교신저자 : 최정화, 광주광역시 남구 월산2동 377-13 동신대학교 부속한방병원 안이비인후피부과학교실 (Tel : 062-350-7280, E-mail : [email protected])
∙접수 2007/10/23 ∙수정 2007/11/15 ∙채택 2007/12/04 Otolaryngology & Dermatology 2007;20(3) : 14-28
化氣調經湯이 피부 세포 재생 및 악성 흑색종 세포에 미치는 영향
고홍개 ․ 박수연 ․ 김종한 ․ 최정화 동신대학교 한의과대학 안이비인후피부과학교실
Effects of Hwagi-Jogyeong-Tang (HJT) on Human HaCaT keratinocyte and malignant melanoma cells
Hong-gae Go ․ Su-yeon Park ․ Jong-han Kim ․ Jeong-hwa Choi
Objective : Hwagi-Jokyeong-Tang (化氣調經湯, HJT) was described in DongeuiBogam(東醫寶鑑). This remedy
has been used to treat patients with Naryeok(瘰癧), which is similar as tuberculous cervical lymphadenitis in western medicine.
Methods : In this study, the present author investigated the effects of HJT on on Human HaCaT keratinocyte
and malignant melanoma cells such as SK-MEL-2 and B16F10 in terms of cell viabilities, proliferations, DPPH free radical scavenging activities, oxygen free radical productions and inhibitory action on elastase activities.
Results : HJT acceleated proliferation of HaCaT keratinocytes dose-dependantly. HJT also prevented cell death
of HaCaT induced by Hydrogen peroxide, which products oxygen free radicals. On the contrary, HJT did not affect proliferations of SK-MEL-2 or B16F10. In addition, HJT was shown to have DPPH free radical scavenging activities and also have inhibitory effects on elastase activities too. On the fluorescent examinations, the present author know that HJT did not affect production levels of oxygen free radicals in malignant melanoma cell, SK-MEL-2.
Conclusions : These results suggest that HJT has possibilities of usage for functional cosmetics which have
skin regeneration or prevention from skin tissue injury.
Key word : Hwagi-Jogyeong-Tang
Ⅰ. 서 론
사회가 발전하고 경제 수준이 높아지면서 일반 인들의 건강한 피부와 용모에 대한 관심은 나날이 높아지고 있다. 피부의 노화는 비록 질환은 아니지 만 변화된 외모 때문에 스트레스를 받게 되고, 피 부를 젊고 건강한 상태로 유지하는 것은 각자의 심신을 즐겁게 해줄 수 있기 때문에 신체 및 정신 건강에 활력을 주게된다1,2). 이에 따라 한의학계에 서도 한약재가 피부노화3,4) 및 미백에 미치는 영향 에 대한 연구5-7)가 이루어지고 있으며, 피부 연고 나 화장품 등의 개발을 위한 천연물질의 효과에 대한 실험적 연구8)도 활발하게 진행되고 있다.
化氣調經湯은 瘰癧을 通治하는 처방으로 陳皮, 香附子, 羌活, 白芷, 牡蠣粉, 天花粉, 皂角刺, 甘草 로 구성되어 있으며9,10), 구성 약재들 중 香附子는 항산화 효과가 있는 것으로 밝혀졌고11), 皂角刺는 항균효과가 밝혀졌다12). 또한 최근 化氣調經湯에 관한 연구에서 항산화 효과와 O2-
이온을 생산함으 로 apoptosis를 유발하는 효과 및 항암 효과가 입
증되었다13,14). 하지만 이는 S-180, NIH3T3 세포
주를 이용한 항암 효과 및 작용기전 연구가 주가 되었으며 세포의 재생 및 노화에 관련된 효과를 입증하기 위한 실험은 없었다.
이에 본 저자는 化氣調經湯이 인간 유래 정상 피부 각질 세포인 HaCaT 세포주 및 악성 흑색종 세포주의 증식에 직접적으로 미치는 영향을 확인 하고, 산화적 스트레스를 가한 이후 세포 사멸을 방지할 수 있는지를 확인하고자 하였으며, 아울러 엘라스틴 분해효소의 저해활성을 관찰하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
Ⅱ. 재료 및 방법 1. 재료
1) 약재의 준비
실험에서 사용한 化氣調經湯은 《東醫寶鑑》10)에 수록된 내용, 즉 “橘皮二兩, 香附子酒浸製, 羌活, 白芷各一兩, 牡蠣粉, 天花粉, 皂角刺, 甘草 各五錢.
右爲末, 每二錢, 淸酒調下日三”에 준하였으며, 사 용된 약재는 동신대학교 광주한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다(Table 1).
Table 1. Composition of Hwagi-Jogyeong-Tang (HJT).
Herbal Name Scientific Name Dose(g)
橘皮 Citri Pericarpium 80
香附子(酒浸製) Cyperi Rhizoma 40
羌活 Rhizoma seu radix notopterygii 40 白芷 Angelicae dahuricae Radix 40
牡蠣粉 Concha Ostreae 20
天花粉 Trichosanthis Radix 20
皂角刺 Spina Gleditsiae 20
甘草 Glycyrrhizae Radix 20
Total Amount 280
2) 세포주
인간 유래 정상 피부 각질 세포인 HaCaT 세포 주는 서울대학교 의과대학 피부과학교실에서 제공 받아 실험에 사용하였다. 인간 유래 악성 흑색종 세포주인 SK-MEL-2와 생쥐에서 유래한 악성 흑색 종 세포주인 B16F10은 한국 세포주 은행(서울, 한 국)으로부터 냉동상태로 구입하여 사용하였다.
3) 시약 및 기기
세포내 자유 산소라디칼 생성 양상 관찰을 위한 약물인 2,7-dichloro -fluorescein diacetate (DCFH- DA), 엘라스틴 분해 효소 1(PPE1, Elastase, Pancreatic type 1 from porcine pancreas)과 4(PPE4, Elastase Pancreatic type IV from porcine pancreas) 및 N-Succ-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide
및 Tris-HCl 등의 기타 시약은 Sigma(St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였다. 측정을 위해 사용된 기기는 분광광도계(U-2800, Hitachi, Japan), Micro-plate reader(Bio-rad, CA. USA), 분쇄기 (DIAX 600, Heidolph, Germany), 원심 분리기 (VS-15000CFN, Vision, 한국), 형광 현미경 (Olympus, Japan)등이었다.
2. 실험방법
1) 열수 추출물 조제
化氣調經湯 280 g에 1차 증류수 1500 ㎖ 첨가 하여 전기약탕기(대웅, 한국)로 3시간 전탕한 후, 減壓 加溫法을 이용하여 건조 분말을 제조하였다.
얻어진 분말은 실험에 사용하기 위하여 3차 증류 수에 다시 녹인 후, 2000 rpm에서 15분간 원심분 리로 얻어진 상층액은 와트만 지로 거른 다음 최 종적으로 0.22 ㎛크기의 필터(Syringe filter, Whatman)로 걸러 멸균을 대신하였다.
2) 세포주 배양 환경
HaCaT 세포주의 생육 배지로는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco) 배지 에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco LOT.
NO. 1006842)와 penicillin-streptomycin(100 units/㎖, 100 ㎍/㎖)을 첨가하여 사용하였고, 악성 흑색종 세포주인 SK-MEL-2와 B16F10 세포주의 생육 배지로는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, Sigma, R4130) 배지를 사용하였으 며, 배지에는 10% fetal bovine serum (Gibco LOT. NO. 1006842, FBS)와 penicillin -streptomycin(100 units/㎖, 100 ㎍/㎖)을 첨가하 였다. 모든 세포주는 5% CO2가 공여되는 배양기 속에서 37℃를 유지하며 배양되었다.
3) 세포 생존율 측정
HaCaT Cell line 및 SK-MEL-2, B16F10 Cell line의 세포 생존율은 Trypan blue exclusion assay15)을 사용하여 측정하였다. 먼저 측정에 사용 하고자 하는 세포주를 세포 배양용 6-well plate(TPP, Netherlands)에 각 well당 5×104개의 분량으로 분주 하고, 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다. 24시간의 배양이 끝난 후, 상기한 방법으로 제조된 化氣調經湯 추출물을 최종 농도 1000 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 125 ㎍/
㎖, 62.5 ㎍/㎖이 되게 배양액에 희석하여 부착 및 안정화된 세포주에 공급하고, 24시간 동안 배양하였 다. 24시간이 지난 후, 세포계수기 (Hematocytometer, Marienfeld, Germany)를 이용하여 생존, 사멸 세 포의 개수를 측정하였다.
4) 세포 증식률 및 세포 독성 측정
Highly water-soluble tetrazolium salt를 사용 하여 살아있는 세포를 정량하는 방법16)을 사용하였 다. 먼저 96-well plate에 측정하고자 하는 대상 세포주를 5×103개의 분량으로 분주하고, 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다. 24시간의 배양이 끝난 후, 상기한 방법으로 제조된 化氣調經 湯 추출물을 최종 농도 1000 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 125 ㎍/㎖, 62.5 ㎍/㎖이 되게 배양액 에 희석하여 부착 및 안정화된 세포주에 공급하고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 동안의 배양이 끝난 후, 각 well당 10 ㎕의 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan) 용액을 첨가하고 3시간 동안 방치하였다. 3시간 후, Micro-plate reader를 이용하여 450 ㎚파장에서 흡광도를 측정하였다.
5) 산화적 스트레스에 대한 HaCaT 세포주의 반응성 측정
과산화수소를 사용하여 HaCaT 세포주의 산화적 스트레스에 대한 반응성을 측정17)하였다. 먼저 96-well plate에 측정하고자 하는 대상 세포주를
well당 5×103개의 분량으로 분주 하고, 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다. 24시간의 배양이 끝난 후, 과산화수소를 최종 농도 50 μM 과 100 μM 농도가 되도록 배양액에 희석하여 투 여하고, 각각 30분, 60분, 120분, 240분 동안 반응 시킨 다음, 각 well당 10 ㎕의 CCK-8 용액을 첨 가하고 3시간 동안 방치하였다. 3시간 후, Micro-plate reader를 이용하여 450 ㎚파장에서 흡광도를 측정하였다.
6) 산화적 스트레스에 대한 약물의 HaCaT 세포주 보호 효과 측정
化氣調經湯 추출물이 과산화수소에 의한 산화적 스트레스로 인하여 HaCaT 세포의 사멸을 방지할 수 있는지를 관찰하기 위하여 O'Toole 등18)의 방 법을 응용하여 실험을 진행하였다. 먼저 96-well plate에 측정하고자 하는 대상 세포주를 well당 5×103개의 분량으로 분주하고, 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다. 24시간의 배양이 끝난 후, 최종 농도 125 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖로 희석 된 化氣調經湯 추출물을 HaCaT 세포주에게 투여 하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간의 배양이 끝나고, 化氣調經湯 추출물이 함유된 배양액을 깨 끗이 제거한 후, 최종 농도 100 μM의 과산화수 소를 함유한 배양액을 투여하고 2시간 동안 방치 하였다. 2시간이 지난 후, 과산화수소가 함유된 배 양액을 깨끗이 제거하고, 각 well당 10 ㎕의 CCK-8 용액을 첨가하고 37℃, 5% CO2가 공여되 는 환경에서 3시간 동안 방치하였다. 3시간 후, Micro-plate reader를 이용하여 450 ㎚파장에서 흡광도를 측정하였다. 인간 유래 정상 피부 각질 세포에 대한 化氣調經湯 추출물의 산화적 스트레스 방지에 대한 실험의 개요를 Fig. 1에 개괄적으로 제시하였다.
Fig. 1. Experimental schedule for protective effects of HJT against oxidative stress induced by hydrogen peroxide in human HaCaT keratinocytes
5×10
3cells for well were seeded into 96-well plate and incubated at 37℃ for 24 hr. After incubation, indicated concentration of HJT was added and re-incubated for 24 hr. After incubation, cells were washed with PBS and added with 100 μM of hydrogen peroxide, then incubated for 2 hr. After 2 hr, cells were washed and added with 10 ㎕ of CCK-8 sol and incubated for 3 hr. Finally, Optical Densities(OD) were measured using micro-plate reader at 410 ㎚ wavelength.
7) DPPH(α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl) 라 디칼 소거능 측정
化氣調經湯 추출 분말을 에탄올에 녹인 다음, 원 하는 농도로 희석하면서 자유 산소기 제거 효과를 측정하였다19). 측정법을 간단히 소개하자면, 100 μM 농도의 DPPH와 농도별 추출물을 각각 100
㎕씩 취하여 혼합하여, 30분간 빛을 차단하고 방치 한 후 잔존 radical 농도를 ELISA Reader (Bio-rad, USA)를 이용하여 517 ㎚에서 측정하였 다. 시료의 환원력의 크기는 라디칼 소거활성 (Scavenging activity)으로 표시하며, RC50 (Reduce Concentration 50%)은 DPPH 농도가 1/2로 감소 하는데 필요한 시료의 양(㎍)으로 나타냈으며 항산 화 물질로 잘 알려진 Vitamin C (ascorbic acid) 와 비교하여 활성을 나타냈다. 계산 공식은 다음과 같다.
DPPH radical scavenging activity(%) = (Ac-As)/Ac × 100
Ac : 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도
As : 시료를 첨가한 실험군의 흡광도
8) 엘라스틴 분해효소 저해 활성 측정
엘라스틴 분해효소(Elastase) 저해 활성은 James 등20)의 방법으로 측정하였다. 먼저 0.2 M의 Tris-HCl (Sigma, USA) buffer를 pH 8.0으로 적 정하여 만든 후, 600 ㎕를 tube에 옮긴 후, 3.3 μM로 희석한 Succ-Ala-Ala-Ala- p-nitroanilide 250 ㎕를 첨가하고, 거기에 농도별로 희석된 化氣 調經湯 추출물 60 ㎕를 넣어준 후, 1 ㎍/㎖로 희석 된 Porcine pancreatic elastase 제 1형과 4형을 각각 10 ㎕씩 넣어주고, 실온에 15분간 방치한 후, p-nitroanilide의 생성량을 Micro-plate reader를 이용하여 410 ㎚파장에서 측정하였다. Elastase 저 해 활성은 다음 식에 따라 계산되며, IC50
(Inhibitory Concentration 50%)은 Elastase의 기 질을 50% 저해하는데 요구되는 시료의 농도 (㎍/
㎖)로 표시하였다.
Elastase inhibition (%) =
[1 - {(B - C)/(A - D)}] × 100
A: 시료 대신 증류수를 넣고 효소를 첨가하여 반응한 후의 흡광도
B: 효소를 첨가하여 반응한 후의 시료의 흡광도 C: 효소 대신 증류수를 첨가하여 반응한 후의 시료의 흡광도 D: 시료와 효소 대신 각각 증류수를 첨가해 반응한 후의
흡광도
9) 악성 흑색종 세포의 자유 산소 라디칼 생 성 양상 관찰
악성 흑색종 세포주인 SK-MEL-2를 세포 배양 용 8 well permanox slide (w/cover, NUNC)에 5×104개씩 분주하고, 4시간 동안 37℃에서 배양 하여 세포를 부착 시켰다. 세포의 부착이 끝난 후, DMSO에 녹여진 2',7'-dichloro -dihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA, Sigma)를 최종 농도 50 μ M로 각각의 well에 분주하고 45분간 배양하여 DCFH-DA가 세포 내로 흡수되도록 하였다21). 45 분간의 배양이 끝난 다음, 배양액을 제거하고 PBS
로 수세한 후, 약물을 최종 농도 250 ㎍/㎖, 500
㎍/㎖, 1000 ㎍/㎖, 2000 ㎍/㎖로 각 well에 처리 하고 30분간 배양 하였다. 30분간의 배양이 끝난 후, 배양액을 제거하고, PBS로 수세하였다. 자유 산소 라디칼의 생성양상은 DCF가 발하는 녹색의 형광을 형광 현미경으로 관찰하였다.
3. 통계 처리
실험 자료에 대한 통계적 분석은 SAS(The SAS System for Windows, ver. 6.12, SAS Institute, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편 차 (mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군 간 평 균의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검 정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있 는 것으로 판정하였다.
Ⅲ. 실험성적
1. HaCaT 세포의 생존율에 미치는 영향
60 70 80 90 100 110
0 62.5 125 250 500 1000
ug/ml
Cell Viability (%).
#
Fig. 2. Effects of HJT on cell viability in HaCaT keratinocyte
5×10
4HaCaT cells were seeded in 6-well plate and incubated for 24 hr. After incubation, HJT was added into each well in various concentration and cells were incubated for 24 hr again, then live and dead cell numbers were measured using Trypan blue exclusion assay. Values are represented as mean ± SD of three experiments which were carried out independently.
HaCaT에 대한 열수 추출물의 세포 독성은 고농
도인 1000 ㎍/㎖ 농도까지 나타나지 않았다. 농도 에 관계없이 모든 군에서 90%가 넘는 세포 생존 율을 보여 유의한 세포 독성은 없는 것으로 나타 났다 (Fig. 2).
2. HaCaT 세포의 증식률에 미치는 영향 化氣調經湯 추출물의 농도에 비례하여 HaCaT 세포의 증식률이 향상되는 것이 관찰되었다. 化氣 調經湯 추출물을 62.5 ㎍/㎖ 농도로 처리한 경우 HaCaT 세포의 증식률은 증가하는 경향을 보였으 나 통계적으로 유의하지는 않았다. 그러나, 125 ㎍ /㎖에서부터는 통계적으로 유의한 수준의 증식률의 향상을 관찰할 수 있었다. 1000 ㎍/㎖ 농도로 처 리한 경우의 증식률은 化氣調經湯 추출물을 처리하 지 않은 군보다 18%이상 증식률이 향상되었다 (Fig. 3).
90 100 110 120 130
0 62.5 125 250 500 1000
ug/ml
C ell P ro lif e ra tio n (% )
*
** **
**
Fig. 3. Effects of HJT on proliferation of HaCaT keratinocyte
5×10
3HaCaT cells were seeded in 96-well plate and incubated for 24 hr. After incubation, HJT was added into each well in various concentration and cells were incubated for 24 hr again, then Optical Density of each wells were measured using micro-plate reader.
Values are represented as mean ± SD of three experiments which were carried out independently.
* : P < 0.05,
** : P < 0.01 as compared to non-treated group.
3. HaCaT 세포주에 산화적 스트레스가 미치 는 영향
최종 농도 50 μM의 과산화수소를 처리한 경 우, 처리한 시간에 관계없이 HaCaT 세포의 생존 율은 영향을 받지 않았다. 최종 농도 100 μM의 과산화수소를 30분 또는 60분 동안 처리한 경우에 도 HaCaT 세포주에 대한 특별한 세포독성은 관찰 할 수 없었다. 그러나 최종 농도 100 μM의 과산 화수소를 2시간 이상 처리한 경우 통계적으로 유 의한 세포 생존율의 감소가 관찰되었다 (Fig. 4).
60 70 80 90 100 110 120 130
0 30 60 120 240
min
C y to to x ic ity (%) .
50uM 100uM
# #
Fig. 4. Cytotoxic effects of Hyrogen peroxide as a pro-oxidant on HaCaT keratinocyte
5×10
3HaCaT cells were seeded in 96-well plate and incubated for 24 hr. After incubation, Hydrogen peroxide was added into each well in indicated concentration and cells were incubated for various times, then Optical Density of each wells were measured using micro-plate reader. Values are represented as mean ± SD of three experiments which were carried out independently.
# : P < 0.05 as compared to non-treated group.
4. 산화적 스트레스에 의한 HaCaT 세포주 사 멸 보호 효과
125 ㎍/㎖ 및 250 ㎍/㎖의 化氣調經湯 추출물만 을 처리한 경우에는 약물을 처리하지 않은 경우에 비하여 10% 이상 증식률를 향상시켰다. 化氣調經 湯 추출물을 처리하지 않고 과산화수소만을 처리
한 군은 약물을 처리하지 않은 군에 비하여 살아 있는 세포의 개수가 22%정도 감소된 것으로 나타 났다. 125 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖의 化氣調經湯 추출물 을 처리하고 과산화수소로 산화적 스트레스를 유 발한 모든 군에서 효과적인 HaCaT 세포주의 사멸 보호 효과를 관찰할 수 있었다 (Fig. 5).
70 80 90 100 110 120
HJT H2O2 HJT+H2O2 0
C e ll N u m b e r (% ) HJT 250 ug/ml
HJT 500 ug/ml
* *
Fig. 5. Protective effects of HJT against oxidative stress induced by hydrogen peroxide in human HaCaT keratinocytes
5×10
3HaCaT cells were seeded in 96-well plate and incubated for 24 hr. After incubation, 125 ㎍/㎖ of HJT was added in each well and re-incubated for 24 hr. After washing, 100 μM of Hydrogen peroxide was added and cells were incubated for 2 hr, then Optical Densities were measured using micro-plate reader.
Values are represented as mean ± SD of three experiments which were carried out independently.
* : P < 0.05 as compared to non-treated group.
5. SK-MEL-2의 증식에 미치는 영향
인간에게서 유래한 악성 흑색종 세포인 SK-MEL-2에 대하여 化氣調經湯 추출물을 각각의 농도별로 1000 ㎍/㎖까지 처리한 결과, 모든 농도 에서 통계적으로 유의한 증식률의 감소 또는 증가 는 관찰되지 않았다. 500 ㎍/㎖ 및 1000 ㎍/㎖의 化氣調經湯 추출물을 처리한 군의 증식률은 각각 6%, 3%씩 증식률을 낮추었지만 통계적으로 유의 하지는 않았다 (Fig. 6).
80 90 100 110
0 62.5 125 250 500 1000 ug/ml
C e ll P ro life ra tio n ( % )
Fig. 6. Effects of HJT on proliferation of melanoma cell, SK-MEL-2
5×10
3SK-MEL-2 cells were seeded in 96-well plate and incubated for 24 hr. After incubation, HJT was added into each well in various concentration and cells were incubated for 24 hr again, then Optical Density of each wells were measured using micro-plate reader. Values are represented as mean ± SD of three experiments which were carried out independently.
80 90 100 110
0 62.5 125 250 500 1000
ug/ml
C e ll P ro lif e ra tio n ( % )
Fig. 7. Effects of HJT on proliferation of melanoma cell, B16F10
5×10
3B16F10 cells were seeded in 96-well plate and incubated for 24 hr. After incubation, HJT was added into each well in various concentration and cells were incubated for 24 hr again, then Optical Density of each wells were measured using micro-plate reader.
Values are represented as mean ± SD of three experiments which were carried out independently.
6. B16F10의 증식에 미치는 영향
생쥐에서 유래한 악성 흑색종 세포인 B16F10에
대하여 化氣調經湯 추출물을 각각의 농도별로 1000 ㎍/㎖까지 처리한 결과, 모든 농도에서 통계 적으로 유의한 증식률의 감소 또는 증가는 관찰되 지 않았다. 1000 ㎍/㎖의 化氣調經湯 추출물을 처 리한 군의 증식률은 아무것도 처리하지 않은 군의 증식률과 거의 동일 하였다 (Fig. 7).
7. DPPH 자유 라디칼 소거능
化氣調經湯 추출물 자체가 가지는 항산화효과를 확인하기 위하여 DPPH 자유 라디칼 소거능을 관 찰하였다. 최고 농도 1000 ㎍/㎖ 에서부터 1/2 희 석법을 적용하면서 DPPH 자유 라디칼의 제거 효 과를 살펴본 결과, 농도에 비례하여 DPPH 자유 라디칼 소거능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
RC50값은 911.4로 비교적 고농도로 처리하여야 도 달할 수 있었다. 대조군으로 사용한 Vitamin C 는 62.5 ㎍/㎖에서 90%가 넘는 DPPH 자유 라디칼 소거능을 보였다 (Fig. 8).
Fig. 8. DPPH free radical scavenging activity by HJT
HJT was extracted in ethanol at room temperature for 4 hr. Diluted samples were added in DPPH solution dissolved in ethanol respectively. Free radical scavenging activities by HJT were measured using micro-plate reader at 517 ㎚ wavelength. Optical densities were calculated indicated formular as described in materials and methods. To compare the scavenging ability, Vitamin C, known as anti-oxidant, was used as positive control. Values are represented as mean ± SD of three independent experiments.
8. 제 1형 Elastase 저해 활성에 미치는 영향 化氣調經湯 추출물의 제 1형 엘라스틴 분해효소 에 대한 저해능은 125 ㎍/㎖에서 1000 ㎍/㎖까지 모든 처리군에서 30%정도의 경미한 저해 활성을 보였다. RC50값은 구할 수 없었다 (Fig. 9).
10 20 30 40
125 250 500 1000
ug/ml Inhibition Rates of Elastase I (%)
Fig. 9. Inhibitory Effects of HJT on type I elastase activity
HJT was added into elastase I in indicated concentrations. Inhibition rates of elastase I by HJT were measured as production of p-nitroanilide using micro-plate reader at 410 ㎚ wavelength. Optical Densities were calculated indicated formular as described in materials and methods. Values are represented as mean ± SD of three independent experiments.
10 20 30 40 50 60
125 250 500 1000
ug/ml Inhibition Rates of Elastase IV (%)
Fig. 10. Inhibitory Effects of HJT on type IV elastase activity
HJT was added into elastase IV in indicated
concentrations. Inhibition rates of elastase IV by HJT
were measured as production of p-nitroanilide using
micro-plate reader at 410 ㎚ wavelength. Optical
Densities were calculated indicated formular as
described in materials and methods. Values are
represented as mean ± SD of three independent
experiments.
Fig. 11 Effects of HJT on oxygen free radical production in melanoma cells
After 5×10
4cells were suspended in culture medium and were attached in 8 well slide for 4 hr then, 50 μM of 2,7-dichloro -fluorescein diacetate dissolved in DMSO was added for 45 min. After incubation, HJT was added into each well at the increasing concentration of 0, 125, 250, 500 and 1000 ㎍/㎖ for 30 min. For comparison, 50 μM of Hydrogen peroxide was added for 30 min. Fluoresence was observed using fluoresence microscopy. (A) None treated group, (B), 125 ㎍/㎖ of HJT treated group, (C) 250 ㎍/㎖ of HJT treated group, (D) 500 ㎍/㎖ of HJT treated group, (E) 1000 ㎍/㎖ of HJT treated group, (F) 50 μM of Hydrogen peroxide treated group.
9. 제 4형 Elastase 저해 활성에 미치는 영향 제 4형 엘라스틴 분해효소에 대한 저해능은 제 1형 엘라스틴 분해효소에 대한 작용에 비해 더 뛰 어난 활성을 보였다. 125 ㎍/㎖에서 25%의 저해 활성을 보였고, 농도에 비례하여 증가되는 저해활 성을 보였다. 제 4형 Elastase에 대한 저해활성의 RC50값은 676.1 ㎍/㎖이었다 (Fig. 10).
10. SK-MEL-2의 자유산소라디칼 생성양상에 미치는 효과
化氣調經湯을 처리하지 않은 대조군에서는 악성 흑색종 세포의 생존에 필요한 기본적인 소량의 자 유 산소 라디칼 생성이 관찰 되었다. 여기에 化氣 調經湯를 처리한 결과, 化氣調經湯 추출물의 농도 에 관계없이 특별한 자유산소 라디칼의 생성 증가 나 감소는 관찰되지 않았다. 化氣調經湯을 처리한 모든군에서, 50 μM 의 Hydrogen peroxide를 처 리한 경우보다 발현양이 적게 나타났다 (Fig. 11).
Ⅳ. 고 찰
⟪素問 ․ 痿論⟫22)에서는 “肺主身之皮毛 脾主身 之肌肉”이라 하여 皮膚肌肉은 肺脾와 밀접한 관련 이 있음을 논하였다. 또한 皮膚病의 原因과 轉變에 대해 《諸病源候論》23)에서도 “內熱則脾氣溫 脾氣 溫則肌肉生熱也 濕熱相搏 故頭面身體皆生瘡”이라 하여 瘡腫의 발생 기전에 대하여 언급하였다. ⟪ 靈樞․大惑論篇⟫22)에서는 “此人腸胃大而皮膚濕 而 分肉不解焉 腸胃大則衛氣留久 皮膚濕則分肉不解”
라 하여 皮膚疾患과 腸胃가 밀접한 관계가 있음을 설명하였다. 이처럼 피부는 한의학적으로 肺와 脾 기능과 밀접하게 연관된 정체적 개념으로 인식하 였다.
化氣調經湯의 약물 구성을 살펴보면, 理氣健脾, 燥濕化痰하는 橘皮, 理氣解鬱, 調經止痛하는 香附 子, 發散風寒, 祛風濕止痛하는 羌活, 祛風解毒, 消 腫止痛하는 白芷, 軟堅散結, 潛陽固澁하는 牡蠣粉, 淸熱生津, 消腫排膿하는 天花粉, 消腫排膿 治風殺
蟲하는 皂角刺, 補脾益氣, 淸熱解毒, 調和諸藥하는 甘草로 구성되어, 祛風解毒, 理氣, 消腫散結하는 처 방임을 알 수 있다24). 또한 구성 약재들 중 香附子 는 항산화 활성이 있는 것으로 알려져 있고11), 皂 角刺는 항균활성이 알려져 있어11), 이러한 약재 구 성으로 볼 때, 肝氣鬱結, 痰飮氣滯가 원인인 瘰癧
25) 뿐만 아니라, 氣滯 및 濕痰結聚를 원인으로 하
는 암26,27)에도 효과적일 것으로 생각된다.
化氣調經湯에 대한 현대적인 연구에 대하여, 유
13) 등은 항산화 효과와 O2-
이온을 생산함으로 apoptosis를 유발하는 효과를 입증하였고, 김14) 등 은 복강 고형암 세포에 대한 항암 작용이 있음을 보고 하였다. 그러나 선행 연구는 S-180, NIH3T3 세포주를 이용한 항암 효과 및 작용기전에 대한 연구가 주가 되었으며 化氣調經湯의 세포 재생 및 노화에 관련된 효과를 입증하기 위한 실험은 없었 다. 이에 본 저자는 化氣調經湯에 대하여 피부 재 생 및 노화에 대하여 과학적 검증을 통해 작용 기 전을 규명하기 위하여 본 연구를 기획하였다.
본 연구에서 사용한 인간 유래 정상 피부 각질 세포인 HaCaT 세포는 인간의 피부 진피층에서 유 래한 세포로 무한분열이 가능하도록 일부 변형되 었으나 정상 피부 조직 양상을 나타낸다28). 또한, 인간 유래의 악성 흑색종 세포인 SK-MEL-2는 60 세 남성의 허벅지 피부에서 분리해낸 악성 흑색종 (malignant melanoma) 세포이며29), B16F10은 생 쥐 유래 악성 흑색종 세포 중의 하나로 피부과 실 험에서 가장 다용되는 세포주 들이다30).
化氣調經湯 추출물의 HaCaT 세포 보호 효과를 관찰하기에 앞서, 化氣調經湯 추출물이 인간 유래 정상 피부 각질 세포의 생존율에 특별한 영향을 미치지 않고 어떤 특정한 효과를 기대할 수 있는 적정 용량을 찾기 위하여 Trypan Blue exclusion assay를 시행 하였다. 그 결과 化氣調經湯 추출물 은 1000 ㎍/㎖의 고농도까지 특별한 세포 독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 일반적으로 단일
추출물을 통한 세포 독성 유발 농도보다 더 높은 농도에서도 세포 독성을 나타내지 않았다고 해석 할 수 있다31-33).
이러한 결과를 바탕으로 化氣調經湯 추출물이 HaCaT 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보았다.
본 논문의 결과를 보면, 저 농도인 62.5 ㎍/㎖의 化氣調經湯 추출물은 인간 유래 정상 피부 각질 세포의 증식을 도와주는 현상을 보였으나, 통계적 으로 유의하지는 않았다. 그러나 125 ㎍/㎖ 이상의 중, 고 농도에서는 化氣調經湯 추출물의 농도에 비 례하여 HaCaT 세포의 증식률을 향상시켰다 (Fig.
3). 이러한 결과로부터 본 저자는 化氣調經湯 추출 물이 정상 피부 각질세포의 증식을 도와 줄 수 있 어, 궁극적으로 피부 재생 효과를 발휘할 수 있을 것으로 생각했다.
산화적 스트레스 (Oxidative stress)와 활성 산소 (Reactive Oxygen Species)는 인체에서 발생하는 거의 모든 병의 발생과 진행에 관여한다. 특히 피 부 세포의 노화, 유전적 변형에는 가장 중요한 병 리적 요소로 알려져 있다34). 실제로 실험을 통하여 UV조사에 의하여 인간 피부 세포로부터 활성 산 소가 발생하고, 몇 가지 기전을 거쳐 DNA에 손상 을 미치는 것이 알려져 있다35). 인간 유래 정상 피 부 각질 세포의 산화적 스트레스에 대한 化氣調經 湯 추출물의 보호효과를 확인하기에 앞서, HaCaT 세포주에 적절한 산화적 스트레스를 가하기 위하 여 과산화수소의 용량과 시간에 따른 HaCaT 세포 주의 반응성을 살펴보았다. 본 연구의 결과에서 과 산화수소 100 μM 이상의 농도를 2시간 이상 유 지 해줘야 HaCaT 세포주의 생존율에 영향을 미칠 수 있음을 확인 하였고, 이러한 결과로부터 본 저 자는 HaCaT 세포주에 대해 가장 적절한 산화적 스트레스 유발을 위한 농도와 시간은 100 μM의 2시간 처치라 판단하였다 (Fig. 4).
이러한 판단을 근거로 化氣調經湯 추출물이 과 산화수소에 의하여 발생하는 산화적 스트레스로부
터 인간 유래 정상 피부 각질 세포를 보호 해 줄 수 있는지 알아보기 위하여 이전의 실험을 통해 임의로 결정한 250 ㎍/㎖ 및 500 ㎍/㎖ 농도의 化 氣調經湯 추출물을 각각 전처리 한 다음, 100 μ M의 과산화수소를 2시간 동안 처리한 후, 세포 생 존율을 관찰하였다. 化氣調經湯 추출물을 처리한 군은 아무것도 처리하지 않은 군에 비하여 10%이 상 증식률의 증가를 나타내어, 化氣調經湯 추출물 의 농도에 따른 증식률 조사와 유사한 결과를 보 였다. 또한, 化氣調經湯 추출물을 처리하지 않은 군에서는 과산화수소에 의한 세포 생존율 저하가 나타났다. 이러한 산화적 스트레스에 의한 세포 생 존율 저하를 250 ㎍/㎖ 및 500 ㎍/㎖의 化氣調經 湯 추출물 모두에서 통계적으로 유의하게 방지함 을 관찰 할 수 있었다. 이러한 결과로부터 化氣調 經湯 추출물은 인간 정상 피부 각질 세포의 증식 을 돕고 산화적 스트레스에 의한 손상을 방지해 줄 수 있을 것으로 사료된다(Fig. 5).
자유 산소라디칼은 생체 내의 산화적 스트레스 를 일으키는 주요 원인 중 하나이다36). 이러한 자 유 산소라디칼에 대한 제거 효과는 궁극적으로 피 부 미백, 노화 방지 뿐 만 아니라 정상 세포의 사 멸을 보호하는 효과를 가지게 된다37). 그러므로 본 연구에서는 化氣調經湯 추출물 자체가 가지는 DPPH 자유 라디칼 소거능을 알아보았다. 본 실 험 결과에서 化氣調經湯 추출물은 항산화 효과가 있음을 확인하였다. Vitamin C 보다는 훨씬 못 미 치는 결과를 보였지만, Vitamin C는 단일 성분의 추출물임을 감안 할 때, 복합 성분인 化氣調經湯 추출물은 항산화 기능이 있음을 알 수 있었다 (Fig. 8).
化氣調經湯 추출물이 HaCaT 세포의 증식을 활 성화하고 산화적 스트레스를 방지하는 현상이 피 부 유래 암세포에서도 동일하게 발생하는지를 확 인하기 위하여 인간 및 생쥐로부터 유래한 악성 흑색종 세포에 대하여 반응성을 관찰 하였다. 먼저
인간 유래 악성 흑색종 세포인 SK-MEL-2에 대한 결과를 살펴보면, 저농도에서는 HaCaT 세포에서 보이던 증식 항진 효과가 나타나지 않았다. 또한, HaCaT 세포에서는 통계적으로 유의한 증식률 항 진을 보이던 125 ㎍/㎖ 이상의 용량에서도 통계적 으로 유의한 증식의 항진작용을 관찰 할 수 없었 다 (Fig. 6). 생쥐 유래 악성 흑색종 세포에 대한 化氣調經湯 추출물의 작용을 살펴본 결과, 化氣調 經湯 추출물은 저농도, 고농도에서 B16F10세포에 대해 특별한 독작용이나 증식 항진 작용을 나타내 지 않았다 (Fig. 7). 이러한 결과들을 정리해 보 면, 化氣調經湯 추출물은 인간 유래 정상 피부 각 질 세포의 증식률은 향상시키나, SK-MEL-2 및 B16F10의 두 종의 악성 흑색종 세포에 대해서는 증식률의 향상을 관찰 할 수 없었다. 이러한 결과 들은 化氣調經湯이 매우 효율적이면서 안전하게 피 부 재생 효과를 발휘할 수 있는 강력한 근거라 생 각된다.
Elastase는 엘라스틴을 분해하는 효소이며38), 엘 라스틴은 진피 내에서 피부 탄력을 유지하는데 매 우 중요한 역할을 하는 단백질의 일종이다39). 또한 Elastase는 피부 주름 억제, 피부 탄력 유지에 또 하나의 중요한 요소인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이기도 하다40) 따라서 Elastase의 저해는 피부 주름 억제 및 피부 탄력 유지의 작용을 나타낸다고 할 수 있으며41), 대표적 인 저해제로는 Ursolic acid가 알려져 있다42). 본 연구에서는 몇가지 Elastase 중 가장 중요한 제 1 형과 제 4형 Elastase에 대하여 化氣調經湯 추출물 의 활성 억제효과를 관찰하였다. 본 연구의 결과에 서 化氣調經湯 추출물은 Elastase type 1에 대하여 매우 경미한 억제 효과를 나타내는데 그쳤으나 (Fig. 9), Elastase type 4에 대하여는 일정한 수준 의 활성 억제 효과를 나타내었다 (Fig. 10). 이러 한 결과로부터 저자는 化氣調經湯으로부터 피부 주 름억제 효과 및 피부 탄력의 유지를 기대할 수 있
는 가능성을 발견하였고, 추후 이러한 가능성은 여 러 가지 추출법과 다양한 제형을 통하여 다각적으 로 연구되어져야 할 것이라 생각된다.
자유 산소 라디칼은 세포 사멸을 일으키기도 하 며, 세포의 활성을 증가시키기도 하는 양면성을 지 니고 있다43,44). 따라서 化氣調經湯 추출물이 인간 유래 악성 흑색종 세포의 생리 활성도에 미치는 영향을 유추해 보기 위하여 자유 산소 라디칼 생 성 양상을 관찰하였다. 자유 산소 라디칼 생성 양 상은 형광 현미경으로 관찰하였는데, 그 결과 化氣 調經湯 추출물은 처리 농도와 관계없이 특별한 자 유 산소 라디칼 생성의 증가 및 감소는 없는 것으 로 관찰 되었다 (Fig. 11A～E). 절대적인 자유 산 소 라디칼의 생성량을 비교하기 위하여, 50 μM의 과산화수소를 처리하고 자유 산소 라디칼 생성 양 상을 관찰하였다 (Fig. 11F). 발현 양상을 비교해 보면, 化氣調經湯 추출물의 농도에 관계없이 모든 처리군에서 50 μM의 과산화수소 처리군에 비하 여 자유 산소 라디칼의 생성량이 적었다. 50 μM 의 과산화수소 처리에 의하여 HaCaT 세포에 산화 적 스트레스에 의한 세포 독성을 발휘하지 못하였 다는 사실을 감안 할 때, 악성 흑색종 세포의 증 식률에 특별한 영향을 미치지 않았던 것과 일치하 는 결과라 생각되며, 化氣調經湯은 악성 흑색종 세 포의 증식률에 특별한 영향을 미치지 않을 뿐 아 니라 활성도에도 특별한 영향을 미치지 않을 것으 로 생각된다.
이상을 정리하면 化氣調經湯 추출물은 인간 유 래 정상 피부 각질 세포에 대하여 농도에 비례하 는 증식률의 증가를 보였고, 산화적 스트레스에 의 한 손상을 방지 해줌으로써 피부 재생의 효능에 대한 가능성을 보였고, 엘라스틴 분해효소의 작용 을 억제함으로써 피부 탄력 유지에 대한 가능성도 보였다. 악성 흑색종 세포에는 인간 유래 정상 피 부 각질 세포에서 보이던 증식 항진 작용이 나타 나지 않았다. 이러한 결과들로부터 저자는 化氣調
經湯이 피부 재생 및 피부 손상 방지 등의 피부과 적 용도로 사용될 수 있는 가능성을 제시하는 바 이다.
Ⅴ. 결 론
化氣調經湯 추출물이 인간 유래 정상 피부 각질 세 포 및 악성 흑색종 세포에 미치는 영향을 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1. 1000 ㎍/㎖의 고농도까지 인간 유래 정상 피부 각 질 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았다.
2. 농도에 비례하여 인간 유래 정상 피부 각질 세포의 증식률을 증가시켰다.
3. 산화적 스트레스에 의한 인간 유래 정상 피부 각질 세포의 사멸을 방지하였다.
4. 인간 유래 악성 흑색종 세포의 증식률에는 영향을 미치지 않았다.
5. 생쥐 유래 악성 흑색종 세포의 증식률에는 영향을 미치지 않았다.
6. 경미한 DPPH 자유 산소라디칼 소거능을 보였다.
7. 제 1 형 Elastase에 대한 저해 효과는 미미하였지 만, 제 4 형 Elastase에 대하여서는 저해 효과를 보 였다.
8. 인간 유래 악성 흑색종 세포에서 자유 산소라디칼 의 생성량에는 영향을 미치지 않았다.
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