추출방법에 따른 딸기의 품질특성 및 항산화 활성 배미정

추출방법에 따른 딸기의 품질특성 및 항산화 활성

배미정¹*․김은아²*․최현경¹․변미순²․정강현¹․윤진아³․안정희³

1서울과학기술대학교 식품공학과

2(주)에스앤피인터내셔널 기업부설연구소

3KC 대학교 식품영양학과

Quality Characteristics and Antioxidant Activities of Strawberries according to Various Extraction Methods

Mi-Jeong Bae

, Eu Na Kim

, Hyeon Kyeong Choi

, Mi Soon Byun

, Kang-Hyun Chung

, Jin-A Yoon

, and Jeung Hee An

1

Department of Food Science and Technology, Seoul National University of Science & Technology

2

Research Institute of S&P International

3

Department of Food and Nutrition, KC University

ABSTRACT This study investigated different extraction methods to increase the quality characteristics and antioxidant activity of strawberries. We used both autoclave extraction and sonication extraction methods, and we used water, 30% ethanol and 50% ethanol as extraction solvents. The total polyphenol, flavonoid and tannin contents were sig- nificantly higher in the sonication extract than that in the autoclave extraction, and the total polyphenol and tannin contents were increased, in a dose dependent manner, according to the ethanol content in the solvent of the sonication extract. The total anthocyanin content was significantly higher in the water extract (13.96 mg cyanidin 3-O-glucoside equivalent (CGE)/100 g sample) and 30% ethanol extract (15.38 mg CGE/100 g sample) of the sonication extracts, than that of the autoclave extracts. The amount of ellagic acid was highest in the sonication extract with 50% ethanol (2.06 μg/mL). Further, the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radi- cal scavenging ability and reducing power had a tendency to increase/decrease according to the total polyphenol, flavonoid and tannin content. This study suggests that antioxidant activity depends on the phenolic compounds. In conclusion, the sonication extraction method and 50% ethanol solvent was the most effective method for extracting physiological active substances from strawberries. Further, we can increase the quality characteristics and physiological activities of natural plant extracts by employing suitable extraction methods and using the correct solvent.

Key words: strawberry, extraction method, phenolic compounds, antioxidant activity

Received 14 May 2019; Accepted 11 June 2019

Corresponding author: Jeung Hee An, Department of Food and Nutrition, KC University, Seoul 07661, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-2-2600-2566

*These authors contributed equally to this work.

Author information: Mi-Jeong Bae (Student), Hyeon Kyeong Choi (Graduate student), Kang-Hyun Chung (Professor), Jin-A Yoon (Pro- fessor), Jeung Hee An (Professor)

서 론

딸기(

Fragaria ananassa

MAFRA, 2016). 신맛과 단맛이 잘 조화되어 있고 독특한 향기를 가지고 있는 딸기는 국내에서 대부분 식용으로 이용

되고 있다(Lee 등, 2003a). 딸기는 잼, 젤리, 아이스크림, 냉동딸기, 딸기주 등의 원료로도 이용되고 있는데(Youn 등, 2007), 딸기 가공에 관한 연구로는 딸기잼(Kim 등, 2013a), 딸기 와인(Kim 등, 2016c), 딸기의 알코올 발효 특성(Lee 등, 2003b), 딸기 식초(Lee 등, 2003a), 딸기 두부(Kim과 Park, 2015), 딸기 젤리(Kim과 Min, 2017) 및 당화 딸기죽 (Kim 등, 2012) 등이 있다. 딸기는 비타민 C뿐만 아니라 폴리페놀, 플라보노이드, 안토시아닌, 퀘르세틴, 카페익산, 페룰산, 엘라그산 등 다양한 항산화 물질을 함유하고 있는데 (Youn 등, 2007; Kim과 Shin, 2015; Komorsky-Lovrić과 Novak, 2011), 이러한 항산화 물질은 항암 작용, 항돌연변 이 작용, 콜레스테롤 저하 작용 등의 기능을 가지고 있고 만성질환, 심혈관계 질환, 퇴행성 신경계 질환을 억제하는 것으로 알려져 있다(Meyers 등, 2003). 특히 엘라그산은 과일과 견과류, 녹차 등에서 발견되는 자연 발생 폴리페놀

화합물 성분으로 당과 엘라그산이 결합한 엘라지탄닌이 가 수분해되어 생성된다(Kim 등, 2016b; Yan 등, 2015). 또한 엘라그산은 항산화, 죽종(Atheroma) 형성 억제, 항세포사 멸 효과 기능을 가지고 있고 에스트로젠 수용체 조절제 기능 을 가지고 있어 인간 섬유아세포의 광자극에 의한 손상을 억제하고 콜라겐의 발현을 조절하는 기능을 가지고 있다 (Kim 등, 2016b; Türk 등, 2010; Papoutsi 등, 2005).

딸기와 같이 생리활성을 가지는 천연 물질을 활용하기 위 해서는 활성 탐색뿐만 아니라 천연물 소재의 특징을 고려한 추출물의 제조 공정 또한 중요하다(Cho 등, 2003). 그리고 천연물질의 추출효율을 증대시키려는 추출방법으로 에탄올 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 가압 추출 등이 시도되고 있다 (Park과 Hong, 2014b). 청나래고사리와 차가버섯 균사체 에 대한 열수 추출법은 시료를 대량으로 추출할 수 있는 장 점이 있으나, 추출효율이 낮고 에너지 소비가 높으며 열에 의해 유용성분이 파괴될 수 있다(Shin과 Lee, 2011; Park 등, 2012). 최근에는 가압 추출방법과 초음파 추출방법을 많이 사용하고 있는데, 톳에 대한 가압 추출방법은 불순물이 없고 시료가 받는 압력을 증가시켜 단시간에 시료의 유용성 분 추출이 가능하다(Kwon과 Youn, 2017; Koo 등, 2007).

그리고 세포벽과 단백질의 변성 및 파괴를 초래하여 세포 내 용매의 출입을 용이하게 해 유용성분의 추출효율을 증진 하는 장점을 가지고 있다(Kwon과 Youn, 2017; Koo 등, 2007). 남구절초와 코스모스에 대한 초음파 추출은 열에 의 한 성분 파괴를 줄일 수 있고 단기간에 큰 에너지를 발생시 켜 높은 추출효율을 얻을 수 있다(Woo 등, 2010a; Park 등, 2004). 그리고 특히 식물을 추출할 때 초음파가 식물의 세포벽을 파괴함으로써 식물 세포 내 유용물질의 전달을 용 이하게 해 생물 활성률과 추출효율을 증가시킨다는 장점을 가지고 있다(Shin과 Lee, 2011; Melecchi 등, 2005). 최근 추출방법에 따른 생리활성을 비교한 연구들이 진행되고 있 으며 관련 연구로는 다양한 추출방법으로 제조한 상지(Park 과 Hong, 2014b), 청나래고사리(Shin과 Lee, 2011), 삼나 무 잎(Kim 등, 2017), 개두릅(Kang 등, 2012), 자소엽 추출 물의 항산화 활성 측정(Seo 등, 2018) 연구가 있다. 또한 추출방법에 따른

Spirulina maxima

딸기는 여러 생리활성이 있는 것으로 보고되었으나 추출 방법에 따른 그 효과에 관한 연구는 현재까지 미흡한 실정이 다. 따라서 본 연구에서는 추출방법과 추출용매를 달리하여 추출물을 제조하고 이들의 추출수율, 당도 및 pH를 측정해 품질특성을 분석하였다. 뿐만 아니라 항산화 성분 함량 분석 을 위해 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌, 안토시아닌 및 엘라 그산 함량을 측정하였고 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능, 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothi-

azoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거능, 환원력, superoxide dismutase(SOD) 유사활성을 측정하여 항산화 활성을 분석하였다. 그리하여 딸기의 가장 효과적인 추출방 법을 제시하고 건강기능식품 및 소재 개발을 위한 기초자료 를 제공하고자 한다.

재료 및 방법

실험재료 및 추출물의 제조

실험재료로는 ‘설향’ 딸기 품종을 사용하였고 대구광역시 에 소재한 딸기가(家) 농장에서 2019년 1월에 재배한 딸기 를 구입하여 꼭지를 제거한 후 분쇄기로 분쇄한 다음 실험에 사용하였다.

본 연구는 추출방법으로 고온가압 추출, 초음파 추출을 시행하였고 추출용매로 물(증류수), 30% 에탄올, 50% 에탄 올을 사용하여 총 6종류의 추출물을 제조하여 사용하였다.

고온가압 추출물은 분쇄한 딸기 150 g에 추출용매(증류수, 30% 에탄올, 50% 에탄올) 600 mL를 가한 후 121°C auto- clave(SJ-220A100, Sejong Co., Bucheon, Korea)에서 15분간 추출하였다. 이후 여과지(Whatman No. 2, What- man plc., Kent, UK)로 여과한 후 회전진공농축기(R-114, Buchi Co., Flawil, Switzerland)를 사용하여 농축하고 동 결 건조하였다. 초음파 추출물은 분쇄한 딸기 150 g에 추출 용매(물, 30% 에탄올, 50% 에탄올) 600 mL를 가한 후 son- ication(Powersonic 405, Hwasin Tech., Daegu, Korea) 으로 2시간 추출하였다. 이후 여과지(Whatman No. 2, What- man plc.)로 여과한 후 회전진공농축기(R-114, Buchi Co.) 를 사용하여 농축하고 동결 건조하여 실험에 사용하였다.

딸기 추출물의 추출수율, 당도 및 pH 측정

각 추출물의 추출수율, 당도 및 pH를 측정하였다. 추출물 각각의 추출수율은 동결 건조된 각 추출액의 건물 중량을 추 출액 조제에 사용한 원료 중량에 대한 백분율로 나타내었다.

당도는 굴절당도계(RHB-800A, Lumen Optical Instru- ment Co., Ltd., Fuzhou, China)로 총 3회 측정한 후 평균값 으로 나타내었고, pH 측정은 pH meter(HI 8014, Hanna Instruments, Keysborough, Australia)를 사용하여 측정 하였다.

총 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량 측정

딸기 추출물에 대한 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis (Singleton과 Rossi, 1965)의 방법을 변형하여 측정하였다.

일정 농도로 희석한 시료 100 μL에 물 2 mL와 2 N Folin- Ciocalteu 시약(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 200 μL를 넣은 후 상온에서 3분 반응시켰다. 이후 20%의 Na2CO3(DAEJUNG, Siheung, Korea) 2 mL를 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 방치시킨 다음 ELISA reader(UVM 340, Biochrome Ltd., Cambridge, UK)를 사용하여 725

Table 1. Analytical conditions of HPLC for analysis of ellagic

Parameters Conditions HPLC model

Column

Column temperature Flow rate

Injection Mobile phase

HPLC (1290 infinity, Agilent, Santa Clara, CA, USA) ZORBAX (2.1×150 mm, 5 µm, Agilent) 35°C

0.4 mL/min 10 µL

A: 0.1% phosphoric acid in water B: 100% methanol

Gradient step

Time (min) A (%) B (%) 0.0

15.0

90 50

10 50

UV detection 254 nm

nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 하여 구하였고 추 출물 100 g당 mg gallic acid equivalent(GAE, dry basis) 로 함량을 산출하였다.

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 응 용하여 측정하였다. 시료 100 μL에 증류수 400 μL와 5%

NaNO₂(DAEJUNG) 용액 30 μL를 넣은 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 이후 10% AlCl₃･6H₂O(DAEJUNG) 용액 30 μL 를 첨가하고 6분 동안 상온에서 방치시킨 후, 1 M NaOH (DAEJUNG) 200 μL와 증류수 240 μL를 첨가하여 11분 동안 발색시키고 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플 라보노이드 함량은 (+)-catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.) 표준곡선을 이용하여 산출하였고 추출물 100 g당 mg (+)-catechin hydrate equivalent(CHE, dry basis)로 나 타냈다.

총 탄닌 함량은 Duval 등(1999)의 방법으로 측정하였다.

시료 500 µL와 증류수 500 µL를 희석한 후 5% Na₂CO₃ (DAEJUNG) 500 µL와 1 N Folin-Ciocalteu reagent(Sig- ma-Aldrich Co.) 250 µL를 첨가하였다. 이후 60분 동안 반응시킨 뒤 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tannic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 표준물질로 하여 작성한 검량 선을 사용하여 총 탄닌 함량을 구하였으며, 결과는 추출물 100 g당 mg tannic acid equivalent(TAE, dry basis)로 나타내었다.

총 안토시아닌 및 엘라그산 함량 측정

딸기 추출물의 총 안토시아닌 함량은 pH-differential method(Giusti와 Wrolstad, 2001)를 사용하여 측정하였 다. 일정 농도로 희석한 시료 500 μL를 0.025 M potassium chloride buffer(pH 1.0) 1 mL와 0.4 M sodium acetate buffer(pH 4.5) 1 mL로 각각 희석한 후 15분 동안 반응시켰 다. 이후 515 nm와 700 nm에서 흡광도를 측정한 후 안토시 아닌 함량을 산출하였다. 총 안토시아닌 함량은 추출물 100 g당 mg cyanidin 3-O-glucoside equivalent(CGE, dry basis)로 나타냈다.

딸기 추출물의 엘라그산 함량 측정은 HPLC(1290 in- finity, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 측정하 였으며 분석 조건은 Table 1과 같다. 분석용 컬럼은 ZORBAX (2.1×150 mm, 5 μm, Agilent)를 사용하였으며 이동상 용 매 A는 0.1% phosphoric acid를, 용매 B는 메탄올을 사용 하여 0.4 mL/min의 유속으로 각각 분석하였다. UV는 254 nm 파장에서 측정하였고 시료 주입량은 10 μL로 하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Blois(1958)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 일정 농도로 희석된 시료 200 μL 에 0.2 mM DPPH(Sigma-Aldrich Co.) 용액 800 μL를 가 한 후 암소에서 30분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측

정하였다. DPPH 라디칼 소거능 결과 값은 추출물 첨가군과 무첨가군을 비교하여 백분율(%)로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거능 측정

각 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(1999)과 Arnao 등(2001)의 방법을 응용하여 측정하였다. 7 mM ABTS 용액 5 mL에 2.45 mM 과황산칼륨(Hayashi Pure Chemical Ind., Ltd., Osaka, Japan) 5 mL를 혼합한 후 암 소에서 약 24시간 반응시켰다. 이후 실험 직전에 ABTS 용 액을 732 nm에서 흡광도가 0.70±0.02가 되도록 phos- phate buffer saline(pH 7.4)으로 희석하여 사용하였다. 희 석된 ABTS 용액 800 μL를 일정 농도로 희석한 시료 200 μL에 첨가하여 암소에서 5분간 반응시켰다. 이후 ELISA reader(UVM 340, Biochrome Ltd.)를 사용하여 734 nm에 서 흡광도를 측정한 후 결과 값은 추출물 첨가군과 대조군을 비교하여 라디칼의 소거 활성을 백분율(%)로 나타내었다.

환원력 측정

딸기 추출물의 환원력은 Oyaizu(1986)의 방법을 변형하 여 측정하였다. 일정 농도로 희석한 시료에 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 6.6)와 1% potassium ferricya- nide(Chameleon Analytical Reagent, Osaka, Japan)를 각 각 혼합한 후 50°C에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10%

trichloroacetic acid(w/v)를 가하여 원심분리 한 후 상층액 500 μL에 증류수 500 μL, 0.1% ferric chloride 용액 100 μL를 넣어 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 환 원력은 흡광도 값으로 나타내었다.

SOD 유사활성 측정

SOD 유사활성은 superoxide에 의해 산화되는 pyrogal- lol의 산화속도를 억제시키는 원리로 Marklund와 Mark- lund(1974)의 방법에 준하여 실시하였다. 추출물 200 µL에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer[50 mM tris(hydrox-

Table 2. Extraction yield, soluble solid content, and pH of strawberry extracts

Extraction method Extraction solvent Extraction yield (%) Soluble solid content (°Brix) pH Autoclave

Sonication

Water 30% ethanol 50% ethanol

Water 30% ethanol 50% ethanol

8.26±0.83^a1) 8.11±1.13^a 7.53±1.48^a 7.94±1.70^a 7.47±0.81^a 7.18±0.41^a

1.00±0.00^f 3.67±0.29^d 5.50±0.00^c 1.83±0.29^e 9.27±0.29^b 14.27±0.29^a

3.88±0.00^e 3.89±0.01^de 3.90±0.00^d 3.95±0.01^c 4.27±0.00^b 4.55±0.01^a

1)Values are mean±SD of triplicate determination. Different letters within a column are significantly different (P<0.05).

ymethyl) amino-methane+10 mM EDTA] 3 mL와 7.2 mM pyrogallol 200 µL를 가하여 실온에서 10분간 방치 후 1 N HCl 200 µL로 반응을 정지시켰다. 이 반응액을 420 nm에서 흡광도를 측정하여 시료첨가군 및 무첨가군 간의 흡광도 차이를 백분율로 나타냈다.

통계처리

본 연구의 모든 분석은 3회 반복하여 평균±표준편차 (mean±SD)로 제시하였다. 실험값에 대한 통계분석은 SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 분산분석(ANOVA)법을 실행하였고 실험군 간의 유의성은 Duncan’s multiple range test로

P

결과 및 고찰

딸기 추출물의 추출수율, 당도 및 pH 측정

추출방법과 추출용매에 따른 딸기의 추출수율, 당도 및 pH는 Table 2와 같다. 추출수율은 고온가압 추출이 물, 30

%, 50% 에탄올 추출물에서 각각 8.26, 8.11, 7.53%의 추출 수율을 보였고, 초음파 추출은 물, 30%, 50% 에탄올 추출물 에서 각각 7.94, 7.47, 7.18%를 나타내었다. 고온가압 추출 물이 초음파 추출물보다 높은 수율이 측정되었고 추출방법 과 관계없이 추출용매의 에탄올 농도가 감소할수록 추출수 율이 증가하였다. Park과 Hong(2014a)은 상지에 배양한 상황버섯 균사체 추출물의 가압 추출이 초음파 추출보다 높 은 추출수율을 보였다고 보고하였다. 이는 열과 압력에 의해 서 불용성 성분들이 가용화됨에 따라 용출이 용이하게 된 것이라 판단된다(Park과 Hong, 2014a). 또한 구기자에서 는 물 추출물이 50%, 100% 에탄올 추출물보다 높은 추출수 율을 나타냈다(Shon 등, 2008).

당도를 측정한 결과 고온가압 추출은 물, 30%, 50% 에탄 올 추출물에서 각각 1.00, 3.67, 5.50°Brix였고, 초음파 추 출은 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에서 각각 1.83, 9.27, 14.27°Brix였다. 초음파 추출물이 고온가압 추출물보다 유 의적으로 높은 당도를 나타내었고 추출용매의 에탄올 농도 가 증가할수록 당도가 유의적으로 증가하였다(

P

Kim 등(2013b)의 연구에서 포도는 가압가열 추출물이 열수 추출물과 효소 추출물에 비해 당도가 낮게 측정되었다. 무증

자 분쇄 백미는 초음파 처리 시간을 증가시킬수록 초기 환원 당 함량이 증가하였으며, 이는 초음파 처리를 할수록 쌀 전 분의 분해도가 높아졌기 때문이다(Lee와 Kang, 2012). 본 연구 또한 초음파 처리에 의해 딸기의 탄수화물 분해도가 증가하여 초음파 추출물의 당도가 증가했을 것으로 생각된 다. 구기자는 추출용매의 에탄올 농도가 증가할수록 당도가 증가하여 본 연구와 유사한 경향을 보였다(Shon 등, 2008).

추출 공정에 있어 추출하고자 하는 물질의 극성과 유사한 극성을 가지는 용매의 사용은 용해도를 증가시켜 물질의 추 출수율을 극대화시킨다(Lee 등, 2015). 그러므로 추출용매 의 에탄올 농도가 증가할수록 딸기 추출물의 당도가 증가한 것은 추출용매 극성 차이에 의해 유리당의 용출 정도가 달라 졌기 때문으로 판단된다.

pH는 고온가압 추출에서 물, 30%, 50% 에탄올 추출물이 각각 3.88, 3.89, 3.90의 값을 보였고, 초음파 추출에서는 물, 30%, 50% 에탄올 추출물이 각각 3.95, 4.27, 4.55로 측정 되었다. 고온가압 추출물의 pH가 초음파 추출물의 pH보다 유의적으로 낮게 나타났으며, 초음파 추출물에서 추출용매 의 에탄올 농도가 증가할수록 pH가 증가하였다(

P

홍삼 추출액은 추출 온도와 시간이 증가할수록 pH가 낮아졌 으며 이는 추출 온도와 시간의 증가에 따른 화학반응 및 유 기산의 생성, 그리고 반응 중간 생성물 등에 의한 것으로 생각된다(Lee 등, 2008). 따라서 고온처리로 인해 딸기의 당질 성분들이 분해되고 산이 생성되어 고온가압 추출물이 초음파 추출물보다 당도와 pH가 감소한 것으로 추정된다.

Shon 등(2008)의 연구에서 구기자 추출물은 추출용매의 에 탄올 농도가 증가할수록 pH가 증가하였다. 딸기 추출물 또 한 추출용매의 에탄올 농도가 증가할수록 pH가 증가하였는 데, 이는 극성 용매인 물에 무극성 용매인 에탄올이 희석되 면서 추출용매의 극성이 달라져 유기산의 용출 정도가 달라 진 것으로 생각된다(Lee 등, 2015).

총 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량 측정

딸기 추출물의 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량 은 Table 3에 나타내었다. 고온가압 추출의 총 폴리페놀 함 량은 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에서 403.96, 570.81, 544.32 mg GAE/100 g sample이 측정되었고, 초음파 추출 은 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에서 444.32, 568.11, 714.23 mg GAE/100 g sample을 나타내 초음파 추출물이 고온가

Table 3. Total polyphenol, flavonoid, and tannin content of strawberry extracts

method Extraction solvent Total polyphenol content

(mg GAE¹⁾/100 g sample) Total flavonoid content

(mg CHE²⁾/100 g sample) Total tannin content (mg TAE³⁾/100 g sample) Autoclave

Sonication

Water 30% ethanol 50% ethanol

Water 30% ethanol 50% ethanol

403.96±9.55^e4) 570.81±9.17^b 544.32±6.88^c 444.32±7.64^d 568.11±5.16^b 714.23±13.03^a

437.58±11.01^b 448.04±6.88^b 381.93±20.80^c 455.76±27.87^b 506.45±25.71^a 546.12±25.71^a

1,150.78±16.19^e 1,394.14±27.78^c 1,222.27±12.22^d 1,206.05±23.13^d 1,586.13±28.03^b 1,905.34±58.77^a

1)GAE: gallic acid equivalent. ²⁾CHE: (+)-catechin hydrate equivalent. ³⁾TAE: tannic acid equivalent.

4)Values are mean±SD of triplicate determination. Different letters within a column are significantly different (P<0.05).

압 추출물보다 유의적으로 높은 폴리페놀 함량을 보였다 (

P

P

총 플라보노이드 함량은 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향 을 보였다. 초음파 추출물이 고온가압 추출물보다 플라보노 이드 함량이 유의적으로 높았으며 고온가압 추출방법 중 30% 에탄올 추출물(448.04 mg CHE/100 g sample)과 초 음파 추출방법 중 50% 에탄올 추출물(546.12 mg CHE/

100 g sample)의 플라보노이드 함량이 가장 높게 나타났다 (

P

또한 아마란스 종자는 메탄올 추출물이 물 추출물보다 플라 보노이드 함량이 19배 이상 측정되었으며, 이는 플라보노이 드 성분이 극성지수가 10.2인 물보다 극성지수가 5.1인 메 탄올에 더욱 잘 추출되기 때문이다(Jo 등, 2014). 그러므로

극성지수가 4.3인 에탄올의 농도가 증가할수록 용매의 극성 지수가 하락하여 플라보노이드 추출수율이 상승했을 것으로 추정된다. 고온가압 추출방법은 30% 에탄올 추출물이 50%

에탄올 추출물보다 높은 플라보노이드 함량을 보였는데, 이 는 고온가압과정에서 50% 에탄올 추출용매의 에탄올이 손 실되고 이로 인해 극성지수가 상승하여 플라보노이드 용출 정도가 하락한 것으로 판단된다.

각 딸기 추출물의 총 탄닌 함량 또한 본 연구의 폴리페놀, 플라보노이드 함량과 유사한 결과를 나타내었으며, 초음파 추출물에서 고온가압 추출물보다 유의적으로 높은 탄닌 함 량이 측정되었다(

P

에탄올 추출물(1,394.14 mg TAE/100 g sample)의 탄닌 함량이 가장 유의적으로 높았고, 초음파 추출방법에서는 추 출용매의 에탄올 농도가 높을수록 탄닌 함량이 유의적으로 증가하여 50% 에탄올 추출물(1,905.34 mg TAE/100 g sample)이 가장 높은 탄닌 함량을 보였다(

P

고온가압 추출방법의 50% 에탄올 추출물이 30% 에탄올 추 출물보다 탄닌 함량이 낮은 것은 폴리페놀, 플라보노이드와 같이 고온가압과정에서의 50% 에탄올 추출용매의 에탄올 손실로 인한 추출용매의 극성 변화 때문으로 생각된다.

총 안토시아닌 및 엘라그산 함량 측정

추출방법과 용매에 따른 딸기 추출물의 총 안토시아닌 및 엘라그산 함량은 Table 4와 같다. 총 안토시아닌 함량은 고 온가압 추출의 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에서 4.27, 6.56, 19.79 mg CGE/100 g sample을 보였고, 초음파 추출의 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에서 13.96, 15.38, 15.63 mg CGE/

100 g sample을 나타내었다. 50% 에탄올로 고온가압 추출 한 딸기의 안토시아닌 함량이 유의적으로 가장 높게 측정되 었으며, 이외의 추출용매에서는 초음파 추출물이 고온가압

Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of water and ethanol extract of strawberry with different concentrations. Values with different

Table 4. Total anthocyanins and ellagic acid content of strawberry extracts

Extraction method Extraction solvent Total anthocyanins

(mg CGE¹⁾/100 g sample) Ellagic acid (µg/mL) Autoclave

Sonication

Water 30% ethanol 50% ethanol

Water 30% ethanol 50% ethanol

4.27±0.70^e2) 6.56±0.21^d 19.79±0.60^a 13.96±0.42^c 15.38±0.49^b 15.63±1.07^b

1.03±0.01^d 1.06±0.00^c 1.63±0.00^b 0.50±0.00^f 0.64±0.00^e 2.06±0.01^a

1)CGE: cyanidin 3-O-glucoside equivalent.

2)Values are mean±SD of triplicate determination. Different letters within a column are significantly different (P<0.05)

추출물보다 유의적으로 높은 안토시아닌 함량을 나타냈다 (

P

총 엘라그산 함량은 초음파로 추출한 50% 에탄올 추출물 이 2.06 μg/mL로 유의적으로 가장 높은 값을 나타냈으며, 두 추출방법 모두 추출용매의 에탄올 농도가 증가할수록 총 엘라그산 함량이 유의적으로 증가하였다(

P

더 높은 엘라그산 함량을 보였다(Kim 등, 2015b).

DPPH 라디칼 소거능 측정

각 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Fig. 1에 나타냈으며 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량과 유사한 경향을 보였다. 페놀성 화합물인 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌은 수산기를 통한 수소 공여로 라디칼들을 쉽게 공명으로 안정 화시킬 수 있는 구조를 가지고 있어 항산화 활성과 연관되어 있다(Park 등, 2015). 300~1,000 μg/mL 농도에서 고온가 압 추출의 물, 30% 에탄올, 50% 에탄올 추출물에서 14.36

~38.3, 21.37~47.65, 13.47~34.84%로 측정되었고, 초음 파 추출은 물, 30% 에탄올, 50% 에탄올 추출물에서 13.94~

39.92, 16.95~48.40, 24.44~56.71%를 나타내었다. 모든 추출물은 300~1,000 μg/mL 농도에서 농도가 증가함에 따 라 DPPH 라디칼 소거능이 유의적으로 증가하였고, 초음파 추출물이 고온가압 추출물보다 DPPH 라디칼 소거능이 유 의적으로 높게 측정되었다(

P

% 에탄올 추출물의 활성이 유의적으로 가장 높았으며, 초음 파 추출물은 50% 에탄올 추출물의 활성이 유의적으로 가장 높게 나타났다(

P

Fig. 2. ABTS radical scavenging activity of water and ethanol extract of strawberry with different concentrations. Values with different

를 형성하여 환원됨에 따라 짙은 자색이 탈색되는 원리를 이용한 방법이다(Choi 등, 2011). 추출물의 전자공여능 효 과를 측정하며 다양한 천연소재로부터 산화방지 물질을 탐 색하기 위해 많이 이용되고 있다(Choi 등, 2011). 자소엽은 냉수 추출, 열수 추출, 초음파 추출을 하였을 때 초음파 추출 의 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높아 본 연구와 유사한 경향 을 보였다(Seo 등, 2018). 한편 Kang과 Lee(2013)는 사철 쑥, 약쑥, 개철쑥의 고온가압 추출물이 초음파 추출물보다 DPPH 라디칼 소거능이 높다고 보고하여 본 연구와는 상반 된 결과를 나타내었다. 그러나 Park과 Hong(2014a)의 항 산화성이 페놀화합물과 연관되어 있다는 보고를 미루어볼 때 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량이 더 높았던 초음 파 추출물이 고온가압 추출물보다 DPPH 라디칼 소거능이 증진되었을 것이라 여겨진다. 동결건조 오미자는 열수, 50%

에탄올, 75% 에탄올, 99% 에탄올을 가하여 고온환류 추출 하였을 때 50% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높았다(Park 등, 2013a). 검정라즈베리의 줄기, 씨, 잎 에 농도별 에탄올을 가하여 초음파 추출하였을 때 줄기와 잎은 50% 에탄올에서, 씨는 75% 에탄올에서 DPPH 라디칼 소거능이 가장 높게 나타났다(Kim 등, 2015b).

ABTS 라디칼 소거능 측정

추출방법과 용매를 달리한 딸기 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 Fig. 2에서 나타냈으며 DPPH 라디칼 소거능과 유사한 경향을 보였다. 300~1,000 μg/mL 농도에서 ABTS 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 50% 에 탄올 추출물 300 μg/mL에서 고온가압 추출물보다 초음파 추출물의 ABTS 라디칼 소거능이 유의적으로 높게 측정되 었고, 고온가압 추출물 중 30% 에탄올 추출물(69.83%)이 가장 높았으며, 초음파 추출물은 50% 에탄올 추출물(76.39

%)이 유의적으로 가장 높은 활성을 나타내었다(

P

ABTS assay는 양이온 라디칼이 소거되는 것을 이용한 방

법으로 항산화 활성을 측정하는 방법이다(Park 등, 2013b).

Potassium persulfate와 ABTS가 반응하여 ABTS cation radical이 생성되면 청록색을 띠게 되는데 ABTS cation radical이 항산화성 물질에 의해 소거되어 청록색이 탈색되 는 것을 이용하여 항산화 활성을 측정한다(Park 등, 2013b).

사철쑥, 약쑥, 개철쑥의 고온가압 추출물이 초음파 추출물보 다 ABTS 라디칼 소거능이 높아 본 연구와는 상반된 결과를 나타내었다(Kang과 Lee, 2013). 하지만 페놀화합물은 항 산화성과 연관되어 있고(Park과 Hong, 2014a) 본 연구에 서 초음파 추출물의 페놀화합물(폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌)이 고온가압 추출물보다 높았다. 때문에 ABTS 라디칼 소거능도 DPPH 라디칼 소거능과 같이 초음파 추출물이 고 온가압 추출물보다 높게 측정되었을 것으로 생각된다. 상지 는 50% 에탄올 추출물이 열수 추출물보다 ABTS 라디칼 소 거능이 높아 본 연구와 유사한 경향을 보였다(Park과 Hong, 2014b).

환원력 측정

각각의 딸기 추출물의 환원력은 Fig. 3과 같다. 환원력은 일반적으로 페놀 함량과 상관관계가 높다고 보고되고 있는 데(Osawa, 1994), 딸기 추출물의 환원력 또한 DPPH 라디 칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능과 같이 폴리페놀, 플라보 노이드 및 탄닌 함량과 유사한 경향을 보였다. 1~10 mg/mL 농도에서 고온가압 추출은 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에 서 각각 0.34~0.98, 0.37~1.08, 0.34~0.98의 환원력을 보 였고, 초음파 추출은 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에서 각각 0.34~0.96, 0.37~1.16, 0.40~1.19의 환원력을 나타내 모 든 추출물에서 농도 의존적으로 환원력이 증가하였다. 초음 파 추출물이 고온가압 추출물보다 유의적으로 환원력이 높 게 측정되었고 고온가압 추출에서는 30% 에탄올 추출물의 환원력이 유의적으로 가장 높았으며, 초음파 추출에서는 50% 에탄올 추출물이 유의적으로 가장 높은 활성을 보였다

Fig. 3. Reducing power of water and ethanol extract of strawberry with different concentrations. Values with different letters above

Fig. 4. SOD like activity of water and ethanol extract of strawberry with different concentrations. Values with different letters above

(

P

SOD 유사활성 측정

추출방법과 추출용매에 따른 딸기 추출물의 SOD 유사활

성은 Fig. 4에서 나타내었다. 1~10 mg/mL에서 모든 추출 물은 농도 의존적으로 활성이 증가하였다. 10 mg/mL에서 고온가압 추출의 물, 30%, 50% 에탄올 추출물에서 31.94, 35.68, 35.90%의 값을 보였고, 초음파 추출의 물, 30%, 50

% 에탄올 추출물에서 28.20, 34.63, 35.29%의 값을 나타내 고온가압 추출방법과 초음파 추출방법 사이에 유의적인 차 이가 없었다(

P

P

추출물과 초음파 추출물이 SOD 유사활성에서 유의적 차이 가 없었다(

P

에탄올 추출물이 물 추출물, 100% 에탄올 추출물보다 SOD 유사활성이 증가하였다(Jeong 등, 2007).

요 약

본 연구는 딸기의 품질특성 및 항산화 활성을 증가시킬 수 있는 추출방법 개발을 목적으로 하였다. 따라서 고온가압 추출, 초음파 추출 공정을 시행하고 물, 30% 에탄올 및 50%

에탄올을 추출용매로 사용하여 딸기 추출물의 추출방법과 용매에 따른 품질특성 및 항산화 활성을 분석하였다. 총 폴 리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량은 초음파 추출방법이 고온가압 추출방법보다 유의적으로 높은 값을 보였고, 초음 파 추출 시 용매의 에탄올 함량이 증가함에 따라 총 폴리페 놀과 탄닌 함량이 증가하였다(

P

P

P

감사의 글

이 논문은 산학연협력기술개발 사업(과제번호 S2599219) 으로 중소벤처기업부 중소기업기술정보진흥원의 지원을 받 아 연구되었습니다.

REFERENCES

Arnao MB, Cano A, Acosta M. The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity. Food Chem. 2001.

73:239-244.

Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958. 181:199-1200.

Cho YJ, Lee SK, Ahn YH, Pyee JH. Development of ultra- sonication-assisted extraction process for manufacturing ex-

tracts with high content of pinosylvin from pine leaves. J Korean Soc Agric Mach. 2003. 28:325-334.

Choi SJ, Lee YS, Kim JK, Chung CK, Kang IJ, Lim SS. Antiox- idant activity of ripe fruit components of Rubus coreanus:

extraction using porous polymer resins. Korean J Food Sci Technol. 2011. 43:149-155.

Duval B, Shetty K, Thomas WH. Phenolic compounds and anti- oxidant properties in the snow alga Chlamydomonas nivalis after exposure to UV light. J Appl Phycol. 1999. 11:559-566.

Giusti MM, Wrolstad RE. Characterization and measurement of anthocyanins by UV-visible spectroscopy. In: Wrolstad RE, editor. Handbook of Food Analytical Chemistry. John Wiley

& Sons Inc., Hoboken, NJ, USA. 2001. p 19-31.

Gu YR, Kim JH, Hong JH. The anti-oxidant, whitening and anti-wrinkle effects of Castanea crenata inner shell extracts processed by enzyme treatment and pressurized extraction.

Korean J Food Preserv. 2018. 25:79-89.

Ha JH, Kwon CK, Seo YC, Choi WY, Chung EK, Chung AR, et al. Comparison of anticancer activities of Berberis koreana extracts obtained by extraction processes. Korean J Food Sci Technol. 2010. 42:233-239.

Jeong HJ, Park SB, Kim S, Kim HK. Total polyphenol content and antioxidative activity of wild grape (Vitis coignetiae) ex- tracts depending on ethanol concentrations. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2007. 36:1491-1496.

Jo HJ, Chung KH, Yoon JA, Song BC, An JH. Free radical-scav- enging activities of amaranth (Amaranthus spp. L.) seed ex- tracts. Food Eng Prog. 2014. 18:116-123.

Kang KM, Lee SH. Effects of extraction methods on the anti- oxidative activity of Artemisia sp. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013. 42:1249-1254.

Kang KM, No HK, Park CS, Youn KS, Hong JH, Lee SH.

Antioxidative activity of Kalopanax pictus shoot extracted us- ing different extraction methods. J Korean Soc Food Sci Nutr.

2012. 41:1686-1692.

Kim HJ, Wee JH, Yang EJ. Optimal conditions for anthocyanin extraction from black rice bran and storage stability of antho- cyanin extract. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015a. 44:1543- 1549.

Kim JG, Choi JW, Park MH. Effect of different days of post- harvest treatment and CO2 concentrations on the quality of

‘Seolhyang’ strawberry during storage. Korean J Food Pre- serv. 2016a. 23:12-19.

Kim JH, Lee SH. Antioxidative and antimicrobial activities of

Oenothera biennis extracted by different methods. Korean J

Kim JH, Min SC. Development and shelf-life determination of senior-friendly strawberry jelly. Korean J Food Sci Technol.

2017. 49:181-185.

Kim JO, Jung MJ, Choi HJ, Lee JT, Lim AK, Hong JH, et al.

Antioxidative and biological activity of hot water and ethanol extracts from Phellinus linteus. J Korean Soc Food Sci Nutr.

2008. 37:684-690.

Kim JS, Kang EJ, Chang YE, Lee JH, Kim GC, Kim KM. Char- acteristics of strawberry jam containing strawberry puree.

Korean J Food Cook Sci. 2013a. 29:725-731.

Kim JS, Kim JY, Chang YE. The quality characteristic and anti- oxidant properties of saccharified strawberry gruels. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2012. 41:752-758.

Kim JW, Youn KS. Polyphenolic compounds, physiological ac- tivities, and digestive enzyme inhibitory effect of Aster scab-

er Thunb. extracts according to different extraction processes.

J Korean Soc Food Sci Nutr. 2014. 43:1701-1708.

Kim KA, Kwon JW, Kim YS, Park PJ, Chae KS. Antioxidant

activities of ethanol extracts from different parts of the black raspberry (Rubus occidentalis) obtained using ultra-sonication.

Korean J Food Sci Technol. 2015b. 47:504-510.

Kim KS, Han SH, An IS, Ahn KJ. Protective effects of ellagic acid against UVA-induced oxidative stress in human dermal papilla. Kor J Aesthet Cosmetol. 2016b. 14:191-200.

Kim L, Kwon O, Kim JY. Comparison of protective effects of young and ripened persimmon extracts against inflammatory stress induced by deoxycholic acid in small intestinal cells.

J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015c. 44:1583-1587.

Kim MG, Park MS, Eom EG, Cho EH, Lee JS. Optimal fermen- tation conditions for development of strawberry wine. J Nat Sci. 2016c. 27:20-24.

Kim MH, Kwak HJ, Yoo BH, Kim DJ, Youn SJ. Quality charac- teristics and antioxidant effects of grape juice obtained with different extraction methods. Korean J Food Preserv. 2013b.

20:784-790.

Kim MJ, Park GS. Quality characteristics of tofu prepared with tomatoes and strawberries. Korean J Food Cook Sci. 2015.

31:185-192.

Kim NY, Kim YK, Bae KJ, Choi JH, Moon JH, Park GH, et al. Free radical scavenging effect and extraction condition of ethanol extracts and fractions of wild grape seed (Vitis coigne-

tiea). J Korean Soc Food Sci Nutr. 2005. 34:755-758.

Kim SH, Lee SY, Cho SM, Hong CY, Park SY, Park MJ, et al. Antioxidant activities of Cryptomeria japonica leaves ex- tracts by extraction methods. J Korean Wood Sci Technol.

2017. 45:495-510.

Kim YJ, Shin Y. Antioxidant profile, antioxidant activity, and physicochemical characteristics of strawberries from different cultivars and harvest locations. J Korean Soc Appl Biol Chem.

2015. 58:587-595.

Ko GA, Son MA, Kang HR, Lim JH, Im GH, Kim SM. Antiox- idant activities of blueberry hot water extracts with different extraction condition. Korean J Food Preserv. 2015. 22:428- 436.

Komorsky-Lovrić Š, Novak I. Determination of ellagic acid in strawberries, raspberries and blackberries by square-wave voltammetry. Int J Electrochem Sci. 2011. 6:4638-4647.

Koo SY, Cha KH, Lee DU. Effects of high hydrostatic pressure on foods and biological system. Food Science and Industry.

2007. 40(3):23-30.

Kwon YR, Cho SM, Hwang SP, Kwon GM, Kim JW, Youn KS.

Antioxidant, physiological activities, and acetylcholinesterase inhibitory activity of Portulaca oleracea extracts with differ- ent extraction methods. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2014.

43:389-396.

Kwon YR, Youn KS. Antioxidant and physiological activities of Hijikia fusiforme by extraction methods. Korean J Food Preserv. 2017. 24:631-637.

Lee DS, Kim KH, Yook HS. Antioxidant effects of fractional extracts from strawberry (Fragaria ananassa var. ‘Seolhyang’) leaves. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2018a. 47:263-270.

Lee GB, Lee JE, Choe YU, Park YH, Choi YW, Kang NJ, et al. Effect of spermine treatment on growth, yield, and quality of strawberry under low-temperature condition. J Environ Sci Int. 2018b. 27:195-202.

Lee GD, Kim SK, Lee JM. Optimization of the acetic acid fer- mentation condition for preparation of strawberry vinegar. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2003a. 32:812-817.

Lee JM, Kim SK, Lee GD. Monitoring on alcohol fermentation characteristics of strawberry. J Korean Soc Food Sci Nutr.

2003b. 32:679-683.

Lee JM, Ko MJ, Chung MS. Physicochemical properties and

composition of ginsenosides in red ginseng extract as revealed by subcritical water extraction. Korean J Food Sci Technol.

2015. 47:757-764.

Lee SH, Kang JI, Lee SY. Saponin composition and physico- chemical properties of Korean red ginseng extract as affected by extracting conditions. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2008.

37:256-260.

Lee YJ, Kang ST. Alcohol fermentation of uncooked ground rice with ultrasonication process. Korean J Food Sci Technol.

2012. 44:306-311.

Lee YS, Jang SM, Kim NW. Antioxidative activity and physio- logical function of the Angelica dahurica roots. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2007. 36:20-26.

MAFRA. Key statistics for agriculture, forestry, livestock and agrifood industries. Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Sejong, Korea. 2016.

Marklund S, Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient as- say for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 1974. 47:469- 474.

Melecchi MI, Péres VF, Dariva C, Zini CA, Abad FC, Martinez MM, et al. Optimization of the sonication extraction method of Hibiscus tiliaceus L. flowers. Ultrason Sonochem. 2005.

13:242-250.

Meyers KJ, Watkins CB, Pritts MP, Liu RH. Antioxidant and antiproliferative activities of strawberries. J Agric Food Chem.

2003. 51:6887-6892.

Osawa T. Novel natural antioxidant for utilization in food and biological system. In: Uritani I, Garcia VV, Mendoza EM, editors. Postharvest Biochemistry of Plant Food Material in the Tropics. Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Japan.

1994. p 241-251.

Oyaizu M. Studies on products of browning reaction: antioxida- tive activities of products of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn J Nutr. 1986. 44: 307-315.

Papoutsi Z, Kassi E, Tsiapara A, Fokialakis N, Chrousos GP, Moutsatsou P. Evaluation of estrogenic/antiestrogenic activity of ellagic acid via the estrogen receptor subtypes ERα and ERβ. J Agric Food Chem. 2005. 53:7715-7720.

Park EJ, Ahn JJ, Kwon JH. Effect of reflux conditions on ex- traction properties and antioxidant activity of freeze dried-

Schisandra chinensis. Korean J Food Sci Technol. 2013a. 45:

550-556.

Park HM, Hong JH. Antioxidant activity of extracts with ex- traction methods from Phellinus linteus mycelium on Mori

ramulus. Korean J Food Preserv. 2014a. 21:565-572.

Park HM, Hong JH. Effect of extraction methods on antioxidant activities of Mori ramulus. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2014b.

43:1709-1715.

Park J, Lee J, Jun W. Radical scavenging and anti-obesity effects of various extracts from turmeric (Curcuma longa L.). J Kore- an Soc Food Sci Nutr. 2013b. 42:1908-1914.

Park JH, Bae NY, Park SH, Kim MJ, Kim KBWR, Choi JS, et al. Antioxidant effect of Sargassum coreanum root and stem extracts. Korean Soc Biotechnol Bioeng J. 2015. 30:155-160.

Park JH, Lee HS, Mun HC, Kim DH, Seong NS, Jung HG, et al. Improvement of anticancer activation of ultrasonificated extracts from Acanthopanax senticosus Harms, Ephedra sin- ica Stapf, Rubus coreanus Miq. and Artemisia capillaris Thunb. Korean J Med Crop Sci. 2004. 12:273-278.

Park NK, Chun GT, Jeong YS. Development of extraction proc- ess of protein-bound polysaccharides from Inonotus obliquus mycelia. Korean Soc Biotechnol Bioeng J. 2012. 27:177-185.

Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-

Evans C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med.

1999. 26:1231-1237.

Rho KA, Kim GJ, Ji HA, Lim HS, Chung KH, Lee KJ, et al.

Antitumor and free radical-scavenging activities of various extract fractions of fruits and leaves from Prunus mume. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015. 44:1137-1143.

Seo IY, Kim HS, Jang KS, Yeo MH, Kim HR, Jung BK, et al. Comparison of anti-oxidative activities of Perilla frutes-

cens extracts by extraction methods. J Oil & Applied Science.

2018. 35:12-19.

Shin SL, Lee CH. Antioxidant activities of ostrich fern by differ- ent extraction methods and solvents. J Life Sci. 2011. 21:56- 61.

Shon HK, Lee YS, Park YH, Kim MJ, Lee KA. Physico-chem- ical properties of Gugija (Lycii fructus) extracts. Korean J Food Cook Sci. 2008. 24:905-911.

Sin JB, Choi WY, Kang DH, Lee HY. Comparison of anti-in- flammatory activity of Spirulina maxima extract by ultra- sonication and water extraction process. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2014. 42:1852-1857.

Singleton VL, Rossi JA. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol

Vitic. 1965. 16:144-158.

Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A, Ateşşahin A. Attenu- ation of cyclosporine A-induced testicular and spermatozoal damages associated with oxidative stress by ellagic acid. Int Immunopharmacol. 2010. 10:177-182.

Woo JH, Shin SL, Chang YD, Lee CH. Antioxidant effect ac- cording to extraction method in extracts of Dendranthema

zawadskii var. yezoense and Cosmos bipinnatus. Kor J Hort

Woo JH, Shin SL, Jeong HS, Lee CH. Influence of applied pres- sure and heat treatment on antioxidant activities of young leaves from Achillea alpina and Solidago virgaurea subsp.

gigantea. Korean J Plant Res. 2010b. 23:123-130.

Yan J, Yoo DI, Shin YS. Utilization of Metasequoia (Metase-

quoia glyptostroboides) cone as a new natural dye resource

Youn SJ, Cho JG, Choi UK, Kwoen DJ. Change of biological activity of strawberry by frozen storage and extraction meth- od. J Life Sci. 2007. 17:1734-1738.

Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem. 1999. 64:555-559.