[특별기획(Ⅱ)] 나노재료 표면 위의 효소코팅을 통한 효소 안정화 시스템 개발

서론

효소는 식품, 의약품, 화학변환, 바이오센서, 바이오 연료 등의 분야에서 중요한 역할을 하는 나노 크기 수 준의 강력한 생촉매이다. 그러나 이들 효소들은 불안 정한 활성도 때문에 항상 이용에 제약을 받고 있으며 현장에서 실제적으로 활용되기가 어려운 것이 현실이 었다. 하지만 최근에 나노기술이 발전함에 따라, 나노 입자, 나노섬유, 다공성의 실리카, 캡슐화를 위한 솔- 겔 구조 등의 나노재료들이 개발되었고, 이들을 통해,

효소를 안정화 시킬 수 있는 전략들이 보고 되면서 새 로운 관심을 받게 되었다. 본 기고는 효소 안정화 시 스템 개발과 관련한 소개로서 나노재료를 이용하여 효소의 흡착, 공유결합, 캡슐화 등의 기술에 대해 주로 서술하고 있다. 특히 이들 재료들은 다양한 위치에서 효소와 상호 결합을 통해 단백질의 변성을 감소시키 고, 동시에 효소의 안정성을 증가시키는 결과를 낳게 한다. 반응할 수 있는 표면적이 넓어진 장점은 더 많 은 효소가 교차 결합되어 결정체를 이루고, 뭉쳐져 코

나노재료 표면 위의 효소코팅을 통한 효소 안정화 시스템 개발

황이택, 구만복*

고려대학교 생명과학대학 {ethwang, *mbgu}@korea.ac.kr

조포러스 물질은 표면적이 넓고, 기공 부피가 크며 화 학적으로 안정한 구조를 가지고 있다. 반응 후 회수, 재사용이 힘들고 수명이 짧은 효소의 단점은 메조포 러스 물질과 같은 담체를 사용함으로써 극복할 수 있

다. 따라서, 사용환경에 맞는 적절한 메조포러스 물질 의 선택과 변형은 효소 고유의 특성을 살리면서 더 많 은 기능을 지닌 나노촉매 시스템으로 발전할 것이다.

그림 1. 전기방사법에 의한 고분자 나노파이버 생산 [ACS symposium series (2007)].

팅된 상태로 이루어진 구조체를 이루면서 효소의 로 딩양 증가와 안정성 증가를 가져오게 된다. 본 고에서 는 이 들 효소안정화 시스템 중에서도 특히 나노섬유 와 다공성나노입자를 캐리어로 활용하는 시스템에 대 한 내용에 초점을 맞추어 기술할 것이다.

나노섬유를 이용한 효소 고정화

여러 종류의 나노재료 중, 나노섬유는 효소를 결합 하거나, 갇히게 하는 넓은 표면적을 제공할 뿐만 아니 라, 내구성 있고, 쉽게 분리가 가능하며, 반응기질이 효 소의 활성자리와 만나는 확산경로를 감소시키는 등의 장점 때문에 효소 고정화의 재료로서 이용되고 있다.

1) 전기방사에 의한 나노섬유합성

전기방사법에 의해 생산된 나노섬유는 매우 간단한 장비와 다양한 고분자를 재료를 이용하여 균일한 직 경으로 대량생산 할 수 있으며, 생분자들과 상호작용 하여 하나의 나노 구조물을 형성하는 것이 가능하여 효소 안정화에 효율적으로 이용될 수 있을 거라는 기 대와 주목을 받았다. 전기방사법은 모세관속의 고분 자 용액에 높은 전압이 공급될 때, 정전기적 반발과 columbic forces에 의해 바늘로부터 수집장치 위로 빠 져 나오게 된다. 고분자 용액이 계속 나오는 동안 용 매는 증발하고, 나노크기 수준의 섬유가 임의로 뭉쳐 져서 수집되는 것이다[그림 1].

2) 나노섬유를 이용한 효소 고정화

최초의 나노섬유를 이용한 효소 안정화 연구는 Ping Wang 연구팀에 의해 보고 되었다. Polystyrene (PS)을 재료로 전기방사법으로 나노섬유를 만들어 냈고, 이 나노섬유에α-chymotrypsin(CT)을 고정화 하였다. 수용액이나 유기용매에서 고정화된 CT의 활 성도는 자연상태 보다 18배 가량 더 높은 것으로 나타 났다. Zhi-Kang Xu 연구팀은 poly arculonitrile-co- maleci acid(PANCMA)를 나노섬유 재료로 이용하 여 lipase를 고정화한 연구를 보고하였고, 그밖에 많은

연구팀들에 의해 catalase, peroxidase 등의 모델 효소 를 이용한 고정화한 결과가 보고되었다. 본 연구팀은 polystyrene과 poly(styrene-co-maleic anhydride)의 고분자 혼합물을 전기방사법을 통해 생산함으로써 기 능기가 부여된 나노섬유를 개발하는데 성공하여 효소 와 공유결합시키기 위한 단계들을 생략할 수 있고, 나 노섬유 표면으로의 효소코팅을 위한 적합한 재료로 사용될 수 있는 것이다. 또한 나노섬유에 탄소나노튜 브를 넣음으로써 효소 기반 바이오센서의 응용 가능 성을 보이는 연구도 진행중이다. 이렇듯 나노섬유는 다양한 전·후처리를 통해 표면을 많은 분야로의 광 범위한 응용 가능성을 보여 주고 있다.

3) 나노섬유 안으로의 효소코팅

전기방사법을 통해 생산한 나노섬유 표면에 효소를 코팅하는 방법이 아닌 효소-고분자 합성물을 이용하 여, 직접 전기방사법을 통해 나노섬유를 합성하는 연 구도 진행이 되었다. 만들어진 효소-나노섬유에 글루 타알데하이드(GA)처리를 하게 되면, 나노섬유 안의 효소의 안정화에 큰 도움을 준다. 그 결과 2주 동안의 교반조건(200 rpm)에서도 활성이 유지된 것을 확인 하였다. 게다가 단위나노섬유당활성도를 3배 가량 증 가시키는데 이것은 GA처리로 인해서, 효소의 아민그 룹이 효소간의 교차결합 및 코팅을 유도함에 따라, 효 소의 안정성을 증가되는 결과를 낳는 것이다.

효소코팅을 통한 효소 안정화

나노섬유 표면 위에 효소코팅을 통한 효소 안정화 전략은 다음의 그림과 같다[그림 2]. 효소는 나노섬유 가 지닌 기능기와 공유결합을 통해서 나노섬유의 표 면에 부착된‘seed’자리로서의 역할을 한다. 다음으 로 공유 결합된 효소-나노섬유 구조체에 더 많은 양 의 효소가 첨가되어, 서로 가교결합을 하게 되는 것이 다. 따라서 가교 결합된 효소끼리 서로가 뭉쳐져서 코 팅된 나노효소 구조체를 완성하는 것이다. 나노섬유 는 효소가 고정화될 수 있는 넓은 표면적을 제공하여,

특·별·기·획(Ⅱ)

많은 양의 효소가 로딩되게 하고 다층의 효소 코팅을 통한 몇 배 이상의 활성도 증가를 가져다 준다. 효소 안정화의 결과는 효소 코팅이 나노섬유 표면에 매우 단단하게 겹합되어 있는 것을 말해주며, 세척 및 교반 조건에서도 우수한 안정성을 제공한다. 또한 다양한 고분자 용액을 사용할 수 있는 유연성 때문에 나노섬 유는 무기 용매나 유기 용매에서도 쉽게 생산된다.

1) α-chymotrypsin(CT)의 코팅을 통한 안정화 시스템 구현

본 연구팀은 PS와 PSMA 나노섬유의 크기에 따른 효소 코팅 효율성 정도를 판단하기 위해, 3.04±1.03 마이크로미터의 마이크로섬유와, 444±106 나노미터 수준의 나노섬유를 제작하였다. PSMA는 maleic anhydride(MA)라는 기능기를 가지고 있어 효소의 아미노 그룹과 쉽게 공유결합을 형성할 수 있다. CT 를 모델 효소로 나노섬유 표면에 공유결합 시킨 결과 PS만 이용하여 만든 나노섬유 보다 그 활성도에 있어 서 1.9배 높은 것을 알 수 있다. Maleic anhydride (MA) 그룹이 효소와의 공유결합을 더 안정화시키는 것이다. 그러나 공유결합을 한 효소고정화 시스템은 그 안정성에 있어서 진동조건(200 rpm)에서는 만족 할 만한 수준은 아니었다. 더 안정하고, 활동적인 효소 시스템을 개발하기 위해서, CT를 나노섬유 위에 글루

타알데하이드(GA)를 이용하여 코팅하는 기술을 개 발하였다. 단순히 공유결합으로만 고정화된 시스템과 비교해보면 한달 이상 CT가 빠져나가지 않은 상태 로 자기분해를 차단하는 효과와 함께 높은 안정성과 활성도를 유지하였다[그림 3]. 즉, 공유결합으로 나 노섬유 위에 붙은 효소들이 코팅되고 응집되는 것이 효소 고정화의 안정성에 매우 중요한 역할을 하고 이 것이 높은 저장 및 재사용을 위한 안정성에 기여하는 것이다.

2) Esterase 코팅을 통한 효소연속반응기 구현 본 연구팀은 PS-PSMA 나노섬유를 이용하여 Esterase를 모델효소로서 나노섬유 표면에 코팅하였 다. Esterase는 에스터 그룹을 가수분해하는 기능을 가지고 있기 때문에, 의약이나 식품 생화학적, 생분해 적 과정 등에 있어서 활용의 가치가 높은 효소이다.

Esterase-나노섬유 시스템은 그들의 활성도를 100 일 동안 처음의 80% 이상을 유지하였다 매번 반응 후 워싱을 거쳐서 30번의 재사용을 거쳤지만 활성도는 항상 82% 이상을 유지하였다. 그리고 이 esterase-나 노섬유 시스템을 이용하여, 부피가 10 mL의 작은 규 모의 연속효소반응기에 적용해보았다. 교반자석을 이 그림 2. 나노파이버를 이용한 효소 코팅 전략 [Trends in

Biotechnology 26 11 (2008) 639].

그림 3. PS-PSMA 나노파이버 표면에 코팅된 CT 구조체, 공유결합된 CT 구조체, 흡착된 CT 및 자연상태의 CT의 안정성 비교 [Nanotechnology 16 (2005) S382].

특·별·기·획(Ⅱ)

용해서 기질에 대한 반응이 잘 일어나도록 유지하였 고, 펌프의 속도를 다르게 하여 희석률(D)을 조절하 였고, 일정한 속도로 기질을 반응기 안으로 공급해주 었다. 기질을 투입하는 순간 생산물(p-nitrophenol)의 농도가 점차 증가하다가 평형상태로 도달하면서 농도 가 일정하게 유지되었다. 반응기를 장시간 작동시키 는 동안에도 나노섬유에 코팅된 esterase는 그들의 활 성도를 전혀 잃지 않은 상태로 유지한채 평형상태로 도달하였다.

3) 자성나노입자 (magnetite@실리카) 표면으로의 효소코팅

마그네틱 나노입자를 실리카쉘로 코팅하고, 그 위 에 아미노 그룹을 부여하면서 효소와 공유결합 나아 가서 코팅할 수 있는 재료를 보고되었다. 이렇게 합성 된 magnetite@실리카 표면에 α-chymotrypsin과 lipase를 효소코팅 방법으로 고정화하였으며, 공유결 합에 의한 방법보다 담지량이 각각 3배, 1.5배 이상 증 가하는 결과를 보여주었고, 30번 이상의 재사용 및 15 일 이상의 진동조건 (200 rpm)에서도, 그 활성도가 90% 이상 유지 되었다. 또한 효소-magnetite 입자가 분포함으로써, 자석으로 쉽게 분리할 수 있는 특징이 부여되어 자성을 이용하여 효소를 쉽게 분리하여 재 사용 할 수 있게 되었다[그림 4].

4) 자성 나노입자를 포함한 나노섬유 표면으로의 효소코팅

쉽고 효과적인 분리를 위해서, PS-PSMA 고분자 용액에 자성 나노입자를 구성물로 하여, 전기방사에 의한 나노섬유를 합성하였다[그림 5]. 자성을 띠는 성 질에 더해져, 좌석으로 쉽게 분리할 수 있는 장점을 지니고, PS-PSMA 나노파이버의 가장 큰 장점인 기 능기 역시 지니고 있기 때문에, 효소를 공유결합후 교 차결합시켜서 코팅할 수 있는 재료로 사용 또한 가능

그림 4. magnetite@실리카에 코팅된 효소의 반응 및 분리

[Small 4 (2008) 143].

그림 5. 자성나노입자를 포함한 나노섬유 [Bioprocess and Biosystems Engineering 33 141 (2010) 141].

서론

바이오 연료전지는 물질의 화학적 에너지를 전기 에너지 형태로 바꾸는 에너지 변환 장치의 일종이다.

일반적으로 통칭되는 전지와 마찬가지로 양극과 음극 을 가지고 있으며, 각 전극에 있어서 에너지 전환의 촉매로서 미생물 또는 효소를 이용하는 것을 그 특징 으로 한다. 바이오 연료전지의 구동원리는 전해질 내 에 존재하는 기질과, 효소에 의해 촉진되는 화학반응 에서 생성되는 전자를 전극을 통하여 외부로 끌어냄 으로써 전력을 생산하게 된다.

전자의 생성/소모는 효소 내에 존재하는 보조인자 의 산화/환원을 직접 이용하는 경우와, 효소 반응의 생성물이 전자와 반응하는 경우가 있다. 현재까지 글

루코스 산화효소(glucose oxidase; GOx)를 이용한 결과가 많이 발표되었으며, GOx의 경우 글루코스 분 자 1개를 분해하여 2개의 전자를 생성시킨다. 바이오 연료전지의 성능은 이러한 과정에서 생성되는 전자의 수와 생성된 전자의 전달효율에 의해 결정된다. 생성 되는 전자의 양은 전극에 존재하는 효소의 양에 관련 되며, 전자전달능력은 효소와 전극간의 위치관계나 결합형태 등에 기인한다.

바이오 연료전지 기술의 현주소

효소 기반의 반응은 기질에 대한 선택성이 높아 부 가 반응이 거의 없다. 무기 촉매의 경우, 다양한 산화/

환원 반응을 촉진시키므로 부적합한 반응을 막기 위 하다. 자성을 띠는 나노섬유 표면에β-glucosidase를

코팅하여, 30일 이상 대략 처음의 70% 이상의 활성도 를 유지하는 결과를 보여주고, 이것은 공유결합시에 만 나타나는 활성도의 33배 높은 증가의 효과를 가져 온다. β-glucosidase는 잠재적으로 에탄올 생산시 이 용되는 셀룰로즈 기반 세가지 효소들과 관계하여, 증 가된 생산량을 이끌 수 있는 연구로 이용될 것이다.

결론

최근 다양한 나노재료를 이용한 나노섬유, 나노입 자, 나노튜브 등의 합성 및 발전은 생명공학 분야에 많은 관심을 끌고 있다. 특히 나노섬유는 합성의 간단 함과 유연성 때문에 모양과 크기를 쉽게 조절할 수 있

고, 다양하게 이용할 수 있다는 장점 또한 지니기 때 문에 폭넓게 이용되고 있다. 지금까지 나노재료의 응 용 분야 중 효소 안정화 시스템 개발의 일환으로, 나 노재료 표면에 효소가 공유결합, 코팅된 구조체 개발 에 대해 자세히 언급하였다, 안정하고, 활성이 강한생 촉매 시스템으로서의 나노재료-효소 결합 시스템은 생물학적 환경정화, 바이오센서, 생합성 등 효소를 안 정하게 유지시켜주는 것이 관건인 여러 분야에 활용 하는 대안으로도 충분히 가치가 있기 때문에 광범위 한 분야로부터 주목을 받고 있다. 나노재료를 합성하 고 조절하는 데 있어서는 여전히 풀어야 할 문제가 많 지만, 그럼에도 가까운 미래에는 나노재료가 지금보 다 훨씬 다양한 분야에 응용될 것이다.

바이오 연료전지 응용

권기영, 정희태*

한국과학기술원 생명화학공학과 {kwonki, *heetae}@kaist.ac.kr