Inhibition of Type II Diabetes in ob/ob Mice and Enhancement of Mitochodrial Biogenesis in C2C12 Myotubes by Korean Mistletoe Extract

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한국산 겨우살이 추출물(KME)의 2형 당뇨 억제 및 근육세포 미토콘드리아 생성 증가 효과

정회윤^1,2,3*․유영춘⁴*․김인보^1,5․성낙윤⁴․최옥병⁶․최보화³․김종배^1,5

1한동대학교 생명과학과, ²포항공과대학교 생명과학과

3포항테크노파크 바이오소재평가센터, ⁴건양대학교 의과대학 미생물학교실

5포항테크노파크 바이오사이언스연구소, ⁶호서대학교 바이오산업학부

Inhibition of Type II Diabetes in ob/ob Mice and Enhancement of Mitochodrial Biogenesis in C2C12 Myotubes by Korean Mistletoe Extract

Hoe-Yune Jung^1,2,3*, Yung Choon Yoo^4*, Inbo Kim^1,5, Nak Yun Sung⁴, Ok-Byung Choi⁶, Bo-Hwa Choi³, and Jong-Bae Kim^1,5

1Department of Life Science, Handong Global University

2Department of Life Sciences, Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, POSTECH

3Pohang Center for Evaluation of Biomaterials and ⁵Institute of BioScience, Pohang Technopark

4Department of Microbiology, College of Medicine, Konyang University

6Department of Bioindustry, Hoseo University

ABSTRACT In this study, the anti-diabetic activity of a cold water extract of Korean mistletoe (KME) was investigated in C57BL/6J Lep ob (ob/ob) mice. Oral administration of KME (50 or 100 mg/kg/d) significantly inhibited the level of blood glucose of ob/ob mice after 5 days from the beginning of KME treatment. And the anti-diabetic effect of KME was stabilized 10 days after oral administration, showing a substantial reduction of blood glucose levels by more than 20% as compared with control mice. The results of oral glucose tolerance test (OGTT) revealed that oral administration of KME gave rise to a remarkable improvement in overall glucose response. Oral administration of KME in ob/ob diabetic mice also significantly reduced blood total cholesterol (TCHO) and triglyceride (TG) levels compared with the diabetic control mice. Moreover, in an in vitro experiment using C2C12 myotubes, treatment of KME prominently increased glucose uptake. Interestingly, KME significantly increased the expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α (PGC-1α), a head regulator of mitochondrial biogenesis and oxidative metabolism, and PGC-1α-associated genes such as glucose transporter type 4 (GLUT4), estrogen-related receptor-α (ERR-α), nuclear respiratory factor-1 (NRF-1), and mitochondrial transcription factor A (TmfA) in C2C12 cells. These results suggest that KME has potential as a novel therapeutic agent for diabetes, and its anti-diabetic activity may be related to the regulation of mitochondrial biogenesis.

Key words: Korean mistletoe, diabetes, metabolic syndrome, mitochondria, ob/ob mice

Received 12 November 2014; Accepted 31 January 2015 Corresponding author: Jong-Bae Kim, Institute of BioScience, Pohang Technopark, Gyeongbuk 790-834, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-10-9412-8724

*These authors contributed equally to this work.

서 론

최근 급속한 경제성장과 식생활의 서구화, 운동량 부족 등의 이유로 국내 당뇨인구가 급증하고 있는 추세이다. 이는 비단 한국뿐만 아니라 전 세계적으로도 커다란 문제로 대두 되고 있어 많은 치료제들이 당뇨를 극복하기 위한 대안으로 개발되고 있다. 하지만 이러한 치료제들은 매우 경제적이지 못하고 많은 부작용을 수반한다. 이러한 이유로 인해 동양의

여러 나라들(한국, 중국, 일본)은 천연물을 이용하여 많은 항당뇨 식품이나 치료제를 개발 중에 있다(1-3). 이러한 천 연소재들은 부작용이 거의 없고 매우 경제적이므로 개발만 이루어진다면 매우 효율적으로 이용할 수 있다.

겨우살이(mistletoe, Viscum album var. coloratum)는 여러 종류의 나무를 숙주로 하여 생장하는 반기생식물로서 세계 전역에는 30속 1,500종의 식물이 있는 것으로 알려져 있으며, 우리나라에서는 1종(학명: Viscum album coloratum)이 서식하고 있다. 겨우살이 중에 현재 약재로 사용 되고 있는 겨우살이는 Viscum 속(genus)의 겨우살이로서 주로 유럽지역에서 서식되는 Viscum album loranthaceae 이다. 유럽의 loranthaceae 과에 속하는 겨우살이는 오래전 부터 민간요법으로서 고혈압, 동맥경화증, 암 등의 질병에

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대해 치유 효과가 있는 신비의 약제로 사용되었고 1921년부 터 항암활성을 인정받아 종양에 대한 치료제 및 항암 보조제 로서 임상적으로 사용되고 있으며, 현재까지 겨우살이의 생 물학적 활성에 대한 대부분의 연구는 주로 유럽산 겨우살이 에 대해 수행되어 왔다(4-9).

유럽산 겨우살이 잎은 체액성 및 세포성 면역체계를 자극 하는 면역증강 효과가 있는 것이 인정되었다(10). 동물 및 인간에 대한 임상시험 결과 종양세포에 대하여 직간접적으 로 대응하는 대식세포와 natural killer(NK) 세포의 활성을 증가시킴으로써 종양세포의 증식을 억제하고(6,11,12), 암 환자의 생존율을 증진시키는 효과가 있는 것으로 보고되었 다(13,14). 또한 이러한 효과에는 겨우살이의 면역증강 작 용뿐만 아니라 종양세포에 대한 직접적인 세포독성 효과도 관련 있는 것으로 알려졌다(15,16).

세포 소기관의 하나인 미토콘드리아는 ATP를 생성하는 기관으로 ‘세포 발전소’라 불리며 여러 대사성 질환의 발생 과 관련 있는 것으로 보고되어 있다(17). 특히 2형 당뇨의 경우 골격세포에 있어서 미토콘드리아의 수적 및 기능적 감 소가 동반되는 것으로 알려져 있다(18). 최근 본 연구진은 한국산 겨우살이 추출물이 미토콘드리아 활성을 자극하며 (19), 또한 고지방식 급이 마우스에서 간지방과 비만을 억제 하는 활성이 있는 것으로 보고하였다(20).

이처럼 한국산 겨우살이의 생리활성에 있어서 면역증강 과 항암활성을 비롯하여 비만 및 간지방 등 대사증후군에 속하는 질환에 대한 효능이 보고되고 있으나 아직까지 당뇨 에 대한 한국산 겨우살이의 효능에 대해서는 정보가 전무한 상태이다. 본 연구에서는 한국산 겨우살이 추출물의 항당뇨 활성을 검토하기 위하여 2형 당뇨 모델인 ob/ob 마우스를 이용하여 혈당조절 활성을 측정하고, C2C12 근육세포에 있 어서 미토콘드리아 생성에 미치는 영향을 조사하였다.

재료 및 방법

한국산 겨우살이 추출물의 제조

본 연구에 사용한 한국산 겨우살이는 1년 혹은 2년산 겨 우살이를 사용하였으며 냉수 추출에 의해 한국산 겨우살이 추출물(KME)을 얻었다(21). 먼저 세절한 겨우살이의 잎과 줄기에 10배량(w/v)의 증류수를 넣고 분쇄한 후 4°C에서 16시간 동안 교반하였다. 원심분리(8,000 rpm/30 min, 4

°C)를 실시하여 얻은 상등액을 membrane filter(0.45 mm) 를 사용하여 여과한 후 그 내액을 동결건조 하였다. KME의 수율은 약 9% 정도였다. 이 동결건조물은 증류수 1 혹은 2 mL로 녹여 4°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.

세포배양

실험에 사용된 마우스 근육세포주인 C2C12 mouse my- oblast 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% anti- biotics(penicillin-streptomycin)를 첨가한 DMEM 배지를

이용하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. C2C12 세포 의 myotube로의 분화는 1% FBS를 포함하는 배양배지에서 7일간 배양하고 phosphate buffered saline(PBS)으로 세 척한 후 0.5% FBS를 포함하는 배양배지에서 16시간 추가 배양하여 유도하였다.

동물실험

본 연구에 사용한 C57BL/6J ob/ob 마우스(8주령, 수컷) 와 C57BL/6 마우스(8주령, 수컷)는 라온바이오(Yongin, Korea)에서 구입하였으며, 건양대학교 동물실험윤리위원 회 규정에 따라 사육, 관리하며 실험에 사용하였다(P-13- 04-A-01).

혈당 및 혈중지질의 측정

KME 경구투여에 의한 혈당조절 효과는 ob/ob 마우스에 KME를 50 또는 100 mg/kg/d로 경구투여(500 mL/mouse/

d) 하면서 경구투여 개시 5일, 10일, 15일 후에 채혈하여 Dry-Chem 3500i(Fujifilm, Tokyo, Japan)에서 혈당을 측 정하였다. 정상 C57BL/6 마우스를 이용한 실험에서도 동일 하게 KME를 경구투여 하면서 혈당을 측정하였으며, KME 투여가 체중 증가에 미치는 영향을 조사하기 위하여 5일, 10일, 15일째의 체중을 측정하였다. ob/ob 마우스의 혈중 지질 총 콜레스테롤과 중성지질은 KME 투여 개시 후 10일 째의 혈액으로부터 Dry-Chem 3500i를 통해 정량하였다.

경구 당부하도 측정

경구 당부하도는 ob/ob 마우스를 이용한 OGTT(oral glucose tolerance test)에 의해 실시하였다(22). 8주령의 ob/ob 마우스에 KME를 50 혹은 100 mg/kg/d의 양으로 5일 동안 경구투여 하고, 마지막 날에는 16시간 동안 절식시 켰다. 절식 후 PBS로 체중 대비 2 g/kg의 용량으로 녹인 D- glucose(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 존대 를 이용하여 경구투여 하였다. D-glucose 투여 15, 30, 60, 90, 120분 후에 혈액을 채취하여 Dry-Chem 3500i에서 혈 당을 측정하였다.

당 수송 분석실험

당 수송(glucose uptake) 분석은 C2C12 세포가 2-deoxyglucose(2-DOG)를 수송하는 in vitro 실험을 통해 검 토하였다(23). Myotube로 분화된 C2C12 세포(10⁵)를 1%

FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 50 혹은 200 mg/mL의 KME로 24시간 처리하고 세포를 Kreb's Ringer phosphate (KRP) buffer(pH 7.4, phosphate 10 mM, NaCl 136 mM, KCl 4.7 mM, CaCl2 1.25 mM, MgSO4 1.25 mM, 0.05%

BSA)로 신속하게 세척하였다. 그 후 세포를 KRP buffer로 녹인 cytochalasin B(20 mM)로 37°C에서 10분간, insulin(10 nM)을 10분간 처리하고, [³H]-deoxyglucose(0.2 mM, 0.2 mCi)를 넣고 10분간 배양하였다. 그 후 cold PBS

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150 200 250

0 5 10 15

Days after KME treatment

Glucose (mg/dL) .

Control KME-50 KME-100

*

**

*

Fig. 1. Effect of oral administration of KME (cold water extract of Korean mistletoe) on blood glucose levels in ob/ob mice.

Groups of seven ob/ob mice were administered orally with 50 or 100 mg/kg/d KME. The levels of blood glucose were determined on the indicated days. ^*P<0.05, ^**P<0.01; compared with the control by Student's two-tailed t test.

로 세포를 3회 세척하고 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)로 녹인 후 방사선량을 측정하여 glucose uptake를 계산하였다.

PCR에 의한 유전자 분석

미토콘드리아 활성화 관련 유전자의 분석은 실시간 PCR 을 통해 분석하였다. C2C12 세포의 total RNA를 Trizol reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 추출한 후 Superscript Ⅱ reverse transcriptase(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 5 mg의 total RNA로부터 cDNA를 합성하였다. Florescent temperature cycler (LightCycler; Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK)에서 각 cDNA 양의 10%씩을 PCR mixture[20 mL, 4 mM MgCl2, 4 pM of each primer and 1× LightCycler DNA Master SYBR Green 1 mix(Roche Diagnostics Ltd.)]와 함께 반응시켜 증폭하였다. 각 시료는 최초 94°C에서 30초 간 initial denaturation 하고, 그 후 95°C/15초, 55°C/32초 그리고 72°C/32초의 조건에서 30회 PCR을 행하였다. 목적 으로 한 유전자의 primer sequence는 다음과 같다.

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-α(PGC-1α)는 forward: 5'-CTTGGATA- CAGACAGCTTTCTGGG-3', reverse: 5'-CATCAAAT- GAGGGCAATCCGTCTTC-3', estrogen-related receptor-α(ERR-α)는 forward: 5'-GGCGGGGAACGACTGC- G-3', reverse: 5'-GGAGTCATCGGGGCTGTACTG-3', nuclear respiratory factor-1(NRF-1)은 forward: 5'- GATGACCACCTCGACCGTTT-3', reverse: 5'-CGGA- GTGACCCAAACTGAAC–3', mitochondrial transcription factor A(TmfA)는 forward: 5'-ATGTCTCCGGAT- CGTTTCAC-3', reverse: 5'-CCAAAAAGACCTCGTT- CAGC-3', glucose transporter type 4(Glut4)는 forward:

5'-GGGTGTGTGAGCGAGTGCTTTCCTC-3', reverse:

5'-CTACGCTTTGCAGCCCTGGGAACACA-3', β-actin 은 forward: 5'-GACTACCTCATGAAGATC-3', reverse:

5'-GATCCACATCTGCTGGAA-3'. 분석에 있어서 house- keeping internal control로는 β-actin을 사용하였다. 증폭 된 유전자의 확인은 65°C/15초간 냉각 후 95°C에서 천천히 가열하는 방식으로 각 PCR 종료 시 연속적으로 형광도를 측정하여 melting curve profile을 작성하여 분석하였다.

통계분석

본 연구에서 얻어진 실험 결과의 통계분석은 Student's two-tailed t test에 의해 대조군에 대한 통계학적 유의차를 통해 분석하였다. P 값이 <0.05인 경우를 통계학적으로 유 의한 것으로 판정하였다.

결과 및 고찰

혈당강하 및 당부하 억제 효과

ob/ob 마우스는 렙틴이 결손된 마우스로서 비만과 고혈 당 및 고인슐린 혈증과 같은 2형 당뇨병과 유사한 임상적 특징을 갖는 마우스이다(24). KME에 의한 ob/ob 마우스의 혈당강하 효과는 KME를 50 혹은 100 mg/kg/d로 경구투여 하면서 혈중 glucose의 농도 측정을 통해 조사하였다. KME 를 100 mg/kg으로 투여한 마우스에서 투여 5일 후부터 혈 중 glucose 농도가 유의하게 억제되었으며, 투여 개시 10일 후부터는 KME 50 mg/kg의 투여량에서도 혈당강하 효과가 관찰되었다(Fig. 1). 또한 Fig. 1의 결과로부터 KME는 경구 투여 개시 10일 후부터 최적의 혈당강하 효과를 유도하는 것으로 확인되었다. 한편 당뇨환자나 당 대사에 장애가 있는 경우에는 포도당에 대한 저항성이 떨어져 경구 당부하 테스 트(OGTT)에서 혈당치의 강하가 느려지게 되며, 특히 2형 당뇨의 특징적인 현상인 것으로 알려져 있다(25). KME 경 구투여에 의해 ob/ob 마우스에서의 혈당강하 효과가 확인 되었으므로 OGTT를 이용하여 KME 투여에 의한 당부하 억제 효과를 조사하였다. KME를 50 혹은 100 mg/kg의 양 으로 5일간 경구투여 한 후 KME 투여 개시 6일째에 glucose 2 g/kg을 경구적으로 투여하였다. 그 후 15분부터 120분까지의 혈중 glucose의 농도를 측정하였다. 그 결과 KME를 경구투여 한 마우스에서 혈중 glucose 농도가 대조 군에 비해 신속하게 저하되는 것으로 나타났으며 이러한 당 부하 억제 효과는 KME를 50 및 100 mg/kg으로 경구투여 한 경우 모두에서 유의한 것으로 인정되었다(Fig. 2). 이 결 과로부터 KME는 2형 당뇨 모델인 ob/ob 마우스에 있어서 혈당을 억제하는 항당뇨 활성과 당부하 억제 효과를 지니는 것으로 확인되었다.

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100 300 500 700

0 15 30 60 90 120

Time after glucose intake (min)

Glucose (mg/dL) .

*

**

*

**

** **

**

Fig. 2. Effect of KME on blood glucose levels during OGTT in ob/ob mice. In OGTT, all mice were administered orally with 2 g/kg glucose, and the levels of blood glucose were measured on the indicated times. ^*P<0.05, ^**P<0.01; compared with the control by Student's two-tailed t test.

0 50 100 150 200 250

TCHO (mg/dL) .

* **

A

0 20 40 60 80

TG (mg/dL) .

B

* *

Fig. 3. Effect of KME on the levels of total cholesterol (TCHO) and triglyceride (TG) in ob/ob mice. The levels of TCHO and TG in sera of ob/ob mice were measured 10 days after oral administration of KME. ^*P<0.05, ^**P<0.01; compared with the control by Student's two-tailed t test.

0 5 10 15 20 25 30

0 5 10 15

Body weight (g) .

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0 5 10 15

Glucose (mg/dL) .

B

Fig. 4. Effect of KME on body weight and blood glucose in C57BL/6 mice. Groups of seven C57BL/6 mice were administered orally with 50 or 100 mg/kg/d KME. Body weight and blood glucose were measured on the indicated days.

혈중지질 억제 효과

2형 당뇨에 있어서는 식후 고혈당에 의한 포도당 독성 (glucose toxicity)과 포도당이 중성지방으로 전환되어 초 래되는 지방 독성(lipotoxicity)에 의해 인슐린 저항성이 악 화되고 혈당이 더욱 조절되지 않는 것으로 알려져 있다(26).

즉 당뇨가 발병하게 되면 탄수화물과 유리지방산의 에너지 원으로서의 이용이 감소하게 되어 혈중 콜레스테롤이 증가 하고, 근육에서의 포도당 유입과 간에서의 포도당 생성 억제 감소 등에 의해 포도당이 과도하게 생산되어 혈당이 증가하 게 된다. Fig. 1과 Fig. 2에서 KME 경구투여에 의한 혈당강 하 효과가 확인되었으므로 이번에는 KME가 ob/ob 마우스 의 혈중지질에 미치는 영향을 조사하였다. KME를 50 혹은 100 mg/kg으로 10일간 경구투여 한 후 11일째의 혈액을 채취하여 총 콜레스테롤과 중성지방을 정량하였다. 그 결과 KME 경구투여에 의해 이들 혈중지질이 현저하게 억제되는 것으로 관찰되었으며, 이러한 혈중지질 억제효과는 KME 50 mg/kg의 투여량에서부터 유의한 것으로 인정되었다 (Fig. 3). 이들 결과로부터 KME의 경구투여는 ob/ob 마우 스에 있어서 혈당강하뿐만 아니라 혈중지질의 억제에도 유 효한 것으로 밝혀졌다.

정상 마우스에서 KME의 안전성

KME 경구투여가 정상 마우스의 체중과 혈당에 미치는 영향을 검토하였다. ob/ob 마우스에서의 실험과 동일하게 C57BL/6 정상 마우스에 KME를 50 혹은 100 mg/kg으로 경구투여 하면서 5일 간격으로 체중과 혈당을 측정한 결과 KME는 정상 마우스의 체중은 물론 혈당에 있어서도 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 4). 이 결과는 KME는 ob/ob 마우스에서 혈당강하와 혈중지질의 억제 활 성은 지니지만 정상 마우스에 대해서는 저혈당과 같은 부작 용은 유발하지 않는 것을 의미한다. 또한 15일간 연속투여 에서 체중에 아무런 영향을 주지 않은 것으로부터 적어도 100 mg/kg의 투여량까지는 체중 감소를 초래할 만한 독성

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95 120 145 170 195 220

Control 50 200

Doses of KME (mg/mL)

2-DDG uptake (%) .

- insulin + insulin

* *

Fig. 5. Enhanced glucose uptake in KME-treated C2C12 my- otubes. C2C12 myotubes were incubated with the indicated con- centration of KME for 24 h. Glucose uptake was determined as described in Materials and Methods. ^*P<0.01, compared with the control by Student's two-tailed t test.

0 2 4 6 8 10 12 14 16

PGC-1a ERR-a NRF-1 TmfA Glut4

Relative mRNA expression .

Control KME

* *

**

Fig. 6. Effect of KME on mRNA expressions of PGC-1α, ERR-α, NRF-1, TmfA, and Glut4 in C2C12 myotubes. Relative mRNA expression levels of these genes related to mitochondrial func- tion in C2C12 cells were measured by RT-PCR. ^*P<0.01, ^**P<

0.001; compared with the control by Student's two-tailed t test.

은 발현하지 않는 것으로 사료되었다. 하지만 KME의 안전 성에 있어서는 향후 보다 구체적인 검토가 필요한 것으로 판단되었다.

KME에 의한 glucose uptake 증가

KME가 직접적인 glucose의 세포 내 유입에 미치는 영향 을 조사하기 위하여 2-deoxyglucose를 이용하여 C2C12 근육세포의 당 수송 분석실험을 실시하였다. 완전 분화시킨 C2C12 근육세포에 50 혹은 200 mg/mL의 KME를 24시간 처리한 결과, Fig. 5에서 보는 바와 같이 KME는 50 mg/mL 의 농도부터 유의한 glucose uptake의 증가가 관찰되었으 며, 또한 이러한 KME 처리에 의한 glucose uptake의 증가 는 인슐린을 첨가한 실험계에서도 현저하게 증가되는 것으 로 나타났다(Fig. 5). 이들 결과로부터 KME는 단독으로 근 육세포의 glucose uptake를 상승시킴은 물론, 인슐린 투여 에 의한 glucose uptake도 증가시키는 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 한편 이 실험에 사용한 KME 농도(200 mg/mL) 는 세포의 생존율에는 아무런 영향을 미치지 않았다(data not shown). 2형 당뇨에서는 근육에서 포도당 유입의 감소 가 혈당을 높이는 한 원인이 되고 있으므로(26), KME가 근 육세포의 glucose uptake를 상승시키는 활성을 지닌다는 것은 겨우살이 추출물이 2형 당뇨를 억제하는 효과가 있음 을 강하게 시사한다.

미토콘드리아 생성 활성화

대사증후군의 대표적인 질병인 당뇨와 비만에 관한 동물 실험에서 이들 질환을 일으키고 있는 동물의 지방조직에서 미토콘드리아의 산화적 인산화(mitochondrial oxidative phosphorylation)와 생성(biogenesis)의 감소가 관찰되며 인간에 있어서도 당뇨와 미토콘드리아가 연관되어 있는 것 으로 알려져 있다(27). 또한 당뇨환자는 정상인에 비해 미토 콘드리아의 산화적 인산화에 관련된 유전자의 발현이 감소 되어 있는 것으로 보고되었으며 이들 유전자에는 미토콘드

리아 생성을 조절하는 transcriptional co-activator인 PGC- 1α를 비롯하여 PGC-1α의 표적이 되는 ERR-α 등 많은 유 전자가 속해있다(28). 본 연구진은 이전의 연구에서 KME가 마우스에서 미토콘드리아 자극을 통해 지구력을 증가시키 며(19) 고지방식 급이 마우스에서 비만과 지방간을 억제하 는 활성이 있음(20)을 보고하였다. 또한 본 연구에서는 KME 경구투여에 의해 2형 당뇨가 억제되고(Fig. 1), 근육세 포에서는 glucose uptake를 높이는 활성이 있음을 발견하 였다(Fig. 5). 이들 연구 결과를 종합해 볼 때 KME가 지방세 포 혹은 근육세포에서 미토콘드리아 생성과 산화적 인산화 를 촉진할 가능성이 높은 것으로 추정된다. 이러한 가능성을 확인하기 위하여 C2C12 근육세포를 이용하여 KME가 미토 콘드리아 생성에 관련된 유전자의 발현에 미치는 영향을 조 사하였다. C2C12 세포에 KME(200 mg/mL)를 24시간 처 리한 후, PGC-1α, ERR-α, PGC-1α와 ERR-α의 표적인 NRF-1, NRF-1의 표적이 되는 TmfA 그리고 PGC-1α에 의해 발현이 증가되는 glucose transporter GLUT4 등의 유전자를 대상으로 real time PCR을 이용하여 이들 유전자 의 발현을 정량하였다. 그 결과 KME 처리에 의해 이들 유전 자의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 6).

이 결과 KME는 미토콘드리아의 기능과 관련된 다양한 유전 자의 발현을 증가시켜 미토콘드리아 생성을 촉진하고 결과 적으로 2형 당뇨를 억제한다는 것을 시사한다. 이상의 결과 를 종합해 보면 KME는 미토콘드리아의 생성과 산화적 인산 화촉진을 통하여 근육세포의 당흡수를 상승시켜 결과적으 로 혈당과 혈중지질의 수치를 낮추고 당부하도 억제하는 활 성을 갖는 것으로 추정된다. 또한 KME는 정상 마우스에서 저혈당을 유발하지 않는 것으로 확인되어 무작위적인 혈당 치의 저하가 아닌 근육세포와 같은 혈당조절작용에 관여하 는 세포의 기능조절을 통해 혈당을 조절하는 것으로 추정되 었다. 향후 당흡수를 조절하는 단백질과의 상호작용과 인슐 린 분비에 관련된 췌장세포 기능조절 그리고 미토콘드리아 생성과 관련된 분자기전 등에 대해 연구를 수행할 계획이다.

(6)

요 약

본 연구에서는 C57BL/6J ob/ob 마우스를 이용하여 한국산 겨우살이 냉수 추출물(KME)의 항당뇨 활성을 조사하였다.

50 혹은 100 mg/kg의 KME를 1일 1회씩 경구투여 한 결과 KME 투여 개시 5일 후부터 ob/ob 마우스의 혈당이 유의하 게 억제되었으며, 10일 후부터 안정된 억제 효과를 나타내 고 대조군에 비해 20% 이상의 혈당강하 효과를 나타내었다.

경구 당부하 실험(OGTT)에서는 KME 경구투여 마우스에 서 유효한 당부하 억제 활성이 관찰되었다. 또한 KME 경구 투여는 ob/ob 당뇨 마우스의 혈액 내 총 콜레스테롤과 중성 지질의 농도를 억제하는 것으로 나타났다. 한편 C2C12 근 육세포를 이용한 in vitro 실험에서 KME를 처리함으로써 glucose uptake가 현저히 증가하였다. 한편 매우 흥미롭게 도 KME를 처리한 C2C12 근육세포에 있어서 미토콘드리아 생성과 산화대사 조절물질인 peroxisome proliferator- activated receptor gamma coactivator 1-α(PGC-1α)를 비롯하여 glucose transporter type 4(GLUT4), estrogen-related receptor-α(ERR-α), nuclear respiratory factor-1(NRF-1) 그리고 mitochondrial transcription factor A(TmfA)와 같은 PGC-1α 관련 유전자들의 발현이 증가하 는 것으로 확인되었다. 이 결과는 KME가 2형 당뇨에 대한 치료물질로서의 작용을 지니며 이러한 KME의 항당뇨 활성 은 미토콘드리아 생성의 조절과 관련 있는 것으로 추정된다.

REFERENCES

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