약학회지 제42권 제 6 호 552-생57(1998)
Yakhak Hoeji
Vol. 42, No. 6Bacillus sp. B-6가 생산하는 acyl CoA 합성 호소 억제 물질의 분리 및 구조 결정
김 경 자 ■김태경
순천향 대학교 생명과학부 (Received August 5. 1998)
Isolation and Structure Elucidation of Acyl CoA Synthetase Inhibitor from Bacilus sp. B-6
Kyoung-Ja Kim and Tae-Kyong Kim
D epaHment o f Life Science, Soonchunhyang University, Onyang, 336-600, Korea
Abstract—— Acyl CoA synthetase inhibitor, was purified from the culture broth of a Bacillus sp. B-6, which had been isolated from soil, by chloroform extract, silica gel column chromatography and pre
parative TLC. The purified acyl CoA synthetase inhibitor showed higher Antiiungal activity against C. al
bicans (MIC ： 8 M-g/m/). Through the analysis of UV spectrum, melting point. IR spectrum. Mass-spec- trum. 'H-NMR and '^-NMR spectrum, the inhibitor could be identified as phenazine-l-carboxylic acid.
Keywords □ Acyl CoA synthetase inhibitor, Bacillus sp. B-6, Antifungal activity. Phenazine-l-carboxylic acid.
지방의 대사는정상적인상태에서는합성과분해사이 외 균형을 잘 이루고있으나균형이 깨어졌을 때에 과콜 레스테롤중(hypercholesterolem ia)과 과지방중(hy- perlipidem ia)으로진행된다
.
이것은결국동맥경화,
고 혈압,
비만,
당뇨병과 같은심각한 병을야기시킬 수 있 다.
이러한비정상적인 지방대사에 기인한질병을치료 하기 위하여 지방 대사관련 효 소 저해제둘이 이와같은 질병치료제로관심올골고개발되기 시작하였다.
비정상 적인지방대사의 저해물질로fatty acid synthetase 저 해제인 cerulenin^이 1963년에 발견되었으나부작용때 문에 약으로는 개발되지 못하고 지방 연구외 생화학적도 구 2■3)로 널러 이용되었다
.
1983년에는 type II fatty acid synthetase억제제인 thiotetrom ydn^이 발견되 었으며 1986년에는acyl coA synthetase억제제인tri- acsiiA>l Streptomycessp. SK-1894에의해생성됨이 밝 혀졌으며.
그 중에서 triacsin A 는 ATP와 coenzyme^ 본 논문에 관한 문의는 이 저자에게로
(전화) 0418-530-1352 ( 팩스) 0418-530-1350
A
에대해서는 비경쟁적으로,
긴사슬지방산에 대해서는 경쟁적으로 작용하는것으로 보고되었다®
설치류의 간 에서 peroxisome외 proliferation에 관여하는 per- fluorodecanoic acid(PFDA) 가 쥐외 hepatocyte 에서 긴사슬 acyl CoA synthetase(ACS)의 억제제로 작용 하는것으로밝혀졌으며.
phytanic acid도ACS의억제 제로 알려져 있다.
ACS는microsome. mitochondria, peroxisome. 원형질막에 존재하는 것으로 알려져 있으 며 microsome과 peroxisome을 detergent로 처러시 ACS가 억제된다는 연구보고가 있으며 phosphati- dylcholine(P C ), phosphatidylethanolam ine (P E ), phosphatidylinositol(PE)과 sphingom yelin (SM ) 등 외인지질이ACS를억제하는것으로보고되고있다.
세 계적으로 식생활 양식이 육류위주로 바낌에 따라 과지 방.
과콜레스테롤중환자가급중하고 있어서 지방산 대 사 관련효소의 저 해 제 개 발 시 그 시장성이 매우클 것 으로 생각된다.
지방대사^®와 관련된 효소로서 fatty acid thiokinase 파'브스는 long chain- 과 m edium chain- 이 있는데,
long chain-fatty acid thiokinase(EC 6.2.552
1.3
)는acyl CoA synthetase
로Ce-C
2o acid
에작용하고medium chain fatty sdd thiokinase(EC 6.2.1.2
)는butyryl-CoA synthetase
로C4-C11 acid
와3-hy- droxy-and 2.3- or 3,4-unsaturated acids
에 작용한 다.
두 효소모두acyl-activating enzyme
■으로불리운 다. acetyl CoA synthetase(EC 6.2.1.1
)는acetate
룰acetyl CoA
로전환시키는효소로propanoate. prope- noate
에도 작용히는acetate thiokinase
로acyl-ac- tivating enzyme
으로도불러운다. Acyl CoA synthe
tase (EC
6.2.1.3. fatty acid thiokinase
)는free fat
ty acid
외COOH
기틀ATP
를 이용하여CoA
외SH group
과thioester
결합형성을 촉메하여active thio
ester
인acyhCoA
로변화시키며/^'^^^
지방산대사와지 질생합성^""^
너1 중요한역활을한다.
지방산이산화되거 나 지질로합성되기 위해서는 던저acyl CoA synthe- tase
에 외해 지방산의COOH
기가ATP
존재하에서CoA
외SH
기와thioester
결합을하여 활성화가되어야 한다mi
7i8)
본 실험에서는 미생물 2차 대사산물로부터acyl CoA synthetase
억제제를찾아 지방 대사의 불균 형을 치료할 수 있는 치료제"^^높 개발하고자 하였다.
지방산 대사를 억제하는 억제제 개발외 일환으로
acyl
CoA synthetase
억제제를 생산하는 토양균을 분리하 여특성을 조사하고 억제제 생산의 최적 조건을조사하 여전보2^에 보고하였다.
본 연구에서는분리한 Bacillussp. B~
6의배잉창■등액에서 억제제를 분러.
정제하여 그 이화학적특성을조사하고구조를규명하여 보고하는바 이다.
실험방법
시약 및 기기
-
배지에 사용된 시약 및CoA-SH.
acyl CoA synthetase (from
Pseudomonas),linoleic acid
등의 시약둘은Sigma
사에서 구입하였으며,
사용 된 용매는HPLC
용으로 구입하여 그대로 사용하였다.
최중적으로 얻어진 정제 시료를
UV scanning. Infra Red spectroscopy
와Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
등을 행하였다. 50 M
삼외분러된저해물질 을 클로로포룸에 녹인 후. UV-visible spectropho- tomerCJasco V550 spectrophotometer
)를 이용하여 자외선 흡수 스펙트럼을 얻었으며.
2 0 0 나유의저해물질 과5
용외KBr
을 흔합하여pellet maker
를통해pellet
을 형성시킨후에
4.000^400 cm
■"의적외선 범위내에서
IR spectrophotometer(Perkin Elmer 1710
)틀 이 용하여 저해물질의 적외선흡수스펙트럼을측정하였다.
분리된 저해물질외 분자량 결정은
Kantos MS 25 RFA Mass
기기를 이용하였고.
저해물질을CDCI
3에 녹여JEOL JNH-GSX 400 NMR spectrometer(400 MHz
)로NMR
분석을 하였다.
이때 내부표준물질로는TMS (tetramethylsilane)
를사용하였다.
사용균주및사용배지
-
전보2릭1서 보고한대로토양에서분러하고동정한
sp. B-
6를사용하였다.
균주는한천배지에 접종하고 계대 배양하여
4°C
에보관 하였다.
중균배양은glucose 0.1%, starch
2 .4 % ,pep
tone 0.3%. meat extract 0.3%, yeast extract 0.5%, CaCOs 0.4%(pH 7.0
)가되도록 배지를 만들어 사용하 였으며,
본 배양은glucose
1.
0%, soluble starch
1 . 0%, urea 0.3%, oatmeal 1.0%, parmamedia 1.0%, basic magnesium carbonate 0.5%(pH 7.5
)을함유한 배지를사용하였으며30T
：에서7
애 일 간 배양하였다.
저해 활성 측정
- 150 mM tris-HCl bufFer(pH 7.4
)에0.25 mg Triton~X 100, 2 mM EDTA. 50 mM MgCls. 20 mM ATP, 300
나]VI CoA-SH,
억제제 와0.1 unit
의Acyl CoA synthetase
를전체부피0.25 m
/이 되게한후37°C
에서30
분간preincubation
하였다
.
그후2 0 0 나M
의sodium linoleic acid
를 첨가하고37°C
에서10
분간preincubation
한다옴0.1 ]V
[의po- tassium phosphate buffer(pH 8.0
)에 녹인0.5 mM
의
5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) 0.75 mi
를 첨 가한후에413 nm
에서 흡광도를 측정하였다. Control
은 반응 마지막에 효소를 첨가하였다
.
이러한조건하에 서의CoASH
의molar extinction coefficient
^^^는1.36
xKMcnT
^로알려져 있다.
억제활성은다옴과같이 계산하였다
.
Inhibition (% ) = (1 — ~
요
삐^^ ) X 100 Aeon — AsupA,,.n
：control, Asup
：억제제를 녹인 용매틀 첨가한 반응액외 반응후외 흡광도.
：억제제틀 첨가한 반응액의 반응후의 흡광도
•
Acyl CoA 함성 효 소 억제 물질의 정제
전보""엑
acyl CoA
합성효소 억제물질외 분리를 위 한 예비 실험에서corn steep liquoiii-
함유한acyl
CoA
합성효소 억제물질 생산 배시에 Bacillussp. B-
김경자■김태경
6를 배양한 경우에는 배지외 색의 변화가 없었으나
.
com steep liquor
대신NH
4CI, (NH
4)
2S
0 4나urea
를 첨가한 배지의 경우에는5~6
일째부터 배지의 색이녹 색으로 변하였다.
또한 녹색으로 번한배지의 상등액으 로 항균력 검사률한결과,
Candidaa/b/cans
에대한 항 균력도 급증하였고, com steep liquor
를 질소원으로 사용한 경우에는 유기용매에 대한추출성을 비교한결 과.
부탄올추출액에서 항균력과효소억제활성이최대 였으나,
이와는달리NH
4CI, (NH
4)
2SC»
4나urea
를 질 소원으로첨가한배지의 경우에는클로로포름추출액에 서 항균력과acyl CoA
억제 활성이 높은 것으로 나타 났다.
본연구에서는녹색으로 번한균주배양액을원심 분리하여 얻어진상등액올클로로포름과3
：1
외비율로 하여3
회추출한 후감압 농측하였다.
농측된 클로로포 름 추출액을 클로로포름 ：아세론(5
：1
)로 미리 평형시 킨Silica gel column( 2.8x50 cm
)에흡착시킨 후에 동일 용매로 용출한후 클로로포름 ：메탄올 ( 1 0 ：1)로 이어서 용출하였으며50 m//hr
외속도로5 mZ
씩분획 하였으며，효소억제활성이 높은분획을모아감압농측 하였다. Silica gel chromatography
를거쳐농죽된활 성용액을silica gel
이 피막된plate(Kiesel gel 60 F 254
) 에점적한 다옴클로로포름-
메탄올(10
：1
)로 전개 하여 잘 말리고 활성이 확인된Rf 0.77
부근외silica plate
를 일정 간격으로spatular
로잘긁어내어 클로로 포름으로추출하여감압농측하였다.
M IC 측정 - 정제된 억제물질올
600~0.2 jig/mZ
외 농도 범위로dimethylsulphoxide-phosphate buff
ered saline, pH 7.4(5
：95
)에 희석한후에agar dif
fusion
방법으로식물병원성 곰광이를비롯한9
종외시 험균에대한생육저지 최소농도(MIC
)를측정하였다.
Acyl CoA 합성 효소의 억제활성의 dose-response curve 작성
-
정제된 억제 물질을 평량하여 1 . 0^ig
에 서1,000 |ig
까지 번화시켜acyl CoA
합성 효소의 억제 활성정도를측정한후에억제제의 양에 따른억제활성 정도를dose-response curve
로작성하였다.
Acyl CoA 합성효소억제물질의이화학적특성조사
용해도및안정성
- Acyl CoA
합성 효소 억제 물질 외 용해도 및 안정성은 시료를n-hexane, chloro
form, ethyl acetate, n-butanol, water
등의 용매에 녹인 후,
각각4°C
와50°C
에서 하루 방치한후에 잔존 활성을조사하여 결정하였으며100°C
에서15
분가열한후 식혀서 잔존활성을 조사하여 온도에 대한 안정성을 조사하였다
. pH
에 대한 안정성은 억제제를 녹인 용액 을pH 2, 7, 10
으로 한후4
시간후에중화시켜 억제 활 성을조사하였다.
결과 및고찰
Acyl CoA 함성효소억제물질의생산과정제
Bacillus
sp. B~
6균주를urea
를함유한억제제 생산배 지에30°C
에서7
일간 배양후10 liter
외 균액을8,000 rpm
으로15
분간 원심분리하였다.
원심분리한 균체를acetone
추출을행한결과acyl CoA
합성효소 억제 활 성을가지는물질이균체내부에는존재하지 않고배양상 등액에서만 발견되었으며, pH 6.0~9.0
에서 안정하고pH 2.0
에서그활성을완전히상실하였다.
온도안정성 을검토한 결과100°C
에서15
분가열후식혀서 활성을 조사한결과65
% 의활성이 남아있었다.
억제제률분리 하기 위하여 배양상등액을클로로포름과3
：1
의비율로 섞어 추출하여 감압중류하여 녹색의 물질을 얻었다.
이 것을silica gel
칼럼에 흡착후클로로포름 ：아세론(5
：1
)으로용출시켜Rf
치가높은물질올 얻고이어서클로Culture broth
centrifuge at 8,000 r p m
Supernatant
extract with chloroform ( 3 ： 1 }
Silica gel c o l u m n chr oma tog rap hy
elute with chloroform ； acetone ( 5 ： 1 a n d with chloroform ： methanol ( 10 ：
Preparative T L C
develop with chloroform ： methanol ( 10 니 I
Active b a n d
extract with chloroform a n d evaporated
Inhibitor Rf = 0.77 )
Fig. 1 — Purification Steps of acyl CoA synthetase ir hibitor from Bacillus sp. B-6.
Pharm. Soc. Korea
1 10 1 0 0 1 0 0 0 C o n c e n t r a t io n o f i n h i b i t o r ( u g / m i ) Fig. 2 ~ Dose response curve of acyl CoA synthetase in
hibitor from Bacillus sp. B-6. Different concen
tration of acyl CoA synthetase inhibitor from Bacillus sp. B-6, was added in the acyl CoA synthetase inhibitor assay mixture and the in hibitory activity was measured.
Table H — Physico-chemical properties of the acyl CoA synthetase inhibitor from Bacillus sp. B-6 Nature
UV ^max nm
M elting point Molecular weight Molecular formular TLC Rf. value*
EtoAc EtoAc CHCla
Yellow powder 247 nm . 362 nm
(in chloroform) 238"C
224 C13H8N2O2
Benzene (2 ： 8) 0.43 Benzene (1 ： 1) 0.68 Methanol (10： 1) 0.77
Solubility, soluble Benzene, CHCI3, Ethyl acetate insoluble H2O, n-hexane. methanol
* Precoated silica gel plate (Merck)
tanol, hexane, 물에는 용해되지 않았다
.
분리된 억제 물질은 U V 247 n m , 362 n m에서 최대 흡수파장을 보 였으며,
IR spectrum에서는 3400 crrT 체서 carboxyl 산에 의한흡수를 보여주며,
3000 c m■벽 흡수는 arom atic C-H bo nd를 나타낸다
.
또한 1640, 1430, 1400 c m "엑 흡수대로부터 arom atic C-C, O N bo n d의존 재를 알 수 있었다.
M ass spectrum으로부터 base peak는 180, m olecular peak는 224임을 확인하였다.
^H~NMR spectrum에서 15.50 p p m외singlet은 C 0 - 0 H group을
,
8.9 8 ^7 .9 7 p p m부근에서 7개의 arom atic proton signal을 각각 관찰할 수 있었다
.
N M R spectrum에서는 165 p p m에서 C = 0 group 탄 소의 signal이
.
145— 125 p p m에서 arom atic 탄소외Candida albtcans 8
Botrytis cinerea Saccharomyces cerevisiae Staphylococcus aureus Micrococcus luteus Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli 34
로포름 ：메탄올(10 ：1)로용출시켜 R f처가 낮은물질을 얻었다
.
이중에서R f처가높은분획이 억제 활성이 높아 이것을 감압증류후silica gel plate에 점적하고 클로로 포룸:
메탄올(10:
1)로 전개시킨 결과 R f치가 0.77, 0.53인두 개의 물질이 분리되었으며 이중에서 억제 활 성이높은 것으로나타난R f처가0.77인것을spatular 로긁어 클로로포름으로추출후감압 증류하여 구조 결 정을하였다Fig. 1과같은정제 과정을거쳐 acyl CoA 합성 효소 억제 활성을 갖는 물질을 순수 분리하여KJH-1-133-D로 명명하였으며 노란색의 분말이었다
.
전보에서 질소원에 따른 항균력을 비교해 본바
NH4-
N
0 3를질소원으로이용하였을경우에는항균력이 나타 나지 않았으므로,
항균력을나타내는 이노란색 물질외 샘산에 관여하는 효소의 활성에NH
4NO
3가 어떠한 영 향을미처는지연구되어야할것이다.
억제물질의생물학적특성
-
식물 병원성 곰광이를 비롯한 여러 시험균에 대한 정제된 효소 억제제의 M IC 값을 Table I에 나타내었다.
분리한 이억제물질이 여러 bacteria에 대해서도 항균 활성을 보였으며
,
Candida
a/fo'ams
와 Botrytis 와 같은 곰광이에도억제 활성을 보이는 것으로 나타났다
.
특히 Botrytiscinerea는 사과
,
배,
토마토 등외 수확후 저장중에 흔히 발생하는 겟빛 곰광이병을 야기하는 것으로 알려져 있 으므로,
분리한 억제 물질이 미생물 농약으로의 사용가능성에 관한 연구가 필요할 것으로 본다
.
Dose response curve를Fig. 2에나타내었으며
,
억제제의 양에 따라100 ng/m/
까지는 효소 억제 활성이 비례적으로 증가되었으며ICso
는42 Hg/mZ
로나타났다.
억제물질의이화학적톡성및구조결정
-
분리된 억 제물질의 이화학적 특성을 Table I I에나타내었다.
분리된 억제 물질은 노란색 분말로 m eltin g point는
238°C였그1, Benzene, ethyl acetate ethanol, chloro
form, D M S O , acetonitrile, acetone에잘녹았고me- Table I — MIC values of acyl CoA synthetase inhibitor
족^ 1 nn
Test organism M IC i\ig /m l) ^
I 80
:d S 60
I 40
I
"0김경자■김태경
0
Phenazine-1 -carboxylic acid
Fig. 3 —— Proposed structure of acyl CoA synthetase in hibitor from Bacillus sp. B-6.
signal이관측되었다
.
이상에서 열거한이화학적 특성과 기기분석 결과들을 중합하여 볼 때.
K JH-l-133-Ife C13
H8
N2
O2
의 화학식을 가지는 phenazine-1
-carbo-xylic acid
22
(PCA )로 추정되었으며 문헌^Ml
수록된 phenazine-1
-carboxylic acid와 각중 spectrum da- ta 가 일치하여 그 구조틀 phenazine-1
-carboxylic acid로 동정하였다(Fig. 3). Phenazine-1-carboxylic acid는 밀의 뿌러에 병을 유빌하는 Gaeumannomyces graminisvar. tritici의 생육을억제하는중요한항생물질 로알려져 왔으며Psewiiomonfls
에서 생산되는것으로보 고 되 었 다 본 연구에서는 Bacillussu2Th7is
균종에서 PCA 가생산되었으며 Candfiifl fl/fcm s에대해 항균력을 가지며 acyl CoA 합성 효소억제 효과를갖는것으로나 타났다.
앞으로 PCA외 acyl CoA 합성 효소 억제 기작 을연구하고새로운 억제제의 개발을위하여유도체둘을 함성하여 억제 활성을 중가시키는 쪽으로더 많은 연구 가 필요할 것으로본다.
또한PCA외 생 함 성 ^ 관 여 하는 효소에 관하여 현재까지는 shikim ic acid path- way에 관여하는 효소와유사한 것으로 추측하고 있을 뿐아직 정확하게 밝혀지지 않았으므로.
이에 관한 생화 학적 연구를 수행하고PCA
의 생산을 중대시키는 방범 에관한연구를앞으로계속할예정이다.
결 론
미생물 대사산물로부터 acyl CoA 합성효소 억제물질 탐색 연구를 수행하던 중 Candida a/fTfoms에 항균력을 가지며 acyl CoA 합성 효소에 강한억제 활성을가지는 물질을생산하는Bacillussp. B
-6
균을선별하여무기 질소원을 변형시켜 조사한 바
urea. (NH
4)
2S
0 4, NH
4CI
을사용한 배지에서 녹색으로 배지가 번하는 것을관찰
하였으며
.
이조건하에서 균주 배양액의 클로로포름 추출액에서 Candida fl/tom s에 대한 항균활성이 높고
acyl CoA 합성효소억제활성이 높은물질을분리
,
정제 하여 이화학적 룩성을조사하고 구조 분석을 행하였다.
균배양액으로부터 클로로포롬추출
,
silica gel colum n chrom atography와 preparative T LC를 통하여 억제 물질을 순수 분리하였으며,
U V . IR . N M R , N M R 등의 기기분석을 한 걸과 phenazine-1-car- boxylic acid로동정하였다.
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