197 책임저자：문자영, 641-773, 경남 창원시 사림동 9번지
창원대학교 자연과학대학 보건의과학과 Tel: 055-213-3552, Fax: 055-213-3550 E-mail: jymoon@changwon.ac.kr
접수일：2008년 7월 3일, 게재승인일：2008년 7월 21일
Correspondence to：Ja-Young Moon
Department of Biochemistry and Health Sciences, College of Natural Sciences, Changwon National University, 9, Sarim-dong, Changwon, Gyeongnam 641-773, Korea
Tel: +82-55-213-3552, Fax: +82-55-213-3550 E-mail: jymoon@changwon.ac.kr
아밀로이드 베타 단백질에 의해 유도된 신경세포 독성에 대한 황정의 억제 효과 탐색
1창원대학교 자연과학대학 보건의과학과, 2광주과학기술원 생명과학과, 3부산대학교 생명자원과학대학
생명자원과학부 원예학과, 4(주)네오허브 한방생명공학연구소, 5(주)천년약속 바이오연구소
김은숙1ㆍ최수진1ㆍ강가혜1ㆍ오명석2ㆍ박우진2ㆍ최영환3ㆍ이철원4ㆍ임학섭5ㆍ조용권1ㆍ문자영1
Protective Effects of Polygonatum odoratum Extracts on Amyloid β-protein-induced Death in Neuronal Cells
Eun-Sook Kim1, Soo-Jin Choi1, Ga-Hea Kang1, Myungsok Oh2, Woo Jin Park2, Young-Whan Choi3, Chul Won Lee4, Hak Seob Lim5, Yong Kweon Cho1 and Ja-Young Moon1
1Department of Biochemistry and Health Sciences, Changwon National University, Changwon 641-773,
2Department of Life Science and National Research Laboratory of Proteolysis, Kwangju Institute of Science and Technology, Kwangju 500-712, 3Department of Horticultural Bioscience, College of Natural Resources and Life Science,
Pusan National University, Miryang 627-702, 4Institute of NeoHerb Oriental Medicine Biotechnology, Changwon 641-771, 5Bioinstitute, Millennium Promise Co., LTD, Busan 619-961, Korea
The amyloid β-protein (Aβ) is the principal component of the senile plaques characteristic of Alzheimer’s disease (AD) and elicits a toxic effect on neurons in vitro and in vivo. Many environmental factors including antioxidants and proteoglycans modify Aβ toxicity. In this study, we have investigated the protective effects of organic solvent-extracts of Polygonatum odoratum fractions pre-extracted with methanol on Aβ-induced oxidative cell death in cultured rat pheochromocytoma (PC12) cells. For this study, we used MTT reduction assay for detection of protective effects of organic solvent-extracts of Polygonatum odoratum fractions pre-extracted with methanol on Aβ25-35-induced cytotoxicity to PC12 cells. We also used cell-based β-secretase assay system to investigate the inhibitory effect of organic solvent-extracts of Polygonatum odoratum on β-secretase activity. We previously reported that methanol extracts of Polygonatum odoratum strongly attenuated cytotoxicity induced by the three A fragments (Aβ25-35, Aβ1-42 Aβ1-43) to both SK-N-MC and PC12 cells. In the present study, we found that the organic solvent extracts of Polygonatum odoratum fractions pre-extracted with methanol had the strong protective effects against Aβ25-35-induced cytotoxicity to PC12 cells and inhibitory potency to β-secretase activity. These results suggest that organic solvent extracts of Polygonatum odoratum fractions pre-extracted with methanol may contain the protective component(s) against Aβ-induced cell death in PC12 cells as well as inhibitory component(s) to β-secretase activity. (Cancer Prev Res 13, 197-204, 2008)
Key Words: Amyloid β-protein, Polygonatum odoratum, Liliaceae, PC12 cell, BACE, β-secretase
서 론
알츠하이머병은 진행성 치매로서 점진적인 뇌 위축에 기인한 현저한 기억장애를 특징으로 하는 원발성 퇴행 성 뇌질환으로, 거의 모든 연령에서 발병할 수 있으며, 노년층으로 접어들면서 점차 그 빈도가 증가하는 것으 로 알려져 있다.1) 알츠하이머병은 발병 원인에 따라 유 전성과 산발성으로 나눌 수 있으며, 아밀로이드 전구단 백질이나 presenilin과 같은 특정한 유전자에 돌연변이가 생기면 100% 알츠하이머병으로 발전하는데, 이 경우가 전체 5% 내외를 차지하는 유전성 알츠하이머병이다. 전 체 알츠하이머병의 90% 이상은 65세 이상의 노인에게 주로 나타나는 산발성 알츠하이머병이다. 산발성 알츠 하이머병은 아직까지 정확한 원인이 밝혀지지 않아 예 방과 치료가 어려운 실정이었으나 최근에 발병 원인이 하나씩 밝혀지고 있다.
유전성과 산발성 알츠하이머 병의 공통적으로 나타나 는 병리학적 특징으로는 아밀로이드 베타단백질(Aβ)로 알려져 있는 펩타이드성 단백질이 축적되어 노인반 (senile plaque)으로서 언급되는 세포외 단백질 축적 현상 이다.1) Aβ는 정상인의 경우에도 인체 곳곳에서 소량 생 성되지만, 생성된 Aβ는 빠르게 분해되어 체내에 쌓이지 않는 반면, 알츠하이머병 환자의 경우에는 Aβ가 비정상 적으로 많이 생성되어 분해되지 않고 조직에 축적됨으 로써 노인반이 생성되거나 기억과 학습에 중요한 역할 을 하는 해마나 대뇌피질 같은 곳에 과다하게 쌓이게 된 다. 축적된 Aβ는 주변의 세포들에 염증반응을 일으킨 다. 따라서 신경세포가 손상되고 점점 뇌의 정상적인 기 능을 유지하는 신경회로망마저 훼손되기에 이른다. 게 다가 축적된 Aβ는 신경세포를 죽이는 신호 체계를 가동 시키는 활성산소를 많이 만들어낸다.
Aβ는 β-secretase에 의해 절단된 아밀로이드 전구단백 질(amyloid precursor protein)의 일부분이다. Aβ는 그것을 구성하고 있는 아미노산의 수에 따라 여러 가지 형태가 있다. 알츠하이머병 환자의 경우 40개 또는 42개의 아미 노산으로 이뤄진 Aβ의 비율이 급격히 많아진다. Aβ를 배양중인 신경세포에 처리하였을 때 신경세포사를 유도 하며 그 세포사의 기전이 알츠하이머병 환자에서 나타 나는 apoptosis의 유형과 유사하다는 많은 보고들이 있다.
Aβ1-42 또는 Aβ1-43 단백질에 의한 신경세포의 손상이 Alzheimer형 질환 유발의 중요한 원인중의 하나로 확인 되고 있으며,2-4) Aβ25-35는 신경세포의 손상을 유발하는
Aβ1-42 or 43의 중요한 toxic fragment로서 알려지고 있다.4,5)
치매와 관련하여 현재 약리학적 접근법으로는 acetyl- cholinestrase inhibitors,6,7) nicotinic and muscarinic agonists,8,9) estrogen,10) nerve growth factor,11,12) neurotrophic factor를 활 성화시키는 저분자 lipophilic 물질들,13) ibuprofen과 COX-2 inhibitors와 같은 비스테로이드성 항염증 치료제14) 등이 포함되어 있다. 현재 세계적인 제약회사들이 나서서 β- secretase의 작용을 억제하는 약물을 개발해 Aβ가 생성되 는 것을 원천적으로 차단하고자 노력을 기울이고 있다.
최근에는 미국의 제약회사와 대학 및 연구소에서는 치 매 치료제의 개발을 위해 약용식물로부터 항산화 효과 를 나타내는 성분을 분리하는 연구가 많이 진행되고 있 으며 이들 중에서 치매의 치료제로서 사용되기 시작한 성분들로는 Ginkgo biloba L (은행나무)15,16)과 Huperzia serrata Travis (중국산이 끼)17,18)들이 대표적인 경우이다. 이외에 Curcuma longa L. (강황)로부터 분리한 curcuminoids 성분 또 한 치매의 치료효능이 보고되고 있으며,19-21) 아밀로이드 대사물의 독성을 억제하는 것으로 알려진 인삼, tetrand- rine, 은행잎 추출물(Egb761) 등은 신경세포 생존을 증가 시키거나 알츠하이머환자의 치매증상의 악화속도를 늦 출 수 있다고 보고된 바 있다.19)
황정(黃精)은 외떡잎식물 백합목 백합과(Liliaceae)의 여 러해살이풀의 약초로서 학명이 Polygonatum odoratum이다.
梁代 陶弘景의 ≪名醫別錄≫22)의 草木上品에 기술된 바 에 의하면, 황정(黃精)은“黃芝, 戊己芝, 救藭草 등의 다른 이름으로 불리어지기도 하며, 性味는 無毒味苷平이고 歸經은 心ㆍ脾ㆍ胃ㆍ肺ㆍ腎으로 補中益氣 諸風濕 安五 臟으로 效能을 가지고 있음”을 기술하고 있다.22,23) 즉, 황 정은 그 성질이 평(平)하고 맛은 달며, 비장을 보하고 폐 를 윤택하게 하며, 비장과 위장의 기허증(氣虛症)이나 온 몸이 나른하고 무기력한 증상을 완화시킬 뿐만 아니라, 폐질환에 의한 객혈이나 병후의 허약증에도 효과가 있 고, 특히 근육과 뼈의 무력증에 뛰어난 효과를 보이며, 풍습에 의한 통증을 치료하기도 하는 것으로 알려져 있 다.23) 또한 현대 약리학 연구에 의하면 황정에는 다당, 아미노산, 니코틴산 등 인체에 유익한 성분이 함유되어 있는 것으로 밝혀졌는데, 이들 성분은 인체의 영양상태 를 개선하고 면역력과 혈관의 유연성을 높이는데 모두 중요한 역할을 하는 물질들이다. 그래서 황정은 고혈압 이나 관상동맥, 심장병, 백혈구 감소증, 재생불량성 빈혈 등의 질환에 효과가 있는 것으로 밝혀져 그 치료에 응용 되고 있으며, 이는 심혈관 질병과 당뇨병에 대한 뚜렷한 예방과 치료 효과가 있다는 것으로 밝혀졌다.23) 황정은 민간요법에서는 신경을 자양하고 해독하는 효 능이 있는 것으로 밝혀져 주목을 받고 있으나 황정의 치
매 예방 및 기억력 증진에 대한 연구는 없는 실정이다.
따라서 본 연구에서는 국내에 자생하는 백합과에 속하 는 황정의 뿌리로부터 치매의 치료제로서 가능성이 있 는 유효성분을 탐색하고자, 황정의 80% 메탄올추출물을 용매분획하여 얻어진 CHCl3, EtOAc, BuOH, H2O 분획물 들을 대상으로 Aβ25-35에 의해 유도된 PC12 신경세포의 손상을 억제하는 효능과 β-secretase의 활성억제 효능을 평가하였다.
재료 및 방법 1. 실험 재료
1) 실험재료: 본 연구에 사용된 황정(黃精)의 기초자료
는 대한식물도감(이 창복 저, 향문사)으로부터 확보하였 으며, 황정의 메탄올 추출물은 자생식물이용기술사업단 (단장 : 정 혁 박사)으로 부터 구입하였으며, DMSO에 녹 여서 stock solution으로 보관하였고, 본 실험에서도 DMSO를 이용해서 원하는 농도로 희석하여 사용하였다.
황정의 메탄올 추출물로 부터 3종의 유기 용매(chloro- form (CHCl3), ethylacetate (EtOAc), n-butanol (BuOH))와 증 류수를 이용하여 순차 유기용매법으로 황정의 2차 유기 용매 분획물을 만들어서 본 실험에 사용하였다.
2) 실험에 이용한 Cell: 본 실험에서는 실험동물 쥐 (rattus norvegicus)의 부신수질의 크롬친화성 세포종(pheo- chromocytoma)으로부터 유래한 PC12 cell을 사용하였다.
3) 시약 및 기기: 본 실험에 이용한 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sul- foxide (DMSO), amyloid fragment인 Aβ25-35, Aβ1-42, Aβ1-43
은 sigma chemical 사 (USA)로 부터 구입하였다. 세포배양 에 필요한 fetal bovin serum (FBS), horse serum, L-glutamine, non-essential amino acid, penicillin/streptomycin, 96 well plate, collagen, phosphate buffered saline (PBS), tripsin/EDTA, dulbecco's modified eale's medium (DMEM)은 Gibco BRL사 (Gland Island, NY, USA)로 부터 구입하였다.
2. 실험방법
1) PC12 Cell Culture: 본 연구에 사용한 PC12 cell은 collagen을 코팅한 dish 또는 96 well plate에서 5% fetal bovine serum, 10% horse serum, penicillin 및 streptomycin을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에 37oC, 5% CO2 조건의 incubator 에서 배양하였다. 배지는 2일에 1번 교체했으며, 세포가 배지 내에 80~90% 정도 성장하 면 계대 배양하였다.
2) 황정의 2차 유기용매 분획이 신경세포 생존에 미치는
영향 측정: PC12 cell을 Collagen이 코팅되어 있는 96 well plate에 well당 20,000개의 cell이 들어가도록 분주하였다.
Overnight culture 시킨 후에 황정 용매 추출물을 DMSO에 녹여 농도 별(25, 50, 100, 200μg/ml) 로 처리하고 37oC, 5% CO2 조건의 incubator에서 24시간 동안 배양하였다.
그 후에 MTT 액(5 mg/ml in PBS, pH 7.5)을 20μl씩 넣고 3시간 동안 배양시키고, 그 다음에 상층액을 모두 제거 하고 DMSO와 EtOH을 1：1로 섞은 용액을 100μl씩 넣 고 10분 정도 후에 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 대조군의 생존율을 100%로 하여 계산하였다.
3) 황정의 2차 유기용매분획이 Aβ 단백질에 의하여 유
발된 신경세포독성의 억제효과 측정: 황정의 유기용매 분
획이 아밀로이드 베타 단백질에 의해 유도되는 세포독 성을 억제하는 효능은 신경세포와 dopamine 생성세포주 인 PC12 cell을 대상으로 MTT assay를 수행하여 cell viability를 측정함으로써 확인하였다. PC12 cell을 collagen 이 코팅 된 96 well plate에 well당 20,000개의 cell이 들어가 도록 count하여 분주하고 37oC, 5% CO2 조건에서 over- night시킨 다음, 1μg/ml의 Aβ와 황정 분획을 농도 별(25, 50, 100, 200μg/ml)로 함께 처리하여 24시간 동안 37oC, 5% CO2 조건에서 더 배양하였다. 그 후에 MTT 용액(5 mg/ml in PBS, pH 7.5)을 20μl씩 넣고 3시간 동안 배양시 킨 후에 상층액을 모두 제거하고 DMSO와 EtOH을 1：1 로 섞은 용액을 100μl씩 넣고 잘 흔들어 주었다. 10분 정도 후에 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 대조군의 생존율을 100%로 하여 계산하였다.
4) 황정의 2차 유기용매 분획이 아밀로이드 베타 단백질
분해 효소의 활성억제효과 측정: 아밀로이드 베타 단백질
분해효소(β-Secretase)의 활성은 박우진 교수(광주과학기 술원) 연구팀이 개발한 Cell-based BACE assay system24)을 사용하였다. 본 BACE assay system의 원리는 Fig. 1에서 잘 나타나 있다. 즉, 본 assay system에는 Suc2 mutant (MATα leu2 ura3 his3 trp1 lys2 suc2-Δ9) (Robinson et al., 1988)인 SEY6210 yeast strain에 protease인 β-Secretase expression vector와 alkaline phosphatase (AP) expression vector를 co- transformation하여 만든 recombinant yeast를 이용하였다.
이 Recombinant yeast는 성장 과정 중에 지속적으로 생성 되고 있는 protease (β-Secretase)가 ER/Golgi compartment에 서 생성되고 있는 GM2-AP를 절단함으로써 해리된 AP가 세포밖으로 분비되어 나온다. 분비되어 나온 AP가 배양 액에 첨가된 AP의 기질인 NPP를 분해함으로써 발색하 게 되는데, 발색정도를 ELISA reader (A405nm)로 측정하여
Fig. 1. Diagram of cell based assay system for β-secretase assay.
β-Secretase의 활성도로 표시한다. β-Secretase 활성 저해 물질을 배양액에 첨가하여 recombinant yeast를 배양시키 면 성장기간 동안에 protease이 발현이 억제되어 ER/Golgi compartment에서 생성되고 있는 GM2-AP를 절단하지 못 함으로써 AP를 세포 밖으로 내보내지 못하여 배양액에 존재하는 NPP를 대사시키지 못하여 발색이 일어나지 않게 된다. 이때의 발색 정도를 ELISA Reader로 측정하여 정상 대비 활성도를 % Inhibition으로 표시하여 BACE의 저해활성으로 나타내게 된다. 본 실험의 세부과정은 다 음과 같이 수행되었다. 즉, Recombinant yeast를 5 ml SD media (Leu-, Trp-, 2% glucose) 에서 seed culture 한 다음, 200 ml SD media에 subculture하여 O.D600 nm≅1.0에 도달 할 때까지 배양하였으며, 배양된 yeast cell을 원심분리 (3,000 rpm, 10 min)하여 회수한 다음, 멸균된 증류수로 suspension 하여 재 회수 하였다. 회수된 cell pellet을 1 ml 의 SD media에서 균질화한 다음 O.D600nm를 측정하여 세 포수를 결정하였다. 황정 용매추출물 분획을 농도별로 희석하여 보관하고 있는 각각의 sample tube에 600μl 씩 의 SD media를 넣고 혼합한 다음, 혼합된 sample tube 각 각에 2×106 cell을 넣은 다음, 150μl/well (5×105 cell/well)씩 의 혼합액을 96 well plate에 분주한 후 10oC에서 10∼12 시간 동안 배양하였다. 배양 후 well 당 50μl 씩을 new plate에 옮긴 다음, 100μl AP buffer (alkaline phosphatase yellow liquid substrate system for ELISA+L-Homo Arginine) 를 old plate에 첨가하여 반응시키면서 반응시간별(0, 2, 10, 24 h)로 발색정도를 ELISA reader (A405nm)로 측정하였 다. BACE의 inhibitor인 #190을 positive control로 사용하였 으며, yeast cell membrane을 통과하지 못하는 #202를 negative control로 사용하였다.
결 과
황정의 메탄올 추출물로부터 치매예방 및 치료효능이 있는 단일성분을 탐색하기 위하여 4종의 유기용매 (CHCl3, EtOAc, BuOH, H2O)를 이용하여 순차 유기용매 법으로 분획한 성분들에 대하여 아밀로이드 베타 단백 질에 의하여 유발된 신경세포독성의 억제효능과 β- secretase 활성 억제효능 정도를 측정하였다.
1. 황정의 용매추출물이 PC12 세포의 생존에 미치는 영향
아밀로이드 베타 단백질의 세포독성을 억제하는 황정 의 효과를 측정하기 전에 먼저 이들 식물 추출물들 자체 의 세포독성유무를 MTT assay를 수행하여 확인하였다.
메탄올로 1차 추출한 황정 분획물들을 4종류의 유기용 매를 사용하여 2차 용매 분획한 추출물을 농도별로 PC12 세포에 적용하였다(Fig. 2). 황정의 2차 분획물 중에 서 EtOAc, BuOH, H2O의 분획물은 각각 적용한 최대의 농도인 300μg/ml의 농도에서도 PC12 세포에 대한 독성 이 약하거나 나타나지 않았다. 한편, CHCl3 분획물은 25 μg/ml농도에서 가장 독성이 강하게 나타났고, 그 이상 의 농도에서는 25μg/ml의 농도에서 보다는 조금 약한 독성이 나타났다. 따라서 CHCl3 분획물의 PC12 세포에 대한 IC50값은 25μg/ml로 결정되었다. 여기서 IC50값은 세포의 생존율을 50%에 도달하게 하는 추출물의 농도로 정의하였다.
2. 황정의 용매분획이 아밀로이드 베타 단백질에 의해 유도된 신경세포 독성의 억제효과 측정
황정의 2차 유기용매 분획물에 Alzheimer형 질환 유발 의 중요한 원인중의 하나인 Aβ25-35에 의하여 유발된 신
Fig. 2. MTT reduction assay for the measurement of cyto- toxicity of organic solvent-extracts of Polygonatum falcatum fractions pre-extracted by MeOH in PC12 cells. Measurement of MTT reduction was carried out as described in Materials &
Methods.
Fig. 3. Protective effects of organic solvent-extracts of Poly- gonatum odoratum fractions pre-extracted with MeOH on Aβ25-35-induced cytotoxicity in PC12 cells.
Fig. 4. Dose-dependent inhibition of BACE inhibitors. The assay for inhibitory activity of BACE was performed three times. The curves were fitted using SigmaPlot, yielding IC50
values.
경세포의 손상을 억제하는 효과가 있는지를 탐색하였 다. 즉, 황정의 2차 유기용매 분획물들을 300μg/ml의 농 도까지 처리하였을 때 1μg/ml의 Aβ25-35에 의하여 유발 된 PC12 cell에서의 독성이 억제되는지를 비교 평가하였 다(Fig. 3). 그 결과 황정의 CHCl3 추출물 200μg/ml의 농 도에서 40%정도의 억제효과가 나타났다. 하지만 CHCl3
외의 용매 추출물들의 Aβ25-35에 의해 유도된 세포독성 을 억제하는 효능은 MTT reduction assay에 의해 측정된 바와 같이 강한 억제 효능을 보여주지는 못했다.
3. 황정의 용매분획에 의한 아밀로이드 베타 단백질 분해효소의 활성억제 효과측정
황정의 2차 유기용매 분획물이 아밀로이드 베타 단백 질 분해효소(β-secretase)의 활성을 억제하는 효과가 있는 지 확인하기 위하여 cell-based β-secretase assay를 수행하 였다. BACE에 대하여 저해활성을 가지고 있으며, pepti- domimetic compounds로서 알려져 있는 물질(#190, #192,
#202)들을 β-secretase의 표준 저해물질로 사용하였으며, 이들을 황정의 용매분획물에 의한 β-secretase의 저해활 성을 비교 평가하는데 활용하였다(Fig. 4).
실험 결과 #190와 #192는 2.5와 3.0μM의 IC50값을 나 타내었다. 이들 두 BACE inhibitor에 대한 IC50 값을 본 실 험에서 positive control로서 사용하였다. #202의 경우에는 적용한 범위의 농도 이내에서는 전혀 β-secretase의 저해 활성을 나타내지 않았는데, 이 결과는 #202가 세포막을 통과하지 못하는 성질에 기인한 것으로 확인되었다.
Cell-based β-secretase assay system을 사용하여 황정의 유
기용매 분획물들의 BACE 저해활성을 측정한 결과는 Fig. 5에서와 같다. 황정 메탄올 추출물로 부터 4종의 유 기용매로 다시 분리한 2차 분획물질들은 저 농도 범위 내에서 BACE에 대하여 강한 저해활성을 나타내었으며, 이들의 IC50값은 2.52∼3.95μg/ml의 범위에 있었다. 이 결과는 본 실험에서 positive control로서 사용한 #190 또 는 #192의 강력한 저해활성과 대등한 β-secretase의 저해 활성을 가지고 있는 물질이 존재함을 알 수 있었다. 특이 적인 현상은 황정의 MeOH 추출물로부터 분획한 용매별 2차 분획물의 높은 농도(50μg/ml 이상의 농도)에서는 β- secretase의 저해활성이 줄어드는 즉, 농도의존적인 bipha- sic effect를 가지고 있었다. 이와 같이 황정의 2차 분획물 들은 BACE 저해활성에 대하여 모두 낮은 IC50값을 나타
Fig. 5. Dose-dependent inhibitory potency of organic solvent- extracts of Polygonatum odoratum fractions to BACE. The assay for inhibitory activity of BACE was performed three times. The curves were fitted using SigmaPlot, yielding IC50 values. Samples A, B, C, and D correspond to CHCl3-, EtOAc-, BuOH-, and water-extracts of Polygonatum odoratum fractions pre-extracted with MeOH, respectively.
낸 것은 황정의 2차 유기용매 추출물에는 β-secretase의 활성을 효율적이면서 강력하게 저해하는 성분이 존재함 을 암시한다.
고 찰
알츠하이머 질환은 점진적으로 인식기능의 장애를 유 발하는 퇴행성 뇌질환으로, 불용성인 β-amyloid의 덩어 리가 반응성이 있는 microglia와 astrocyte에 의해 침윤됨 으로써 세포외부에 축적되어 나타나는 노인반(senile plaque)의 생성이 대표적인 병리학적 특성이다. 노인반은 뇌에서 아밀로이드에 의한 혈관질환을 유발하며, 연속 적인 신경세포의 손상 및 뇌 위축을 야기함으로써 치매 (dementia)를 발병시킨다. 노인반의 형태로 Aβ의 축적이 알츠하이머 병의 가장 중요한 인자 중의 하나로 인식하 고 있기 때문에 Aβ의 독성억제가 알츠하이머 질환 증상 을 통제할 수 있는 중요한 치료법으로서 인식되고 있다.
최근에 발표된 연구논문에 의하면 신경세포에 Aβ에 의 해 유도된 산화적 스트레스가 치매발생의 중요한 원인 중의 하나로 밝혀졌다. 그래서 Aβ의 공격을 차단하는 것이 치매의 증상을 조절하고 치료하는 중요한 접근법 으로 생각하고 있다. 최근에는 제약회사와 대학 및 연구 소에서 치매 치료제의 개발을 위해 약용식물로부터 항 산화 효과를 나타내는 성분을 분리하는 연구가 많이 진 행되고 있다. 이들 중에서 치매의 치료제로서 사용되기 시작한 성분들로는 Ginkgo biloba L15,16)과 Huperzia serrata
Travis들17,18)이 대표적인 경우이다. 이외에 Curcuma longa L 로부터 분리한 curcuminoids 성분19-21) 또한 치매의 치료효 능이 있음이 보고되고 있다.
백합과 식물들 중에는 식용은 물론이며 민간 및 한방 요법에 사용되고 있는 많은 식물들이 존재한다. 본 연구 에서도 이와 같은 연구추세를 반영하여 이미 여러 가지 효능이 알려져 있는 국내에 자생하는 백합과 숙근류로 부터 치매의 치료제로서 가능성이 있으며 부작용이 없 는 성분을 탐색하였다25). 본 실험에서는 이들 식물들 중 에서 황정을 대상으로 치매 예방 또는 치료효능물질을 탐색하기 위하여 Aβ 단백질에 의하여 유발된 PC12 cell 에서의 독성을 억제하는 효능을 평가하였다. 본 연구팀 에서는 백합과 식물들 중에서 소엽맥문동, 각시원추리, 애기원추리, 하늘말나리 및 황정의 메탄올 추출물에는 Aβ peptide에 의해 유도된 신경세포의 손상을 억제하는 효능이 있음을 보고했다.25) 이러한 결과는 이들 백합과 추출물들에는 산화적 손상을 억제하는 효과에 의하여 신경세포를 보호할 가능성이 있는 성분들이 많이 존재 할 것으로 예상하게 한다. 이를 위하여 이들 추출물들에 의한 지질 과산화 억제, 활성산소종의 제거, DNA 손상 회복 및 세포사멸 억제효능 등을 확인함으로써 신경세 포를 보호하는 기작이 규명될 수 있으리라 사료된다.
뇌에서의 노인반(amyloid plaque) 생성은 Alzheimer disease의 중요한 병인으로 알려져 있는데, 이는 뇌 세포 에서 β-secretase가 amyloid precursor protein의 β-site를 절 단함으로써 membrane-bound carboxy-terminal fragment인 C99를 생성시키며, 이와 동시에 γ-secreatase가 C99를 또 다시 절단함으로써 생성된 Aβ가 세포막에 축적됨으로 써 나타나는 현상이다. 따라서 β- 또는 γ-secretase 또는 두 효소 모두의 활성도를 억제하면 Aβ에 기인한 세포독 성이 감소되는 기작이 밝혀졌으며, 궁극적으로는 이 효 소들이 Alzheimer's disease의 치료를 위한 주요한 target으 로 인식되고 있다. 본 연구실에서는 박우진 교수 연구팀 으로부터 분양받은 cell-based β-secretase assay system을 확 립하였으며, 확립된 assay system에 우선적으로 BACE에 대하여 저해활성을 가지고 있으며, peptidomimetic com- pounds로서 알려져 있는 물질(#190, #192, #202)들을 적 용하여 β-secretase의 저해활성을 평가함으로써 BACE inhibitor 탐색에 이용가능성을 확인하였다. 실험 결과
#190와 #192는 2.5와 3.0 M의 IC50값을 나타내었으며, 이들 두 BACE inhibitor에 대한 IC50값을 본 실험에서 positive control로서 사용하였다. #202의 경우에는 적용한 범위의 농도 이내에서는 전혀 β-secretase의 저해활성을 나타내지 않았는데, 이 결과는 #202가 세포막을 통과하
지 못하는 성질에 기인한 것으로 확인되었다.
본 연구결과로부터 백합과에 속하는 황정으로부터 치 매 예방 또는 치료제로서의 개발 가능성이 확인되었다.
이 결과를 바탕으로 치매 예방 또는 치료제로서의 기능 성을 확보하기 위해서는 황정의 유기용매 분획으로부터 유효 단일성분 규명이 필요할 뿐만 아니라, 아밀로이드 베타 단백질의 생성억제 기전을 비롯한 보다 더 세부적 인 기전에 미치는 영향을 연구할 필요성이 요구된다.
결 론
황정의 메탄올 추출물로부터 치매 예방 및 치료 효능 이 있는 단일 성분을 탐색하기 위하여 4종의 유기용매를 이용하여 순차 유기용매 법으로 분획한 성분들에 대하 여 아밀로이드 베타 단백질에 의하여 유발된 신경세포 독성의 억제효능과 β-secretase의 활성 억제 효능 정도를 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1) 황정의 2차 분획물 중에서 EtOAc, BuOH, H2O의 분 획물은 각각 적용한 최대의 농도인 300μg/ml의 농도에 서도 PC12 cell에 대한 독성이 약하거나 나타나지 않았 다. CHCl3 분획물은 25μg/ml농도에서 가장 독성이 강하 게 나타났고, 그 이상의 농도에서는 25μg/ml의 농도에 서 보다는 조금 약한 독성이 나타났다. CHCl3 분획물의 PC12 cell에 대한 IC50값은 25μg/ml로 결정되었다.
2) 황정의 CHCl3 분획물 200μg/ml농도는 1μg/ml의 A
β25-35에 의하여 유발된 PC12 cell에서의 독성을 40% 수준
으로 회복하기는 하였으나 큰 효과를 나타내지는 못하 였다.
3) 황정의 유기용매 분획들은 50μg/ml이하의 농도에 서 β-secretase의 활성을 강하게 억제하였다.
이상의 결과로 보아 황정의 유기용매 분획물에는 아 밀로이드 베타 단백질에 의하여 유도되는 신경세포의 손상을 억제하며 β-secretase의 활성을 저해하는 유효성 분이 존재할 것으로 추정된다.
감사의 글
본 연구는 농림기술관리센터 지원 연구비(ARPC203050- 03-I-CG000)와 2006년도 창원대학교 연구비에 의하여 수 행되었으며, 연구비 지원에 감사드립니다.
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