248 서 론
우리나라 질병 및 사망 원인이 생활습관, 식습관의 변 화로 인하여 만성퇴행성 질환으로 변화되어 가고 있는 데, 특히 암으로 인한 사망률 증가가 큰 문제가 되고 있 다. 암 발생은 생체 내 정상세포가 발암물질, 바이러스 감염, 유전적 요인, 돌연변이 등에 의하여 유발되며, 약
75∼80%가 환경적 요인에 의한 것으로 그 중 약 30∼
40%가 식이와 관련이 있다고 보고되고 있다.1∼3) 우리의 식단에서 큰 비중을 차지했던 김치는 서구식단의 영향 으로 그 섭취의 비중이 줄어들었지만, 국제적으로는 세 계 5대 건강식품의 하나로 선정되며 많은 관심을 불러일 으키고 있다.4,5) 우리나라 전통식품인 김치는 채소 저장 발효식품으로 주재료인 십자화과 채소 배추와 여러 녹 황색 채소류, 발효과정에서 생기는 유산균과 암예방 영
Balb/c 마우스에서 키토산올리고당 첨가 김치의 항종양 효과
부산대학교 식품영양학과 및 김치연구소, 1동주대학 외식조리
김보경․이숙희․김소희1․박건영
Antitumor Effects of Chitosanoligossacharide Added Kimchi in Vivo
Boh-Kyung Kim, Sook-Hee Rhee, So-Hee Kim1 and Kun-Young Park
Department of Food Science and Nutrition, and Kimchi Research Institute, Pusan National University, Busan 609-735, 1Department of Culinary Art, Dongju College, Busan 603-715, Korea
Chitosanoligosaccharide (COS) was added to kimchi in order to increase antitumor and detoxification in sarcoma-180 transplanted Balb/c mouse. One % COS added kimchi in seasonings (COS-SK (1%)), 0.5% COS added kimchi in seasonings (COS-SK (0.5%)), 1% COS added kimchi in brine (COS-BK (1%)) and standardized kimchi (SK) were prepared. Kimchis were fermented at 15oC to reach optimum pH of 4.3. The antitumor activities of the COS added kimchi on Balb/c mice transplanted with the sarcoma-180 cell were investigated. The activities of liver enzyme, glutathione S-transferase (GST) and contents of glutathione (GSH) were determined from sarcoma-180 cell injected mice that were treated with methanol extracts from SK, COS-SK (1%), COS-SK (0.5%), COS-BK (1%) and COS itself. The tumor weight of SK, COS, COS-SK (1%), COS-SK (0.5%), COS-BK (1%) were 4.6 g, 3.3 g, 1.2 g, 1.8 g and 2.4 g, respectively. The activities of GST and the contents of GSH decreased by the transplantation of the sarcoma-180 cell were recovered considerably by the treatment of the methanol extract from COS-SK (1%), COS-SK (0.5%), COS-BK (1%) in the order. In conclusion, 1% COS added kimchi in seasonings exerted the strongest anticancer effect among the kimchi samples by inhibiting the tumor formation and controlling the activity of GST and contents of glutathione which were associated with the detoxification mechanism. These results suggest that COS added kimchi have a protective effect on the sarcoma-180 cell-induced hepatotoxicity in mice. (Cancer Prev Res 11, 248-255, 2006)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Key Words: Kimchi, Chitosanoligosaccharide, Sarcoma-180, Antitumor
책임저자：박건영, ꂕ 609-735, 부산시 금정구 장전동 30 부산대학교 식품영양학과
Tel: 051-510-2839, Fax: 051-514-3138 E-mail: [email protected]
접수일：2006년 8월 4일, 게재승인일：2006년 9월 8일
Correspondence to：Kun-Young Park
Departmeny of Food Science and Nutrition, Pusan National University, 30 Jangjeon-dong, Geumjeong-gu, Busan 609-735, Korea
Tel: +82-51-510-2839, Fax: +82-51-514-3138 E-mail: [email protected]
양소로 알려진 vitamin C, β-carotene, flavonoid, chlorophyll 등에 의하여 항산화, 항돌연변이, 항암, 항노화 등의 기 능성을 가진다.6∼10)
키토산 및 키토산올리고당은 다당류에 속하는 물질인 키틴질을 원재료로 하는 물질로서 게, 새우 등 갑각류의 껍데기, 메뚜기, 번데기 등 곤충류의 껍질, 대합, 굴 등의 패류, 오징어의 뼈, 균류의 세포벽 등의 생물체에 천연적 으로 존재하는 성분이다. 이 키틴질은 하등동물 껍질에 20∼50%, 하등식물 세포벽에 45% 존재한다. 자연계에 폭넓게 분포하는 풍부한 biomass로서 식품보존제로서의 이용도 보고되고 있다.11,12)
키토산의 다양한 기능성에 대한 연구는 많이 보고되 고 있는데, 항암작용, 면역강화작용, 식물병원성진균에 대한 식물의 저항성 유도 작용, 유산균 증식 촉진 작용, 무독성, 무공해성, 생분해성, 제산작용, 궤양억제작용, 혈청 콜레스테롤과 중성지질량을 감소시키는 약리 작 용, 장내 유용세균의 발육 촉진, 면역 부활 작용 등이 있
다.13∼19) 키토산과 키토산올리고당은 sarcoma-180 cell 고
형암에 대한 항종양활성이 있음이 보고되고 있다.20,21) 김 치 제조 시 키토산 혹은 키토산과 다른 보존제를 함께 첨가하였을 때 숙성 및 보존성 연장 효과에 대한 보고가
있고,22∼27) 선행연구에서 저장성 증진 효과가 있는 키토
산 및 키토산올리고당을 부재료로 첨가한 김치는 Ames test와 SOS chromotest에 의해 MNNG에 대한 in vitro 항돌 연변이 실험에서 높은 암예방 효과를 나타냈고 MTT as- say에 의해 높은 항암효과를 보였다. 특히 키토산올리고 당을 첨가한 김치군은 마우스 말초혈의 소핵유발 억제 실험에서 모두 높은 암예방 기능성을 보였다.28) 따라서 본 연구에서는 표준화 김치와 키토산올리고당 을 첨가한 김치를 정상 마우스 및 sarcoma-180 세포를 이 식한 마우스에 투여한 후 적출한 마우스의 간을 이용하 여 간 효소계에 미치는 영향과 혈액을 이용한 간독성 예 방 효과를 확인하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 재료
배추는 결구 배추로 포합성인 가락 신1호, 고춧가루는 영양 태양초, 젓갈은 청정멸치액젓((주)대상), 소금은 천 일염((주)우일염업)을 사용하였으며, 이외 무, 파, 마늘, 생강은 부산 소재 부전시장에서 구입하였다. 설탕은 정 제당을 사용하였으며, 키토산은 (주)MSC의 제품을 이용 하였다.
2. 김치제조 및 시료의 추출
배추김치는 10% 소금물을 만들어 2등분한 배추를 10 시간 염절임한 후 씻어서 제조하였다. 김치의 재료 배합 비는 절인 배추 100에 대하여 고춧가루 3.5, 마늘 1.4, 생 강 0.6, 멸치액젓 2.2, 설탕 1, 무 13, 파 2였으며 최종염도 는 2.5%로 맞추었다. 이때 첨가된 키토산올리고당은 절 인 배추 100에 대하여 1% 첨가하였다. 김치의 재료 배합 비는 표준화 김치(standardized kimchi: SK)에 키토산올리 고당 1%를 양념에 첨가한 김치(1% chitosanoligosaccharide added kimchi in seasonings: COS-SK (1%)), 0.5% 양념에 첨 가한 김치(0.5% chitosanoligosaccharide added kimchi in sea- sonings: COS-SK (0.5%)) 절일 때 첨가한 김치(1% chitosa- noligosaccharide added kimchi in brine: COS-BK (1%))로 제 조하였다. 김치는 모두 15oC에서 발효하였고, 적숙기(pH 4.2∼4.3)에 동결건조한 다음 마쇄하여 분말화 한 후 20 배 (w/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 2회 반복하 여 여과한 후 회전식 진공 농축기로 농축하여 메탄올 추 출물을 얻었다. 이들 추출물들은 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 희석하여 실험에 사용하였다.
3. 실험동물
본 실험에 사용한 동물은 웅성 Balb/c mouse (한국화학 연구소, 대전)로, 체중이 25 g 전후의 것을 사용하였으며, 사료는 표준 사료로 사육하였다. 사육시 물과 사료는 충 분한 양을 공급하였고, 동물실험실은 온도 22±1oC, 습 도 55±5%를 유지하였으며, 12시간 간격으로 light-dark cycle을 유지하였다.
4. Sarcoma-180 cell 종양세포
Balb/c mouse의 복강 내에 1주일 간격으로 계대배양하 여 보존하고 있는 sarcoma-180 세포를 실험용 종양세포 로 사용하였다. 즉 실험동물의 복강 내에 1주일간 배양 된 sarcoma-180 세포를 복수와 함께 취하고 phosphate buffered saline (PBS)와 함께 원심분리(1,2000 rpm, 10 min) 하여 종양세포를 분리하였다. 분리된 세포를 다시 PBS에 부유시켜 재차 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1.0×
106 cells/ml가 되도록 종양세포 부유액을 만들어 1 ml씩 복강주사하여 이식 보존하면서 실험에 사용하였다.
5. 시료의 조제
시료는 멸균된 PBS를 사용하여 조제하였으며 투여량 은 마우스 kg당 1 mg으로 하고, 대조군은 멸균 PBS만 투 여하였으며, 투여하지 않을 때는 냉장고에 보관하면서
사용하였다.
6. 세포독성실험(Viability Test)
항암효과를 나타낸 시료의 직접적인 세포 독성 작용 의 유무를 알아보기 위해서 dye exclusion method를 이용 하여 in vitro에서 viability test를 행하였다. 1회용 24well plate에 조제한 종양세포 부유액 1 ml (2.0×105 cells)와 최 종 농도 20% HFCS (heat inactivated fetal calf serum: Gibco Lab., USA)의 RPMI 1640 배지 1 ml를 가하였다. 여기에 100μl의 시표를 넣어서 37oC, 5% CO2 incubator에서 24시 간 배양하였다. 배양 후 세포 50μl를 0.2% trypan blue 용 액 50μl와 잘 섞어 hemocytometer를 사용하여 전체의 세 포수와 염색되어진 세포(non-viable cell) 및 염색되지 않은 세포(viable cell)의 수를 측정한 다음, 시료를 넣지 않은 대조 세포군과 비교하여 viability 비율을 계산하였다.
Viable cell (%)=
Total number of viable cells per ml of aliquot ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ × 100
Total number of cells per ml of aliquot
7. 고형암 성장 저지 실험
실험동물을 각 군당 6마리씩으로 하여 실험실에 1주 일 간격으로 계대 보관 중인 종양세포부유액 0.2 ml (6×
106 cells/mouse)씩을 실험동물의 왼쪽 서혜부(left groin)에 피하 이식한 후 24시간 후부터 20일간 매일 1회씩 시료 용액을 복강으로 투여하였다. 종양세포 이식 26일째 되 는 날 치사시켜 생성된 고형암을 적출하고 그 무게를 측 정한 후 다음 식에 따라 종양성장 저지 백분율(tumor growth inhibition ratio, I.R.: %)을 계산하였다.29∼33)
Cw-Tw
IR (%) = ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ × 100 Cw
Cw : 대조군의 평균 종양무게 Tw : 처리군의 평균 종양무게
8. 시료를 투여한 마우스 비장의 Natural Killer (NK) 세포 활성측정
1) 마우스 비장 림프구의 분리: 비장과 혈액에서 발견
되는 cytotoxic lymphocyte로 비특이적 면역계에 관여하며 주된 역할로 미생물, 바이러스, 종양세포 등을 살해하는 성격을 가지는 Natural Killer (NK) cell의 활성을 살펴보기
위하여 항종양실험을 한 마우스의 비장을 무균적으로 적출하였다. Balb/c 마우스의 비장을 clean bench 내에서 무균적으로 적출하여 penicillin (100 U/ml), steptomycine (100μg/ml)을 함유한 5 ml의 RPMI 1640 배지로 3회 세척 한 후 곱게 마쇄하였다. 이 세포부유액을 70μm nylon mesh로 여과하고 원심분리하여 림프구를 모은 다음 배 지에 부유시킨 후 histopaque-1077을 이용하여 원심분리 (500×g, 30 min, 18oC)하여 림프구를 분리하였다.
2) Effector cell의 준비: 위의 방법으로 준비된 세포를 10% FCS, 2 mM L-glutamine, penicillin (100 U/ml), strepto- mycin (100μg/ml)을 함유한 RPMI 1640 배지에 재현탁시 키고, 이것을 37oC, CO2 incubator에서 1∼2시간 배양시켜 서 세포가 배양플라스크(60 mm dish)에 부착되도록 하였 다. 비부착성 natural killer (NK) cell의 원심분리를 통해서 수집하여 배양배지에 재현탁시킨 다음 적정 세포수를 계수하여 사용하였다.
3) NK 세포의 활성 측정: NK cell은 활성측정은 MTT assay를 이용하였다. Yac-1 mouse lyphoma cell을 target cell 로 사용하였는데, Yac-1 세포는 10% FCS, 2 mM L-glutamine, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100μg/ml)을 함유한 RPMI 1640 배지에 5×104 cell/ml의 밀도가 되도록 희석 한 후, 각 well에 50μl씩을 96well flate-bottomed microtire plate에 첨가하였다. 이것을 37oC, CO2 incubator 안에서 3 일간 배양시킨 후 MTT (5 mg/ml)용액을 10μl씩 각 well 에 가한 다음 37oC에서 4시간 배양하였다. 여기에 SDS (10% in 0.02 N HCl)을 25μl 첨가하여 실온에서 30분간 발색시킨 후에 540 nm에서 OD를 측정하였다.34,35) Cell cytolysis percentage는 아래 공식에 의해서 계산하였다.
Cell cytolysis (%)=
OD of non-lysed target cells-OD of effector cell
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ × 100 OD of target cell alone
9. 효소활성 측정
1) 효소원의 조제: Mouse를 치사시킨 후 4oC 이하의 생 리 식염수로 간을 관류하여 간 내에 남아 있는 혈액을 제거한 후 간장을 적출하였다. 간 조직 1 g당 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4)를 가하여 빙냉하에서 glass teflon homogenizer로 마쇄하였다. 이 마쇄액을 homo- genate 분획으로 하였으며, 이것을 13,000 rpm에서 10분 간 원심분리하여 핵 및 미마쇄세포부분을 제거하고 다 시 105,000×g에서 1시간 동안 초원심분리하여 얻은 상
등액을 cytosol 분획으로 하여 glutathione S-transferase 활성 측정에 이용하였다.
2) Glutathione S-transferase의 활성 측정: Habig 등34) 의 방법에 준하여 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.5) 중에 0.04 M reduced glutathione 75μl와 효소액을 0.1 ml 넣고 blank에 20% trichloroacetic acid 0.5 ml를 가해 효 소를 실활시킨 다음 25oC에서 5분간 반응시켰다. Blank 와 시료 각각에 0.12 M 1-chloro-2,4-dinitrobenzene 25μl를 가하여 25oC에서 2분간 반응시키고 시료에 20% trichloro- acetic acid를 가해 반응을 완결시킨 후 원심분리하여 얻 은 상등액을 340 nm에서 흡광도를 측정하여 1-chloro-2,4- dinitrobenzene의 mole 흡광계수 9.6 mM-1 cm-1을 이용하 여 활성도를 산정하였다. 효소 활성의 단위는 1분간 mg protein이 생성한 2,4-di-nitrobenzene-glutathione의 nmole수 로 표시하였다.
3) Protein 정량: 단백질의 함량은 Lowry 등35)의 방법에 준하여 bovine serum albumin (Sigma, USA)을 표준품으로 하여 측정하였다.
4) 조직 중의 glutathione의 함량측정: Ellamin의 방법36) 에 준하여 효소원(400∼600μg 단백질)에 제단백시약으 로 4% sulfosalicylic acid를 가하여 단백질을 제거한 상등액 에 disulfide reagent (0.1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0) 에 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)를 녹임) 2.7 ml를 가 하여 생성되는 청색을 412 nm에서 측정하고 표준곡선 에 의하여 산정하였으며, 단위는 조직 1 g당 glutathione μmole로 표시하였다.
10. 통계 분석
대조군과 각 시료로부터 얻은 실험자료로부터 ANOVA 를 구한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 통계 분석하였다.37)
결 과
1. 각 장기의 중량 변화
In vitro에서 시료가 sarcoma-180 세포에 직접적인 독성 을 나타내지 않는 시료의 농도를 찾아 마우스에 투여하 기 위해 viability test를 한 결과 모든 시료가 2.0 mg/ml까 지 독성이 없었으므로 2.0 mg/kg의 시료를 마우스 복강 에 투여하여 고형암 성장저지효과를 살펴보았다. 체중 은 모든 군들에 있어서 전체적인 변화가 거의 없이 유사 했다. 종양세포만 이식한 대조군은 정상 마우스보다 면 역계에 관계하는 비장과 해독작용을 하는 간의 중량비 가 크게 증가하였고 SK 투여군은 이들의 중량비가 종양 세포 이식군과 비슷하였으나 COS 첨가 김치군들은 대조 군에 비하여 비장의 중량비가 감소하였다. 그 외의 장기 들인 심장과 신장은 군 간에 큰 차이가 발견되지 않았다 (Table 1).
2. 고형암 성장 저지 효과
마우스에서의 항종양 효과를 살펴보기 위해 sarcoma- 180 cell을 서혜부에 이식한 후 김치 sample들을 매일 1회
Table 1. Effects of methanol extract from various kinds of chitosanoligosaccharide added kimchi sample on the spleen, liver, heart, kidney and body weight of Balb/c mouse
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Body wt. Liver/body Spleen/body Kidney/body Heart/body
Sample (g) wt. (%) wt. (%) wt. (%) wt. (%)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
Control 26.43±0.91 6.56±0.25 0.35±0.01 1.92±0.01 0.61±0.04
S180+PBS 24.13±1.50 6.63±0.30 0.94±0.02 1.45±0.05 0.66±0.03
S180+SK1) 24.43±1.55 6.55±0.10 0.75±0.04 1.68±0.03 0.63±0.03
S180+COS2) 24.83±0.96 6.56±0.15 0.73±0.03 1.80±0.07 0.64±0.02
S180+COS-SK (1%)3) 24.53±1.07 7.47±0.35 0.55±0.02 1.89±0.05 0.60±0.02 S180+COS-SK (0.5%)4) 24.30±1.25 7.41±0.36 0.63±0.04 1.97±0.04 0.64±0.03
S180+COS-BK (1%)5) 25.73±1.07 6.09±0.06 0.49±0.03 1.85±0.07 0.60±0.03 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
1)SK: Standardized kimchi, 2)COS: Chitosanoligosaccharide itself (kimchi 1/20), 3)COS-SK (1%): 1% Chitosanoligosaccharide ad- ded kimchi in seasonings, 4)COS-SK (0.5%): 0.5% Chitosanoligosaccharide added kimchi in seasonings, 5)COS-BK (1%): 1%
Chitosanoligosaccharide added kimchi in brine.
7-days sarcoma-180 ascites cells were s.c. transplanted into the left groin of inbredstrain. 2.0 mg/kg of methanol extract from various kinds of kimchi, chitosanoligosacchairde powder or the equal volume of phosphate buffered saline (control) was I.P.
injected once a day for 20 days from 24 hr following transplantation. All mice were sacrificed at 5 weeks following the trans- plantation, and liver, spleen, kidney and heart were measured.
씩 20일간 복강 투여한 실험에서의 종양의 무게를 측정 해 본 결과 대조군의 종양은 4.4 g이었고 이에 반해 COS- SK (1%), COS-SK (0.5%), COS-BK (1%)를 투여한 종양 무 게는 각각 1.2 g, 1.8 g, 2.4 g으로 크기가 줄어든 것을 알 수 있었다. COS를 투여한 군은 3.3 g으로 메탄올 추출 물 수율을 고려하였을 때의 동량의 COS 그 자체를 투여
하였을 때 COS 그 자체 투여군보다 COS 첨가 김치 투여 군의 종양형성 억제효과가 더 우수한 것을 살펴볼 수 있 었다(Table 2).
3. 자연살해(NK) 세포의 면역활성 증강효과
Yac-1 cell을 target cell로 하여 effector cell (NK cell)을 1：50으로 seeding하여 활성을 살펴보았을 때 S-180+PBS 군은 45.29%인데 반해 COS 첨가 김치군들의 활성은 70.36∼78.04%로 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며 특 히 COS-SK (1%)의 활성이 가장 높은 것을 살펴 볼 수 있 었다. 키토산올리고당만을 첨가한 군 COS 또한 64.43%
으로 활성이 아주 높은 것을 살펴볼 수 있었다(Fig. 1).
4. 마우스 간내의 Glutathione S-transferase (GST) 활성 변화
GST 활성은 종양 세포를 이식하지 않은 정상군이 601.74 nmol/mg of protein/min으로 가장 높았으며 종양 세 포를 이식한 대조군은 382.05 nmol/mg of protein/min로 가 장 낮았다. SK는 421.78 nmol/mg of protein/min이었으며 COS 첨가 김치군의 값은 COS-SK (1%), COS-SK (0.5%), COS-BK (1%) 각각 599.87, 582.10, 580.73 nmol/mg of pro- tein/min로 거의 정상군에 가깝게 회복되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
Table 2. Antitumor activity of methanol extracts from various kinds of chitosanoligosccharide added kimchi in tumor bear- ing Balb/c mice with sarcoma-180 cell
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Sample Tumor weight Inhibition rate
(g) (%)
ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
S-180+PBS 4.4±1.4a -
+SK1) 4.6±0.6abc 17
+COS2) 3.3±0.5ab 25
+COS-SK (1%)3) 1.2±0.6d 74 +COS-SK (0.5%)4) 1.8±0.2cd 59 +COS-BK (1%)5) 2.4±1.2bcd 46 ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ
a∼dMeans with the different letters are significantly different (p＜0.05) by Duncan’s multiple range test.
1)SK: Standardized kimchi, 2)COS: Chitosanoligosaccharide it- self, 3)COS-SK (1%): 1% Chitosanoligosaccharide added kim- chi in seasonings, 4)COS-SK (0.5%): 0.5% Chitosanoligosac- charide added kimchi in seasonings, 5)COS-BK (1%): 1% Chi- tosanoligosaccharide added kimchi in brine.
Fig. 1. The effect of chitosanoligosaccharide added kimchi samples and chitosanoligosaccharide on natural killer (NK) cell activity in mice splenic lymphocytes.
SK: Standardized kimchi, COS: Chitosanoligosaccharide itself, COS-SK (1%): 1% Chitosanoliogsaccharide added kimchi in seasonings, COS-SK (0.5 %): 0.5% Chitosanoliogsaccharide added kimchi in seasonings, COS-BK (1%): 1% Chitosanoliog- saccharide added kimchi in brine.
a∼cMeans with the different letters are significantly different (p＜
0.05) by Duncan’s multiple range test.
Fig. 2. The effect of chitosanoligosaccharide added kimchi samples on hepatic glutathione S-transferase activity.
SK: Standardized kimchi, COS: Chitosanoligosaccharide itself, COS-SK (1%): 1% Chitosanoliogsaccharide added kimchi in seasonings, COS-SK (0.5%): 0.5% Chitosanoliogsaccharide added kimchi in seasonings, COS-BK (1%): 1% Chitosanoliog- saccharide added kimchi in brine.
a∼eMeans with the different letters are significantly different (p＜
0.05) by Duncan’s multiple range test.
5. 마우스 간내의 Glutathione 함량변화
정상인 대조군의 glutathione 함량은 0.486 (umol/g of tissue)이고 S-180+PBS군은 0.247 (umol/g of tissue)인데 반 해 COS 첨가 김치군들의 함량은 COS-SK (1%), COS-SK (0.5%), COS-BK (1%)순으로 각각 0.452, 0.421, 0.353 (umol/g of tissue)으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3).
고 찰
김치는 발효 과정 중 유산균이 생성되며 항암 영양소 로 알려진 vitamin C, β-carotene, flavonoid, chlorophyll 등이 풍부하여 항돌연변이, 항암, 면역증강효과 등이 있다고 보고되고 있고,6∼10) 김치의 암예방 효과를 증진시키기 위해서는 재료의 선택, 발효방법 및 부재료의 첨가 등이 있고, 김치 제조 시 부재료로 키토산을 첨가하면 숙성 및 보존성 연장 효과에 대한 보고가 있고,22∼27) 키토산의 항암효과38)와 키토산올리고당의 암예방 효과가 있는 것 으로 보고되고 있다.39) 키토산의 첨가방법을 달리하여 키토산을 배추김치에 첨가했을 때 김치의 저장성 증진 및 암예방 기능성 증진에 미치는 영향을 연구하였다.
마우스에서의 항종양 효과를 살펴보기 위해 sarcoma- 180 cell을 서혜부에 이식한 후 김치 sample들을 매일 1회
씩 20일간 복강 투여한 실험에서의 종양의 무게를 측정 해 본 결과 대조군의 종양과 비교해 COS 첨가한 김치군 의 종양 무게가 줄어든 것을 알 수 있었다. 이는 COS는 종양세포 형성을 억제한다는 보고20,21)와 또한 김치 추출 물을 sarcoma-180 cell을 이식한 마우스에 처리했을 때 종 양의 무게가 감소하였다는 보고40)가 있으므로 종양형성 을 억제하는 김치에 COS을 첨가하였을 때 상승효과에 의해 COS 첨가 김치가 SK보다 종양형성 억제효과가 높 은 것으로 생각되어 진다. 그리고 메탄올 추출물 수율을 고려하였을 때의 동량 COS 그 자체를 투여하였을 때 COS 그 자체 투여군보다 COS 첨가 김치 투여군의 종양 형성 억제효과가 더 우수한 것을 살펴볼 수 있었다.
비장과 혈액에서 발견되는 cytotoxic lymphocyte로 비특 이적 면역계에 관여하며 주된 역할로 미생물, 바이러스, 종양세포 등을 살해하는 성격을 가지는 natural killer (NK) cell의 활성을 살펴보기 위하여 항종양실험을 한 마 우스의 비장을 무균적으로 적출하였다. Yac-1 cell을 target cell로 하여 effector cell (NK cell)을 1：50으로 seeding하여 활성을 살펴보았을 때 S-180+PBS군에 비해 COS 첨가 김치군들의 활성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며 특히 COS-SK (1%)의 활성이 가장 높은 것을 살펴 볼 수 있었다. 또한 COS 그 자체의 활성도 아주 높은 것을 살 펴볼 수 있었다. 즉 S-180 투여군과 비교해서 COS 첨가 김치군들의 세포파괴 활성이 증가하였다. 이는 김치가 S-180+PBS투여군에 비해 NK cell의 세포파괴 활성이 증 가하였다는 보고와도 일치했다.41)
간에서 일어나는 대사 효소계의 phase II 단계는 내인 성 물질이나 외부에서 투여된 독성물질을 포합하거나 수용성 물질로 전환시켜 체외로 배출시킴으로써 이 물 질을 제거하는 작용이 있는데 그 중 GST는 환원된 gluta- thione을 이용하여 체내 독성물질와 과산화물질의 전이, 배설에 관여하는 효소이다.32) 항발암성 효소로 알려진 glutathione S-transferase는 대부분의 생체 전 조직에 함유 되어 있으며 특히 간에서 최고의 함량을 나타내고 체내 중요한 역할 중의 하나는 친전자성 발암물질의 활성 대 사 산물을 요중으로 배설시킴으로써 해독작용을 한다.43) GST 활성은 종양 세포를 이식하지 않은 정상군이 가장 높았으며 종양 세포를 이식한 대조군은 가장 낮았다. 이 에 비해 COS 첨가 김치군의 값은 거의 정상군에 가깝게 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 암으로 인한 비정상적인 상태에서 키토산올리고당 첨가 김치는 GST 의 활성이 증가되어 독성물질을 대사시켜 체외로 배출 시키는 것으로 생각된다.
Glutathione은 세포의 protective system으로 sulfhydryl rad- Fig. 3. The effect of chitosanoligosaccharide added kimchi
samples on hepatic glutathione content.
SK: Standardized kimchi, COS: Chitosanoligosaccharide itself, COS-SK (1%): 1% Chitosanoliogsaccharide added kimchi in seasonings, COS-SK (0.5%): 0.5% Chitosanoliogsaccharide added kimchi in seasonings, COS-BK (1%): 1% Chitosanoliog- saccharide added kimchi in brine.
a∼eMeans with the different letters are significantly different (p＜
0.05) by Duncan’s multiple range test.
ical을 가지고 있으며 친전자성 물질들과 활성산소 및 과 산화지질의 대사작용에 있어 무독화 과정에 이용된다.
Glutathione이 여러 활성증가 물질과 conjugation을 이루어 glutatione S-transferase와 같은 효소의 작용으로 urine을 배 설하도록 함으로써 체내의 독성물질들을 제거하는 것을
돕는다.42,43) Nodr 등43)의 연구에 의하면 종양이 생성된
마우스에 있어 glutathione과 glutatione S-transferase의 함량 이 증가한다고 보고하였다. 정상인 대조군의 glutathione 함량은 0.486 (μmol/g of tissue)이고 S-180+PBS군은 0.247 (μmol/g of tissue)인 데 반해 COS 첨가 김치군들의 함량은 0.353∼0.452 (μmol/g of tissue)으로 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다. 이는 키토산올리고당 첨가 김치군들이 독 성물질을 대사시켜 체외로 배출시키는 것으로 생각되어 진다. 따라서 키토산올리고당을 배추김치에 부재료로 첨가하는 방법은 첨가량은 소량이지만 배추김치의 암예 방 기능성을 높일 수 있다고 하겠다.
결 론
본 연구에서는 정상 마우스 및 sarcoma-180 세포를 이 식한 마우스에 키토산올리고당 첨가 김치를 투여한 후 적출한 마우스의 간을 이용하여 키토산올리고당 첨가 김치의 간 효소계에 미치는 영향과 혈액을 이용한 간독 성 예방 효과를 살펴보았는데, 키토산올리고당 첨가 김 치는 종양형성을 억제하고, glutathione 함량 및 glutathi- one S-transferase의 활성에 영향을 주어 암세포 성장으로 인한 간기능의 감소를 회복시켜 암의 진전으로 인한 독 소물질의 해독작용을 증가시킨다고 사료된다. 키토산올 리고당은 그 자체의 암예방 효과가 있으며, 일반 배추김 치에 키토산올리고당을 첨가하면 저장성의 증진뿐만 아 니라 김치의 암예방 효과를 증진시키는 효과가 있어 암 예방 기능성이 증진된 김치로 개발할 수 있으며, 또한 이를 이용한 여러 가지 건강 기능성 김치의 개발이 가능 할 것으로 사료된다.
감사의 글
이 연구는 농림부 농림기술개발사업의 지원에 의한 연구결과로 이에 감사드립니다.
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