ACL TOP

ACL TOP ^™ 으로 측정한 D-Dimer 검사의 평가

황유석ㆍ안정열ㆍ서일혜ㆍ박필환

가천의과학대학교 진단검사의학과

An Evaluation of the ACL TOP Automated Coagulometer for Determination of D-Dimer

Yu Seok Hwang, Jeong Yeal Ahn, Yiel Hea Seo, and Pil Whan Park

Department of Laboratory Medicine, Gachon University of Medicine and Science, Gil Medical Center, Incheon, Korea

Background : D-dimer is a specific marker of secondary fibrinolysis. D-dimer assay is widely used in the diagnosis of disseminated intravascular coagulation, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, and arterial thromboembolism. Enzyme linked immunosorbent assays have been validated as the reference method for plasma D-dimer measurement, but it took long time. We evaluated the analytical performance of new automated coagulation system, ACL TOP, for quantification of D-dimer.

Methods : The total plasma D-dimer concentrations were measured by Nycocard and ACL TOP. To test the linearity, a serial dilution samples were prepared and measured. Between run precision of the ACL TOP D-dimer assay was evaluated with HemosIL D-Dimer controls for 20days. The correlation was evaluated using 75 plasma samples from patients. ACL TOP was evaluated according to CLSI guidelines.

Results : ACL TOP showed good linearity (r=0.9996) and between run coefficient of variation was within 4.0%. Coefficient of correlation between Nycocard and ACL TOP was 0.798. Positive concordance rate of ACL TOP was 67%, and negative concordance rate of ACL TOP was 80%.

Conclusions : Since the ACL TOP showed a satisfactory precision, linearity, and comparative high correlation with Nycocard, and is more convenient and automatic than the Nycocard, it should be potentially beneficial in the clinical laboratories.

Key Words：D-dimer, Fibrinolysis, ACL TOP, Nycocard

교신저자：안정열

우) 405-760 인천시 남동구 구월동 1198번지 길병원 진단검사의학과

전화：032)460-3074, FAX：032)460-3415 E-mail：[email protected]

서 론

D-dimer는 플라스민에 의한 섬유소용해과정에서 생성되 는 분해산물로 감마사슬 사이의 공유결합에 의해 결합된 2D-fragment를 의미하며, fibrinogen degradation products (FDPs)는 플라스민에 의한 섬유소원분해산물, 수용성 섬유 소, 불용성 섬유소를 의미한다[1, 2]. 비록 FDP가 더 넓은 범위를 의미할 수 있으나 이차 섬유소용해를 감지하는데 D-dimer가 더 탁월하며, 파종성혈관내응고증, 폐색전증, 심

부정맥혈전증, 악성종양, 패혈증, 자간전증, 심근경색, 말초동 맥 폐쇄성 질환의 진단에 이용된다[3, 4]. 특히 정맥혈전증 의 진단에 있어서 D-dimer의 증가만으로 정맥혈전증을 진 단하는 것에는 무리가 있으나 낮은 pretest clinical prob- ability score (PCP score)와 정상 D-dimer값을 가지는 경우 정맥혈전증을 배제하는데 유용하다[5, 6].

D-dimer 측정의 표준검사방법으로는 면역효소형광분석

법(ELISA)이 인정 받은바 있으나 숙달된 인력을 필요로

하고 분석 과정에서 4-6시간이 소요되므로 검사시간을 고

려하여 본다면 응급검사로서의 이용에는 어려움이 있다. 그

외의 검사방법으로는 수기 라텍스응집시험, 막기반면역분석

법(membrane based immunoassay), 자동화 라텍스광산란분

석법(automated latex-enhanced light scattering immu-

noassay)등이 있다[7]. 이러한 여러 검사방법들의 원리는

y = 0.9625x + 37.652 R

= 0.9996 0

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

0 200 400 600 800 1000

Expected D-Dimer(ng/mL)

Me sure d D- Dime r(ng /mL)

Fig. 1. Linearity of concentration of D-dimer by ACL TOP.

D-dimer 항원에 대한 단클론항체를 이용하여 D-dimer를 검출하는데, 이미 언급한 표준방법의 단점을 보완 극복하기 위해서 정확하고 간편한 측정법이 지속적으로 개발되고 있 다.

비교적 최근에 소개된 ACL TOP

(Instrumenta- tion Laboratory, Lexington, MA, USA)은 라텍스광산 란분석법에 근거한 자동화 응고장비로 최근에 본원에 도입 되었다. 프로트롬빈시간(PT), 활성화부분트롬보플라스틴시 간(aPTT), 섬유소원(fibrinogen)외에 D-dimer 검사항목 이 추가됨에 따라서 본 검사실에서는 ACL TOP을 이용한 D-dimer 측정법의 정밀도 및 직선성을 평가하고 기존에 사용하던 Nycocard D-dimer (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway)검사법과 비교하였다. 아직 ACL TOP에 대한 국내 평가보고서가 없기 때문에 장비의 선택, 평가에 도움이 되고자 하였다.

대상 및 방법

2006년 5월부터 7월까지 병동 및 외래에서 D-dimer 측정이 의뢰된 검체를 대상으로 하였다. Nycocard로 D-dimer 측정 후 -70℃에서 보관하던 검체중 무작위로 97개를 선택한 후 ACL TOP으로 D-dimer를 측정하였다.

3.2% sodium citrate tube에 정맥혈과 항응고제의 비율 을 9:1이 되도록 검체량 2 mL를 채취한 뒤 15분간 2500 g로 원심분리하여 혈장을 얻었다. 정도관리물질은 제조사에 서 제공되는 저농도 및 고농도 정도관리물질(Low D-D &

High D-D control materials)을 사용하였으며 시약과 기기 의 사용은 제조사의 지침에 따라 실시하였다. ACL TOP은 기존 ACL계열의 혈액응고 검사장비에서 사용되는 단클론항 체가 포함된 라텍스 시약인 HemosIL DD (Instrumen-

tation Laboratory)를 이용할 수도 있으며 그 성능이 향 상된 라텍스 시약인 HemosIL D-Dimer HS (Instru- mentation Laboratory)를 사용할 수 있다. 본 평가에서 는 HemosIL DD를 사용하여 검사를 시행하고 아래와 같 은 항목을 평가하였다.

1) 직선성

CLSI EP06-A[8]의 지침을 참고하여 932 ng/mL의 기대치를 보이는 고농도 정도보정물질(D-dimer calib- rator)을 장비회사에서 제공되는 희석액으로 8:0, 4:4, 2:6, 1:7로 희석시켜 만든 4가지 단계 농도 물질(932 ng/mL, 466 ng/mL, 233 ng/mL, 116.5 ng/mL)들을 대상으로 하였고 각각 2회 측정하여 얻은 평균치로부터 회 귀 방정식 및 결정계수를 구하여 직선성을 평가하였다.

2) 정밀도

장비회사에서 제공한 저농도(평균, 340 ng/mL; 허용범 위, 255-425 ng/mL)와 고농도(평균, 749 ng/mL; 허용 범위, 637-861 ng/mL) 2가지 농도의 정도관리물질을 이 용하였다. 각 농도군을 매일 1회 20일간 측정하여 검사간 정밀도를 구하였다.

3) 상관성(Comparison) 평가

이미 Nycocard로 결과가 나온 뒤 -70℃로 보관되어 있 던 검체에 대해 ACL TOP D-dimer를 측정하여 CLSI EP9-A2[9]에 따라 상관성을 평가하였다. 97개 검체 중 22개 검체의 결과값을 얻지 못하여 제외하였다.

4) 통계분석

Excel statistics package (Microsoft Corp., Red-

D-Dimer

0 1 2 3 4 5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

Nyco (ug/mL)

AC L ( u g/ m L )

Fig. 2. Correlation between Nycocard and ACL TOP, r=0.798 (P = <0.001).

Table 1. Concordance rate between Nycocard and ACL TOP

Nycocard D-dimer＊ ACL TOP D-dimer† Concordance rate

Nycocard ＜ 0.3 mg/L ACL TOP ＜ 232 ng/mL 24 (80%)

Nycocard ＜ 0.3 mg/L ACL TOP ≥ 232 ng/mL 6 (20%)

Nycocard ≥ 0.3 mg/L ACL TOP ＜ 232 ng/mL 0 (0%)

Nycocard ≥ 0.3 mg/L ACL TOP ≥ 232 ng/mL 45 (67%)

Nycocard ≥ 0.3 mg/L ACL TOP undetermined 22 (33%)

＊cut-off value: 0.3 mg/L, † cut-off value: 232 ng/mL.

mond, WA, USA), SigmaStat for window version 3.10 (SSI, USA) 을 이용하였다. 정밀도 평가에서는 변 이계수를 구했으며, 직선성 평가에서는 일반선형모델로 회 귀분석을 실시하였고, 상관성 검증을 위해서 피어슨 상관계 수를 구하고 일반선형모델을 이용하여 회귀분석을 같이 실 시하였다.

결 과

1. 직선성

희석 검체들의 예상치와 ACL TOP에 의한 측정치 간의 회귀방정식은 y = 0.9625x + 37.6520이었고 결정계수 (R

)는 0.9996이었다. 제조회사는 자동 재검없이 직선성 을 보이는 범위를 200-1050 ng/mL로 제시하고 있으며, 실제로 116.5-932 ng/mL 범위 내에서 우수한 직선성을 보였다(Fig. 1).

2. 정밀도

저농도 정도관리물질의 평균농도는 362.65 ng/mL이었 고, 고농도는 730.30 ng/mL이었다. 검사간 정밀도의 변 이계수는 저농도 정도관리물질에서 3.64%, 고농도에서는 3.05%였다.

3. Nycocard와 ACL TOP과의 D-dimer 결과의 상관성

Nycocard로 측정한 농도값을 알고 있는 검체 중 22개 검

체에서 5배 희석된 자동재검 뒤에도 ACL TOP 측정치가

나오지 않았으며 그 추정원인은 고찰에 기술하였다. 75개

검체에 대한 두 검사방법에 의한 측정치의 상관계수는

0.798이었다(Fig. 2). Nycocard 양성검체에 대한 ACL TOP

의 양성일치율은 67%였으며, Nycocard 음성검체에 대한

ACL TOP의 음성일치율은 80%였다(Table 1). 두 검사의

측정값을 비교할 수 있는 75개 검체에서 불일치 결과는 6개

였으며, 이들 검체의 Nycocard 측정치는 0.1~0.2 mg/L

(cut-off level : 0.3 mg/L)로 정상 참고치 범위 내에 있었으

나 ACL TOP에서는 측정치가 329~777 ng/mL (cut-off

Table 2. Characteristics of patients with disagreement Case

No. Age/Sex Nyco

(mg/L)

ACL (ng/mL)

PT/aPTT**

(sec, sec)

Hb/PLT (g/dl, 10

/μL)

Fibrinogen

(mg/dL) FDP

1

39/F 0.1 400 12.6/ 32.4 9.2/105 479 1:40

2

26/M 0.2 777 16.5/ 41.5 11.2/ 57 131 1:80

3

75/M 0.2 329 17.7/ 88.2 9.9/215 - -

4

54/M 0.2 556 19.4/ 53.6 8.5/106 - 1:20

5

62/M 0.1 330 13.6/120.0 11.0/129 391 -

6

60/M 0.1 604 - 14.7/190 - -

* Missed abortion, † Renal injury due to stab injury, ‡ Myocardial infarction, § Tbc pleurisy with history of deep vein thrombosis and stroke, ‖ Congestive heart failure, ¶ Pulmonary sequelae of Tbc, ** reference intervals: PT; 9.5~13 sec, aPTT; 24~43.5 sec.

level : 232 ng/mL)로 모두 증가된 D-dimer 결과치를 보였 다. 불일치 결과에 대한 환자군의 진단명은 각각 계류유산, 신 조직 손상을 동반한 복부 자창, 급성 심근경색증, 정맥혈 전증과 뇌졸중의 과거력이 있는 결핵성 늑막염, 심부전증, 결핵성 폐합병증이었다(Table 2).

고 찰

정맥혈전증과 폐색전증 진단을 위한 선별검사로서 D-dimer 검사의 효용성에 대한 많은 연구가 있어 왔으며 [10], Wells와 Perrier에 의해 만들어진 PCP score[11, 12]와 혈중 D-dimer 농도를 이용하여 낮은 PCP score를 보이면서 D-dimer 농도가 정상범위에 속하는 경우 정맥혈 전증을 배제하는데 유용하다[13]. 그 외에도 파종성혈관내 응고증의 진단에서 흔히 D-dimer 검사를 필요로 한다. 또 한 정맥혈전증과 DIC외에 임신 및 임신성 고혈압과 관련되 어서도 D-dimer가 증가될 수 있으며, 출산과 출산 후 약 4주까지는 D-dimer가 증가될 수 있다고 한다[14]. FDPs 와의 연관성에 대해서는 D-dimer가 증가할수록 FDPs가 증가할 가능성이 크지만 그 상관성은 FDPs가 중등도 이상 증가할수록 더 크다고 한다[15]. 급성 뇌혈전증과 만성 뇌 혈전증에 관련하여서도 모두 D-dimer의 증가를 보일 수 있 으며[16], 관상동맥질환과의 연관성 연구에서도 D-dimer의 상승은 비록 트로포닌 T와의 직접적인 연관성은 높지 않으 나 질환의 중증도에 관련되어서는 유용하다고 하였다[17, 18].

D-dimer에 특이적인 다클론성 항혈청은 1982년도에 발 표되었지만[19], D-dimer 항원에 대한 단클론항체가 처음 소개된 것은 1983년도에 Rylatt에 의해서이다[20]. 그 후 80년대에 Nycocard법에 의한 D-dimer검사가 소개되었고, 1997년도에 Instrumentation Laboratory에서 HemosIL

D-dimer검사를 출시하였다. Nycocard D-dimer는 면역여 과(immunofiltration flowthrough) 원리에 기초한 것으 로 카드 중간중간에 작은 구멍이 있으며 이곳에는 단클론항 체(S4H9)가 붙어있는 다공성 막이 위치하게 되며 이곳에 검사할 혈장을 분주하면 D-dimer는 막에 붙어있는 단클론 항체와 결합하게 된다. 그 결합정도를 확인하기 위해서 4 nm 직경의 gold가 결합된 단클론항체를 접합체로 점적하 면 이미 막 위에서 단클론항체와 결합한 D-dimer의 다른 항원결정기 부위와 결합하게 되며 그 결합된 D-dimer의 양에 비례하여 gold 콜로이드가 염색성을 나타낸다. 이러한 염색성은 Nycocard Reader II를 이용하여 측정된다 [21-23]. ACL TOP의 경우 마우스 단클론항체(mouse monoclonal antibody, MA-8D3)가 포함된 라텍스 시약 과 혈장을 섞어서 D-dimer의 양에 비례하여 생기는 응집 의 정도를 405 nm 또는 671 nm의 파장의 빛으로 투과시 켜 흡광도의 변화를 감지하여 D-dimer의 양을 측정하는데, D-dimer의 양이 많을수록 투과광이 낮게 측정된다.

Nycocard와 ACL TOP의 농도단위는 용해되어 있는 섬유 소 분절 D-dimer의 양을 기준으로 한 것이다. 비록 두 장 비가 같은 단위를 사용하지만 그 수치적 농도로 D-dimer 절대값을 비교 판단하는 데에는 어려움이 있다[7]. 그 외에 VIDAS (bioMérieux, Marcyl’Etiole, France)와 Liatest (Diagnostica Stago, Asnieres, France)는 fibrinogen equivalent units (FEU)단위를 쓰는 것으로 알려져 있으며 그 의미는 섬유소 분해산물을 만드는데 필요 했던 원래의 섬유소원의 양을 기준으로 한 것이다. 분자량 에 근거하여 2 mg FEU/L는 1 mg DD/L에 유사한 반응 성을 가지고 있다[24].

장비회사에서 제공하는 자료는 라텍스 HemosIL D-

Dimer 시약을 사용시 자동재검없이 200-1050 ng/mL,

자동재검시 5250 ng/mL까지 직선성을 보이며 총 변이계

수가 평균농도 340 ng/mL, 729 ng/mL에서 각각 7.7%, 4.5%이며, 참고범위 상한치(cut-off value)는 232 ng/mL로 제시하였다. 이번 평가에서 확인한 ACL TOP D-dimer검사의 직선성은 제조사에서 제시한 범위(<1050 ng/mL)이내에서 우수한 결과를 보였다. 또한 검사간 정밀 도의 변이계수는 저농도 정도관리물질에서 3.64%, 고농도 정도관리물질에서 3.05%로 제조회사에서 제시한 범위와 비교하더라도 우수한 결과를 보였다. 또한 검체 처리 속도 는 원심분리후의 혈장상태에서 검사 결과 출력까지 약 7분 이 소요되어 응급검사의 요구치를 만족시켰다. Nycocard 를 사용했을 때 검사소요시간은 약 3분 정도로 ACL TOP 보다 빠르지만 수작업으로 검체를 다루어야 하는 단점이 있 다. 더욱이 ACL TOP은 검사 운용 중이더라도 응급검체에 대한 결과를 신속하고 간단하게 측정할 수 있는 점은 다른 ACL계열의 혈액응고 장비보다도 뛰어난 점이다. Nyco- card 양성검체에 대한 ACL TOP의 높은 양성일치율 (100%)은 주로 고농도에서 보였으며, 저농도와 cut-off 주위에서 차이가 있음을 알 수 있었다. 두 검사방법간 불일 치 결과를 보인 환자는 모두 D-dimer가 증가할 수 있는 진단명을 가지고 있었고, International Society of Thrombosis and Hemostasis (ISTH)[25]에서 제시한 DIC의 진단기준을 고려하여 볼 때 PT의 연장 혹은 혈소판 감소증을 보이는 경우가 대부분이어서 ACL TOP의 D-dimer 결과의 민감도가 비교적 높을 것으로 판단되었다.

그러나 진단적 결정농도(medical decision level)에서의 ACL TOP D-dimer 수행능 평가는 중요하기 때문에 보다 광범위한 수행능 평가를 지켜보아야 할 것으로 보인다. 두 검사 방법간의 상관계수는 0.798로 높은 상관성 점수를 주 기에는 어려웠다. 그러나 다른 회사에서 제조되는 단클론항 체(Nycocard: S4H9/ ACL TOP: MA8D3)의 영향과 측 정원리의 차이 및 이로 인한 서로 다른 참고범위와 농도단 위를 고려하여 보았을 때에는 비교적 높은 상관성을 보였다 고 판단하였다. 제조회사에 따른 단클론항체의 차이가 서로 다른 D-dimer검사장비의 직접비교를 어렵게 한다는 점은 이미 알려진 사실이다. 무엇보다 D-dimer검사의 정확도에 중요한 역할을 하는 것은 단클론항체가 혈중의 섬유소원이 나 D-monomer와 같은 섬유소원분해산물에는 반응하지 않 으면서 D-dimer에만 반응할 수 있는 정도에 달려있다. 이 를 위해서 트롬빈에 의해 섬유소원이 섬유소중합체가 된 후 플라스민에 의한 절단 과정에서 생긴 D-dimer에만 특이적 으로 반응하는 단클론항체를 찾는 노력이 있어 왔으며, 최 근에 우리나라에서도 새로 발견한 단클론항체 B4가 소개되 기도 하였다[26]. ACL TOP의 새로운 라텍스 시약인 DD HS도 F(ab)2 단클론항체를 사용하여 Fc에 의해 야기될 수 있는 간섭효과를 최소화하여 검사의 정확도를 높이려 하 였다. 마지막으로 97개 검체중 22개 검체에서 ACL TOP

에서 결과값을 얻지 못하였는데, 그 원인은 고농도 D-dimer값에 기인하는 것으로 추정하고 있다. 그 근거로 는 ACL TOP에서 농도값을 얻지 못했던 검체의 평균 Nycocard농도값은 5.8 mg/L로 고농도인 점과 장비의 흡 광그래프상 고농도를 의심케하는 양상을 보였다는 점을 제 시할 수 있다. 이러한 부분은 Nycocard 양성검체에 대한 ACL TOP 양성일치율 67%가 과소평가되어 있을 가능성 이 높다라는 점과 검사실에 적용시 고농도 검체가 많을 경 우 재검의 횟수를 증가시킬 수 있다는 점을 내포하고 있다.

증가된 재검으로 인해 시약비용의 증가 또는 검사소요시간 이 증가한다면 비록 시약가격은 높지만 직선성이 좋은 DD HS와의 비교검토가 시약선택에 있어서 필요할 것으로 보인 다.

이상의 내용을 요약하여 본다면, 라텍스 시약으로 HemosIL D-Dimer를 사용한 ACL TOP의 분석수행능은 우 수한 직선성, 정밀도를 보였고, 기존의 검사방법인 Nyco- card법과도 비교적 높은 상관성을 보였다. 검체량이 많은 경우, 검사의 신속성과 편리성을 고려하면 ACL TOP을 이 용한 D-dimer측정이 일반검사실은 물론 응급검사실에서도 실용적으로 사용 가능하리라 판단된다.

요 약

배 경 : D-dimer는 플라스민에 의한 섬유소분해산물로 파종성혈관내응고증, 심부정맥혈전증, 폐색전증, 동맥혈전 색전증 진단에서 이용된다. ELISA검사법이 표준방법으로 인정되고 있으나 비교적 검사시간이 길다는 점에서 응급검 사로 적용하는데 어려움이 있다. 비교적 최근의 자동화 응 고검사 장비인 ACL TOP을 이용한 D-dimer측정에 대한 평가를 시행하였다.

방 법 : ACL TOP와 Nycocard로 혈장내 D-dimer를 측정하였다. ACL TOP D-dimer검사에 사용된 라텍스 시 약은 HemosIL D-dimer였다. 검체를 여러 단계로 희석하 여 직선성을 검정하였으며, 정도관리물질을 이용하여 20일 동안 검사간 정밀도를 평가하였다. 상관성 평가는 환자 혈 장 검체 75개를 대상으로 하였다. ACL TOP을 이용한 D-dimer 분석 능력 평가는 CLSI 지침을 참고하였다.

결 과 : ACL TOP은 우수한 직선성을 보였으며, 검사 간 정밀도의 변이계수 4.0% 이내로 우수하였다. Nyco- card와의 비교에서 상관계수는 0.798이었으며, 양성일치율 은 67%, 음성일치율은 80%였다.

결 론 : ACL TOP은 직선성, 정밀도, 방법간 비교 평

가에서 우수한 성능을 보였다. 검체량이 많은 경우, 검사의

신속성과 편리성을 고려하면 ACL TOP을 이용한 D-

dimer측정이 일반검사실은 물론 응급검사실에서도 실용적

으로 사용 가능하리라 판단된다.

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