된 지방의 약 30%를 저해할 정도로 효능이 우수한 것으로 알려져 있으나 orlistat는 위장장애, 과민증, 담즙분비장애, 지용성 비타민 흡수억제 등의 부작용을 지니는 것으로 알려져 있어 최근에는 부작용이 없는 천연물로부터 pancreatic lipase inhibitor 를 개발하고자하는 연구가 활발히 진행되고 있다.. 30. 2016년 기초연구과제 총서.

(4) Fig 4. Orlistat - mechanism of action. ●●. 시판되고 있는 비만 치료제들의 부작용들이 보고되면서 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 일고 있어 우수한 효능과 함께 안전성이 높은 물질의 개발이 요구되고 있다. 이에 특히 천연 유래 소재로부터 독성 및 부작용이 없는 항비만 효능 보유 소재를 발굴하기 위한 많은 노력이 집중되고 있으며, 비만 치료보다는 예방적 관점에서 일상적으로 섭취 할 수 있는 차세대 다이어트 식품소재 개발의 필요성이 강조되고 있다.. Fig 5. 시판되고 있는 pancreatic lipase inhibitor 제품 Xenical. 전문의약품. 1capsul (orlistat 120mg) 3회/day, 식이지방을 30%정도 배출. Alli. 일반의약품. 1capsul (orlistat 60mg) 3회/day, 식이지방을 25%정도 배출. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 31.

(5) ●●. 지방세포내의 지방구 (lipid droplet)는 지질의 대사 및 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 지방구 내에 주로 존재하고 있는 triglyceride의 분해와 이로 인한 glycerol의 유출은 세포 내 지방의 축척을 조절하는 중요한 기전으로 연구되고 있다. 지방전구세포인 3T3-L1은 여러 호르몬과 다양한 전사인자들에 의해 지방세포로 분화되면서 세포내 지방을 축적한다. 이러한 과정을 지방세포 분화 또는 지방세포 형성과정 (adipogenesis)이라하며 이 과정에 관여하는 중요한 인자로는 peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ)와 CCAAA T-enhancer-binding protein α (C/EBPα)가 있다. 이들 두 인자 는 분화 초기에 발현되는 각종 유전자들의 발현을 증가시키고 지방세포가 분화되는 동안 leptin과 adiponetin, glucose transporter 4와 같은 adipogenic gene들의 발현을 조절한다. 따라서, 지방세포의 분화과정을 억제하는 물질이나 adipogenic gene들의 발현을 조절하는 물질은 비만 치료제로 개발 가능하다.. ●●. 본 연구에서는 pancreatic lipase의 활성을 저해하는 물질을 탐색하기 위해 민간요법 중 항비만 효과가 있다고 알려져 있는 식용작물, 해조류, 한약재 등 천연물을 대상으로 pancreatic lipase 활성에 대한 저해효과를 확인하여 후보소재을 선정하고, 추가로 이들이 지방세포 내에서는 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 3T3-L1세포를 사용하여 지방축적억제 효능과 lipolysis 효과를 확인하고자 하였다.. 1.2. 연구 목표 ●●. 본 연구과제에서는 국내외 문헌검토를 통해 항비만 활성 소재를 탐색하고, 식품원료로 섭취근거, 국내 원료수급 여부 및 추출수율 (원가고려)이 확보된 식물자원을 후보소재로 선정하여 pancreatic lipase에 대한 저해활성, 3T3-L1세포를 이용하여 지방축적 억제 효능을 나타내는 우수 기능성 소재를 발굴하고 이를 비만 예방 혹은 치료 기능이 있는 차세대 다이어트 식품소재 개발을 위한 기초 연구를 수행하고자 하였다.. ●●. 32. 2016년 기초연구과제 총서.

(6) 2. 실험방법. ●●. 후보소재탐색 국내외 문헌검토를 통해 항비만 활성 소재를 탐색하고, 식품원료로 섭취근거, 국내 원료수급 여부 및 추출수율 (원가고려)이 확보된 식물자원을 후보소재로 선정하여 주정 및 열수를 첨가하여 70℃에서 3시간 동안 추출하여 동결건조 한 뒤 연구에 사용하였다. Pancreatic lipase 활성 저해 후보군으로 선정된 우수시료는 최적추출조건 및 지표성분 구축을 통한 기능성 소재 표준화 연구를 수행하고자 하였다.. ●●. Pancreatic lipase 효소 활성 저해능 분석 Lipase는 주로 췌장에서 분비되어 TG를 glycerol과 fatty acid로 가수분해하는 효소로서 지방소화효소인 pancreatic lipase의 활성 저해능은 시료가 보유한 항비만 활성을 예측하기에 매우 유용한 시험법이다. 본 연구에서는 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 시료가 보유한 lipase 효소 활성 저해능을 Eom 등이 행한 방법을 조금 변형하여 수행하였다. Pancreatic lipase 효소 활성 저해능 분석은 Eom 등이 행한 방법을 변형하여 실시하였다. 먼저 enzyme buffer (10 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 6.8) 에 porcine pancreatic lipase를 용해한 효소용액 30 μL에 Tris buffer (100 mM tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7) 850 μL와 후보시료를 100 μL씩 첨가하여 혼합한 후 37℃에서 15분동안 반응시켰다. 이후 substrate solution (10 mM of p-nitrophenylbutyrate in dimethyl formamide)를 20 μL 첨가하여. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 33.

(7) 37℃에서 30분동안 반응시킨 후 405 nm에서 ELISA reader (Spectramax M2, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 orlistat을 사용했으며, 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.. Lipase 저해활성 (%) = 100×[1-(A-B)/C] A: 시료를 첨가한 흡광도 B: 시료를 첨가하지 않은 흡광도 C: 시료를 첨가하지 않은 흡광도. Fig 6. Method for the detection of lipase activity using p-nitrophenol butyrate as substrate.. Fig 7. Calibration curve for p-nitrophenol dodecanate (PNPD). 34. 2016년 기초연구과제 총서.

(8) Fig 8. M ethod for the detection of lipase activity using p-nitrophenol dodecanate as substrate. ●●. 후보물질의 lipase 활성 저해 농도 확인 후보물질의 lipase 활성 저해 농도는 20μM의 기질에 후보물질을 농도별(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml)로 첨가하여 위의 효소 활성 측정방법을 사용하여 확인하였다.. ●●. 총 페놀 함량 측정 (Total phenol contents) Polyphenol이 많이 함유된 소재가 pancreatic lipase 저해 활성이 높다는 선행연구 결과들을 토대로 총 페놀 함량을 측정하는 시험을 진행하였다. 후보물질 21종의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법에 따라 각 추출물을 70 μL에 Folin-Ciocalteu reagent 70 μL을 가하고 혼합한 다음 실온에서 3분간 정치한 후 2% Na2CO3 70 μL을 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 gallic acid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀 함량을 산출하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 제시하였다.. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 35.

(9) ●●. 총 플라보노이드 함량 측정 (Total flavonoid contents) Polyphenol이 많이 함유된 소재가 pancreatic lipase 저해 활성이 높다는 연구결과들을 토대로 총 플라보노이드 함량을 측정하는 시험을 진행하였다. 총 플라보노이드 함량은 Quettier 방법을 이용하여 측정하였고, 각각의 시료용액 50 μL에 MeOH에 녹인 2% aluminium chloride 150 μL을 가하고 혼합한 다음 실온에서 15분간 반응시킨 다음 430 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며, 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 플라보노이드 함량을 산출하였다. 실험은 3회 반복 수행하여 평균값을 제시하였다.. ●●. 총 페놀 및 플라보노이드 함량과 pancreatic lipase 저해활성간의 상관관계 모든 실험에서 얻어진 결과는 SPSS Software Package (Statistical Package for the Social Science ver 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였으며, 서열상관분석법 (Spearman’s rank correlation analysis)을 이용하여 총 페놀 및 플라보노이드 함량과 pancreatic lipase 저해활성간의 유의적 관계를 분석하였다.. ●●. 세포 배양 및 시료 처리 항비만 활성을 세포실험계에서 분석하기 위해 항비만 활성 분석에 사용되는 대표적인 cell model system 인 3T3-L1 preadipocyte를 American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA)로부터 구입하여 10% fetal bovine serum. (FBS) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM배지에서 배양함.. 3T3-L1 지방전구세포를 DMEM 에 10% calf serum, antibiotics (penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 units/ml)를 첨가하고 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 confluence 상태가 되도록 배양하였다. 2일 더 배양한 후 (day 0), 10 μg/ml insulin, 0.25 μM dexamethasone, 0.5 mM 3-isobutyl-1methylxanthine [IBMX (SIGMA): MDI]이 포함된 DMEM으로 교환하여 2일간 배양하였다 (day 2). 지방세포로의 분화를 촉진하기 위해 10 μg/ml insulin이 포함된 DMEM으로 교환하여 3일간 배양하였다 (day 5). 이 후 지방세포의 완전분화를 위해 DMEM 에 10% FBS, antibiotics를 첨가하여 3일간 더 배양하였다(day 8). 0.5 μM 3-isobutyl-1- methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone (DEX), 10 μg/ml의 insulin (이하 MDI)를 처리하여 adipogenesis를 유도하고 후보소재들의 항비만 활성을 분석하였다.. ●●. 세포 독성 유무 분석 항비만 활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인함과 동시에 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도 설정을 위해 MTT-formazan assay를 수행하였다. 1 × 103 cell을 96-well. 36. 2016년 기초연구과제 총서.

(10) tissue culture plate에 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 48/72시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 MTT 시약이 든 배지로 교체하여 4시간 동안 반응시킨 후 multiplate reader 를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.. ●●. Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석 3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화는 상기의 MDI를 처리하여 유도하였다. 48-well tissue culture plate에 well 당 2×104 개의 세포를 분주하고 2일 후 10% FBS가 든배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도 별로 처리하고 2, 3일 간격으로 총 3회 insulin과 시료를 처리하였다. 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 Oil Red O staining을 통해 분석하였다. 지방세포 분화 및 시료 처리가 완료된 세포를 1× phosphate buffered saline (PBS)로 씻어준 다음 10% formalin으로 고정하고 Oil Red O staining solution을 처리한 후 30분간 염색하였다. 염색 완료 후 100% isopropanol을 사용하여 염색된 지방을 추출하고 multi-plate reader를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정하였다.. ●●. 통계 분석 모든 시료의 분석은 3번 반복 실행하여 평균과 표준편차를 산출하였다. 실험에서 얻어진 결과는 SPSS Software Package (Statistical Package for the Social Science ver 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 처리군 간 차이의 유의성을 p<0.05 수준에서 검정하였다. Pancreatic lipase inhibition activity, 총 페놀 함량, 총 플라보노이드 함량에 대한 상관관계를 알아보기 위해 Pearson’s correlation coefficient 분석을 시행하였다. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 37.

(11) 3. 결과 및 고찰 3.1. 후보소재 30종 선정 및 추출수율 (%) 확인 국내외 문헌검토를 통해 항비만 활성 후보소재를 탐색하고, 식품원료로 섭취근거, 국내 원료수급 여부 및 추출수율 (원가고려)이 확보된 식물자원을 선정하여 추출 (주정/열수, 70℃, 3시간)하여 추출수율 (%) 을 계산하였다 (Table 1). 추출수율은 삼채 (32.5%)와 치자 (30.2%)가 가장 높은 것으로 확인되었으며 기능성소재의 경제적 측면에서 매우 중요하기 때문에 추후 우수 항비만 효과 소재 선정시 함께 고려하고자 하였다.. Table 1. Extraction yield (%) of 30 medicinal plants Rank. Medicinal plant picture. Extraction yield (%). 1. Allium hookeri. 32.5. 2. Gardenia jasminoides Ellis. 30.2. Scutellaria baicalensis Georgi /. 3. 38. Scientific name. Scutellariae Radix. 2016년 기초연구과제 총서. 29.2.

(12) Rank. 4. 5. Medicinal plant picture. Scientific name. Extraction yield (%). Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell. Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Steud.. 23.9. 21.1. 6. Arctium lappa L.. 17.7. 7. Curcuma aromatica Salisb.. 15.6. 8. Syzygium aromaticum (L.). 15.5. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 39.

(13) Rank. 40. Medicinal plant picture. Scientific name. Extraction yield (%). 9. Astragalus membranaceus Bunge. 13.9. 10. Atractylodes macrocephala Koidzumi. 13.0. 11. Schizandra chinensis Baillon. 12.7. 12. Nelumbo nucifera. 10.9. 13. Agrimonia pilosa Ledebour. 10.3. 2016년 기초연구과제 총서.

(14) Rank. 14. 15. Medicinal plant picture. Scientific name. Extraction yield (%). Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring. Platycodon grandiflorum (Jacq) Nakai / Platycodi Radix. 10.3. 10.1. 16. Foeniculum vulgare Mill.. 9.6. 17. Rubus coreanus Miquel. 8.5. 18. Mentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 8.0. 41.

(15) Rank. 42. Medicinal plant picture. Scientific name. Extraction yield (%). 19. Citrus unshiu S.Marcov.. 7.0. 20. Zingiber officinale Roscoe. 5.7. 21. Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf. 4.9. 22. Elshotzia ciliata Hylander.. 4.8. 23. Lindera obtusiloba Blume. 4.7. 2016년 기초연구과제 총서.

(16) Rank. 24. 25. Medicinal plant picture. Scientific name. Extraction yield (%). Glycyrrhiza uralensis Fisch. Conyza canadensis Erigeron canadensis L.. 4.1. 3.6. 26. Morus alba L.. 3.6. 27. Zizyphus jujuba var. inermis. 3.3. 28. Cinnamomum aromaticum. 2.3. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 43.

(17) Rank. Medicinal plant picture. Scientific name. Extraction yield (%). 29. Polyporus umbellatus Fries. 1.9. 30. Poria cocos Wolf. 1.1. 3.2. 30종 후보소재의 pancreatic 활성 저해능 평가 후보소재 30종의 Pancreatic lipase 활성 저해능을 평가한 결과 (Table 2), 91 ~ 17%의 저해능을 나타내었으며, 이중 율무 (Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf)와 권백 (Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring)이 90% 이상의 저해능을 보여 가장 우수한 효과를 나타내었고, 50% 이상의 활성을 가진 우수소재 8종을 선정하여 농도별 활성 저해능을 추가적으로 평가하였다. 본 연구에 사용된 소재 중 황기 (Astragalus membranaceus Bunge)를 사용한 다른 연구결과, -11.0±2.2% (Zheng et al., 2010), 7.4±1.4% (Roh & Jung, 2012) 등으로 24.6±5.3%의 저해능을 보인 본 연구결과와 비교적 차이가 나는 수치였다. 이는 동일한 식물 소재이지만 추출방법, pancreatic 활성 저해능 평가 실험방법 등의 차이가 결과에도 상당한 영향이 있다는 것을 알 수 있었다. 또한, 연구소재 중에는 한약재나 민간에서 약용으로 사용되는 식물들 이외에도 우리가 평소에 섭취하는 콩과 식물이나 과일 등을 선택한 경우도 있어, pancreatic lipase 저해를 통한 항비만 연구 소재 선택의 폭이 매우 넓은 것으로 나타났다 (Sreerama et al., 2012; Sosnowska et al, 2015).. 44. 2016년 기초연구과제 총서.

(18) Table 2. Inhibition of pancreatic lipase by ethanolic extract of 30 medicinal plants Rank. Scientific name. Lipase inhibition (%) Mean. S.D. 1. Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf. 91.2. 6.6. 2. Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring. 90.4. 4.8. 3. Cinnamomum aromaticum. 81.1. 3.8. 4. Morus alba L.. 69.3. 8.2. 5. Foeniculum vulgare Mill.. 63.7. 6.5. 6. Elshotzia ciliata Hylander.. 59.6. 3.4. 7. Atractylodes macrocephala Koidzumi. 58.9. 5.5. 8. Rubus coreanus Miquel. 57.1. 7.7. 9. Curcuma aromatica Salisb.. 56.2. 4.2. 10. Poria cocos Wolf. 50.2. 0.1. 11. Agrimonia pilosa Ledebour. 47.7. 5.8. 12. Lindera obtusiloba Blume. 47.7. 4.7. 13. Polyporus umbellatus Fries. 47.0. 6.7. 14. Zizyphus jujuba var. inermis. 46.3. 1.0. 15. Gardenia jasminoides Ellis. 45.8. 4.2. 16. Zingiber officinale Roscoe. 45.6. 1.8. 17. Conyza canadensis Erigeron canadensis L.. 44.7. 6.5. 18. Nelumbo nucifera. 43.3. 7.2. 19. Syzygium aromaticum (L.). 42.4. 2.3. 20. Platycodon grandiflorum (Jacq) Nakai / Platycodi Radix. 39.8. 5.6. 21. Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell. 39.1. 5.7. 22. Schizandra chinensis Baillon. 38.7. 2.7. 23. Glycyrrhiza uralensis Fisch. 35.3. 2.7. 24. Citrus unshiu S.Marcov.. 32.2. 0.3. 25. Rehmannia glutinosa (Gaertn.) Libosch. ex Steud.. 31.2. 6.5. 26. Mentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud. 28.0. 8.9. 27. Scutellaria baicalensis Georgi / Scutellariae Radix. 25.7. 7.6. 28. Astragalus membranaceus Bunge. 24.6. 5.3. 29. Allium hookeri. 19.6. 7.8. 30. Arctium lappa L.. 17.0. 5.5. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 45.

(19) 3.3. 우수후보물질(8종)의 pancreatic lipase 활성 저해능 평가 Pancreatic lipase는 triglyceride의 ester 결합을 가수분해하는 효소로서 glycerol과 fatty acid를 생선한다. 분해된 glycerol과 fatty acid는 소장의 점막세포에서 흡수되어 에너지원으로 사용되며, 남은 지방은 monoacylglycerol 경로를 통해 다시 triacylglycerol로 합성되어 체내에 축적된다 (Kim et al., 1984; Williams & Goldfine, 1985; Park & Lee, 1985). Pancreatic lipase 활성을 억제하면 소장점막을 통한 지방흡수가 저해되고, 결과적으로 체내에 축적되는 지방량이 감소되어 비만을 예방할 수 있다 (Kim et al., 2003).. 후보물질의 lipase 활성 저해 농도는 20μM의 기질에 후보물질을 농도별 (62.5, 125, 250, 500, 1000 ㎍/ml)로 첨가하여 위의 효소 활성 측정방법을 사용하여 확인하였다. 그 결과 (Fig 9, Fig 10), 후보소재 30종의 스크리닝 결과와 유사한 권백 (Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring) > 계피 (Cinnamomum. aromaticum ) > 율무 (Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf) > 상지 (Morus alba L.) > 회향 (Foeniculum vulgare Mill.) > 향유 (Elshotzia ciliata Hylander.)＞ 백출 (Atractylodes macrocephala Koidzumi) ＞ 복분자 (Rubus coreanus Miquel) 순으로 높은 저해활성을 나타내었다. Fig 9에 나타났듯이 율무와 계피는 농도의존적인 저해활성의 증가를 보였고, 권백과 상지는 저농도를 제외한 250 ~ 500 ㎍/ml 의 농도범위에서 증가양상을 나타났다. 하지만, Fig 10의 네 가지 소재는 500 ~ 1000 ㎍/ml에서 급격한 증가를 보이기 전의 낮은 농도에서는 변화가 거의 없거나 오히려 감소하는 경향을 보였다.. 46. 2016년 기초연구과제 총서.

(20) (A). (B). (C). (D). Fig 9. Porcine pancreatic lipase inhibitory activities of Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf (A) and Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring (B), Cinnamomum aromaticum (C), and Morus alba L. (D).. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 47.

(21) (A). (B). (C). (D). Fig 10. P orcine pancreatic lipase inhibitory activities of Foeniculum vulgare Mill. (A) and Elshotzia ciliata Hylander. (B), Atractylodes macrocephala Koidzumi (C), and Rubus coreanus Miquel (D). 48. 2016년 기초연구과제 총서.

(22) 3.4. 총 페놀 및 플라보노이드 함량 분석 후보소재 30종의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 분석한 결과 (Table 3), 총 페놀은 황금 (Scutellaria. baicalensis Georgi)에, 그리고 총 플라보노이드는 감초 (Glycyrrhiza uralensis Fisch)에 가장 많은 함량이 있는 것으로 나타났다. 총 페놀 및 플라보노이드 함량과 pancreatic lipase 저해활성간의 유의적 관계를 서열상관분석법 (Spearman’s rank correlation analysis)을 이용하여 분석한 결과, 높은 유의적 관계는 관찰되지 않았다. 폴리페놀 그룹 중, Flavonoid, hydrozycinnamic acid, hydroxybenzoic acid, 그리고 lignan과 pancreatic lipase 저해능 사이의 연관성을 본 Buchholz와 Melzig의 review 연구에 따르면, phenolic hydroxyl group의 수와 위치, 중합도 (degree of polymerization), 소화 중 글루코실화 반응의 유무에 따라 lipase 저해능에 영향을 끼친다고 하였다. 따라서, 본연구에서 사용된 식물소재들에 포함된 폴리페놀과 pancreatic lipase 저해능간의 구체적인 연관성을 알기 위한, 보다 심도있는 추가적 연구가 필요할 것으로 사료된다.. Table 3. T otal phenolic contents (TPC) and total flavonoid contents (TFC) by ethanolic extract of 30 medicinal plants Rank 1 2 3 4. TPC (GAE µg/mL). Scientific name. Scutellaria baicalensis. 350.2. Georgi. Syzygium aromaticum (L.) Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell. Scientific name. Glycyrrhiza uralensis Fisch. TFC (QE µg/mL) 210.9. 257.3 Nelumbo nucifera 183.0 182.8. 5. Rubus coreanus Miquel. 180.8. 6. Lindera obtusiloba Blume. 175.7. 7. Nelumbo nucifera. 168.5. 8. Agrimonia pilosa Ledebour. 149.2. 9. Cinnamomum aromaticum. 142.1. Gardenia jasminoides Ellis. Syzygium aromaticum (L.). Scutellaria baicalensis Georgi. Agrimonia pilosa Ledebour. Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring. Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell. Curcuma aromatica Salisb.. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 54.7 40.8 27.7 27.7 17.2 14.9 11.5 10.5. 49.

(23) Rank 10 11. Scientific name. Glycyrrhiza uralensis Fisch Mentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud. Zizyphus jujuba var.. TPC (GAE µg/mL) 107.7. Scientific name. Elshotzia ciliata Hylander.. 95.8 Foeniculum vulgare Mill.. TFC (QE µg/mL) 8.7 8.0. Mentha arvensis. inermis. 92.3 Linne var. piperascens Malinvaud. 5.9. 13. Elshotzia ciliata Hylander.. 87.2 Rubus coreanus Miquel. 5.2. 14. Zingiber officinale Roscoe. 78.3 Citrus unshiu S.Marcov.. 4.7. 15. Arctium lappa L.. 70.0. 12. 16. Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring. Cinnamomum aromaticum. 4.4. 60.3 Morus alba L.. 4.1. 17. Curcuma aromatica Salisb.. 49.0 Arctium lappa L.. 2.4. 18. Gardenia jasminoides Ellis. 43.0 Allium hookeri. 2.0. 19. Morus alba L.. 41.9 Poria cocos Wolf. 1.8. Rehmannia glutinosa 20. Foeniculum vulgare Mill.. 33.3 (Gaertn.) Libosch. ex Steud.. 21. Poria cocos Wolf. 29.6. 22. Polyporus umbellatus Fries. 17.6. 23. Atractylodes macrocephala Koidzumi. 13.5. Rehmannia glutinosa 24. (Gaertn.) Libosch. ex Steud.. 25. Citrus unshiu S.Marcov.. 26 27. 50. Schizandra chinensis Baillon. Allium hookeri. 2016년 기초연구과제 총서. 11.7. Polyporus umbellatus Fries. Lindera obtusiloba Blume. Zizyphus jujuba var. inermis. Zingiber officinale Roscoe. Atractylodes macrocephala Koidzumi Schizandra chinensis 3.9 Baillon Coix lacryma-jobi L. var. ND mayuen Stapf. 5.7. 1.7. 1.6 1.3 1.2. 0.9. 0.0 ND ND.

(24) Rank 28. TPC (GAE µg/mL). Scientific name. Platycodon grandiflorum. ND. (Jacq) Nakai. 29. Lindera obtusiloba Blume. 30. Conyza canadensis Erigeron canadensis L.. Scientific name. TFC (QE µg/mL). Platycodon grandiflorum (Jacq) Nakai. Astragalus membranaceus Bunge Conyza canadensis ND Erigeron canadensis L. ND. ND ND ND. TPC = Total phenolics contents was expressed as µg/mL gallic acid equivalent. TFC = Total flavonoids contents was expressed as µg/mL quercetin equivalent. ND = Not detected.. 3.5. 세포 독성 유무 분석 후보소재 30종 중에서 pancreatic lipase 저해능이 50% 이상이었던 10종을 선택하여 3T3-L1 preadipocyte에서의 cell viability를 측정한 결과 (Fig 11), 권백 (Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring) 과 복령 (Poria cocos Wolf)을 제외한 sample들에서는 대부분의 농도에서 시간이 지남에 따라 cytotoxicty 가 증가하는 양상을 관찰할 수 있었다. 또한, 회향 (Foeniculum vulgare Mill.)을 제외한 모든 소재에서 200 µg/mL 이하의 농도에서 80%이상의 생존율이 확인되어 추후 Oil Red O staining assay에서 소재 처리 농도를 200 µg/mL 이하로 설정하였다.. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 51.

(25) (A). (B). (C). 52. 2016년 기초연구과제 총서.

(26) (D). (E). (F). 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 53.

(27) (G). (H). (I). 54. 2016년 기초연구과제 총서.

(28) (J). Fig 11. E ffects of Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf (A), Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring (B), Cinnamomum aromaticum (C), and Morus alba L. (D), Foeniculum vulgare Mill. (E), Elshotzia ciliata Hylander. (F), Atractylodes macrocephala Koidzumi (G), Rubus coreanus Miquel (H), Curcuma aromatica Salisb. (I) and Poria cocos Wolf (J) on cell viability of 3T3-L1 preadipocytes.. 3.6. Oil Red O staining을 통한 지방세포 분화 및 TG 생성 저해능 분석 비만 연구에 많이 사용되는 3T3-L1 preadipocyte은 적절한 생육조건에서 배양하면 aidpose cell 으로 분화하는 성질을 가지고 있다 (Green et al., 1974; Green et al., 1976). 이 과정에서 지방합성 및 triglyceride 대사에 관여하는 효소활성도의 급격한 증가가 관찰되며, 지방합성 및 지방분해 유도 호르몬에 대한 감수성 및 지방세포 특이 유전자의 발현량이 증가하는 것으로 알려져 있다. (Coleman et al., 1978; Kim et al., 2003). 현대사회에서 비만인구가 급증하면서 항비만 소재 개발을 위한 많은 연구가 진행되고 있는 가운데, 우리가 많이 섭취하는 고추장 (Ahn et al., 2006), 호박 (Kim et al., 2003) 그리고 발효시킨 삼정환 (Song et al., 2013) 등 다양한 소재에서 긍정적인 효과가 나타났다.. 후보소재 30종 중에서 pancreatic lipase 저해능이 50% 이상이었던 10종을 선택하여 Oil Red O staining을 통한 3T3-L1 preadipocyte의 분화 및 triglyceride 생성 저해능을 관찰한 결과 (Fig 12), 율무 (Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf), 권백 (Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring), 계피 (Cinnamomum aromaticum), 백출 (Atractylodes macrocephala Koidzumi), 강황 (Curcuma aromatica. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 55.

(29) Salisb.), 그리고 복령 (Poria cocos Wolf)에서 농도에 따른 분화 억제율이 높아졌다. 반면에, 상지 (Morus. alba L.), 향유 (Elshotzia ciliata Hylander.), 복분자 (Rubus coreanus Miquel)에서는 오히려 분화정도가 증가하는 것으로 나타났다. 보다 명확한 항비만 효과를 관찰하기 위해서는 저해능이 관찰된 소재들을 이용하여 지방세포 합성시의 지방 특이 유전자 발현량의 변화를 관찰하는 심도있는 기전연구가 필요할 것으로 사료된다.. (A). 56. 2016년 기초연구과제 총서.

(30) (B). (C). 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 57.

(31) (D). (E). 58. 2016년 기초연구과제 총서.

(32) (F). (G). 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 59.

(33) (H). (I). 60. 2016년 기초연구과제 총서.

(34) (J). Fig 12. E ffects of Coix lacryma-jobi L. var. mayuen Stapf (A), Selaginella tamariscina (Beauv.) Spring (B), Cinnamomum aromaticum (C), and Morus alba L. (D), Foeniculum vulgare Mill. (E), Elshotzia ciliata Hylander. (F), Atractylodes macrocephala Koidzumi (G), Rubus coreanus Miquel (H), Curcuma aromatica Salisb. (I) and Poria cocos Wolf (J) extracts on lipid accumulation during adipogenesis of 3T3-L1 preadipocytes.. 4. 요약 본 연구에서는 국내외 문헌검토를 통해 항비만 활성 소재를 탐색하고, 식품원료로 섭취근거, 국내 원료수급 여부 및 추출수율(원가고려)이 확보된 식용 또는 약용식물을 대상으로 pancreatic lipase에 대한 저해활성, 3T3-L1세포를 이용하여 지방축적 억제 효능을 관찰하였다. 천연유래 소재들은 자연에서 쉽게 접할 수 있고, 특정 지역의 환경에 높은 적응성과 생물학적 다양성을 가지고 있으며 항암, 항염제 등의 신약 개발과 건강기능식품의 소재의 자원으로써 응용되고 있을 만큼 적용 분야도 다양하다. 본 연구 결과, 율무(91.2%), 권백(90.4%), 계피(81.1%), 상지(69.3%) 등 10종의 자생식물에서 50% 이상의 저해활성이 나타났다. 또한, 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 61.

(35) 총 페놀 및 플라보노이드 함량과의 통계적 분석 결과, 높은 유의적 관계는 관찰되지 않았으나, 향후 각 자생식물의 활성물질을 추적, 분리하여 효능물질에 대한 연구가 필요하다. Oil Red O staining을 통한 triglyceride 생성 저해능 측정 결과, 눈에 띄는 저해활성이 관찰되진 않았지만, 연구에 사용된 소재가 추출물 상태임을 고려할 때 분획추출 및 단일물질로 정제할 경우 더욱 우수한 효능의 화합물이 존재할 가능성이 있으므로 추가적인 연구가 필요하다. 또한, 명확한 항비만 효과를 관찰하기 위해서는 지방세포 합성시의 지방 특이 유전자 발현량의 변화를 관찰하는 등의 심도있는 기전연구가 필요할 것으로 사료된다. 우리 나라의 다양한 식물을 이용한 건강기능성 소재로써의 연구가 많이 진행되고 있지만, 여전히 연구되지 않은 식물소재들이 남아있다. 본 연구결과를 통해 자생식물을 이용한 항비만 기능성 소재로의 개발에 기초자료로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.. 5. 연구성과 ●●. 포스터 발표 - 2건 - 2016 IUFoST - 18th World Congress of Food Science and Technology “Screening for anti-pancreatic lipase properties f 21 traditional medicinal plants” - 2016 KoSFoST - 한국식품과학회 국제학술대회 “Pancreatic lipase inhibition and antioxidant activities of Cinnamomum aromaticum etract”. ●●. 논문 투고 - 1건 - 한국식품영양과학회지 투고 완료 “국내 자생 식물추출물의 pancreatic lipase 저해활성과 총 페놀 및 플라보노이드 함량 분석을 통한 항비만 효과 탐색”. 62. 2016년 기초연구과제 총서.

(36) 6. 참고문헌 Ahn I. S., Do M. S., Kim S. O., Jung H. S., Kim Y. I., Kim H. J., Park K. Y. (2006) Antiobesity effect of Kochujang (Korean fermented red pepper paste) extract in 3T3-L1 adipocytes.. J Med Food 9:15-21. Buchholz T., Melzig M. F. (2015) Polyphenolic compounds as pancreatic lipase inhibitors. Planta. Med 81:771-783. Coleman R. A., Reed B. C., Mackall J. C., Student A. K., Lane M. D., Bell R. M. (1978) Selective changes in microsomal enzymes of triglycerol, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine biosynthesis during differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. J Biol Chem 253:7256-7261. Eom S. H., Lee M. S., Lee E. W., Kim Y. M., Kim T. H. (2013) Pancreatic lipase inhibitory activity of phlorotannins isolated from Eisenia bicyclis. Phytother Res 27:148-151. Florence C. R. F., Pascale M. G., Jacques J. N. (1992) Cysteine as an inhibitor of enzymatic browning. 2 Kinetic srudies. J Agric Food Chem 40:2108-2113. Green H., Kehinde O. (1974) An estabilished preadipose cell line and its differentiation in culture. Cell 3:127-133. Green H., Kehinde O. (1976) An estabilished preadipose cell line and its differentiation in culture Ⅱ. Cell 5:19-27. Kim C. J., Cheigh H. S., Byun S. M. (1984) A simple and modified photometric method for measuring lipase activity. Korean J Food Sci Technol 16:251-253. Kim S. G., An G. H., Yoon S. W., Lee Y. C., Ha S. D. (2003) A study on dietary supplement to reduce obesity by the mechanism of decresing lipid and carbohydrate abosorption. Korean J. Food Sci Technol 35(3):519-526. Park J. H., Lee Y. C. (1985) Studies on the immobilization of lipase by absorption method. Korean. J Food Sci Technol 17:75-80. Quettier D. C., Gressier B., Vasseur J., Dine T., Brunet C., Luyckx M. C., Cayin J. C., Bailleul F., Trotin F. (2000) Phenolic compounds and antioxidant activities of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) hulls and flour. J. Ethnopharmacol 72(1-2):35-42. Roh C., Jung U. (2012) Screening of crude plant extracts with anti-obesity activity. Int J Mol Sci 13(2):1710-1719.. 지방분해효소(pancreatic lipase) 작용을 억제하는 차세대 다이어트 식품소재 개발. 63.

(37) Song M. Y., Bose S., Kim H. J. (2013) Effect of probiotics-fermented Samjunghwan on differentiation in 3T3-L1 preadipocytes. J Korean Soc Food Sci Nutr 42(1):1-7. Sosnowska D., Podsedek A., Redzynia M., Zyzelewicz D. (2015) Effects of Fruit Extracts on Pancreatic Lipase Activity in Lipid Emulsions. Plant Foods Hum Nutr 70(3):344-350. Sreerama Y. N., Takahashi Y., Yamaki K. (2012) Phenolix anitoxidants in some Vigna species of legumes and their distinct inhibitory effects on α-glucosidase and pancreatic lipase activities.. J Food Sci 77(9):C927-C933. Williams J. A., Goldfine I. D. (1985) The insuline-pancreatic acinar axis. Diabetes 34:980-985. Zheng C. D., Duan Y. Q., Gao J. M., Ruan Z. G. (2010) Screening for anti-lipase properties of 37 traditional Chinese medicinal herbs. J Chin Med Assoc 73(6):319-324.. 64. 2016년 기초연구과제 총서.

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