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이학석사 학위논문
유선조직 퇴축기과정에서 PPARδ 기능 연구
2 0 1 6 년 2 월
서울대학교 대학원
지구환경과학부 해양천연물신약
정 규 상
초 록
유선조직 (mammary glands)은 수유기가 되면서 유즙 생산의 기능을 가진 알베올라 (alveolar)구조를 가진다. 알베올라 구조는 유선상피세포 와 내강 (lumen)으로 구성되어 있으며, 각각의 상피세포에서 자손을 위 한 유즙을 생산하고 전달하게 된다. 수유기가 끝난 후, 유선조직은 퇴축 기 (involution)를 거쳐 임신 전 상태로 돌아가게 된다. 유선조직 퇴축 기는 유선상피세포의 사멸과 지방세포의 재생이 함께 일어나는 과정으로 가역적인 phase Ⅰ, 비가역적인 phase Ⅱ 두 단계로 진행된다. 핵 수용체 peroxisome proliferator activated receptor delta(PPARδ)는 유선 조직을 포함한 말초조직에서 대사 작용과 세포의 증식, 분화에 관련 되 어 있다고 알려져 있다. 하지만 유선조직에서의 PPARδ에 관한 연구는 유방암세포의 증식과 분화에 관련된 연구가 되어 있을 뿐, 유선조직 퇴 축기에서의 PPARδ에 관한 기능연구는 전무한 실정이다. 기존 연구 결 과, PPARδ가 knockout 되었을 때 유선조직의 퇴축기가 wild type에 비해 더 빠르게 진행되고 있다는 사실을 관찰했다 (involution day4).
하지만 퇴축기에서 PPARδ의 역할과 작용 기전에 대해선 명확히 연구 가 되지 않았다. 본 연구를 통해 퇴축기 첫째 날과 셋째 날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직의 퇴축기가 더 빠르게 진행 되고 있음을 확인했다. PPARδ knockout 유선조직의 초기 퇴축기과정 에서 shedding되는 상피세포가 wild type에 비해 더 많은 것을 확인했 고 이러한 현상은 리소좀 단백질가수분해효소인 cathepsin B와 cathepsin L 발현 차이로 인한 상피세포 사멸 때문임을 확인할 수 있었
다. 또한 PPARδ가 knockout 되었을 때 퇴축기를 조절하는 인자들 중 STAT3와 STAT3의 인산화가 증가하는 것을 확인 하였다. STAT3의 인산화를 조절하는 OSM 수용체, LIF 수용체의 발현이 wild type에 비 해 PPARδ knockout 유선조직에서 유의미하게 증가함을 확인하였고 이러한 변화가 STAT3의 활성화를 증진시켜 퇴축기에 영향을 미쳤을 것이라 예상했다. 결과적으로, PPARδ의 knockout은 리소좀을 매개로 하는 세포사멸을 유도하며, 그러한 역할은 전사인자 STAT3의 인산화를 조절함으로써 나타날 것으로 예상할 수 있었다.
Keyword : 유선조직, PPARδ, 퇴축기, 리소좀, STAT3
학 번 : 2014-20327
목 차
초 록 ---ⅰ
목 차 ---ⅲ
그 림 목 차 ---ⅳ
약 어 정 리 ---ⅵ
Ⅰ. 서 론 ---1
Ⅱ. 재료 및 방법 ---4
Ⅲ. 결 과 ---10
Ⅳ. 고 찰 ---32
Ⅴ. 참 고 문 헌 ---37
영 문 초 록 ---42
그 림 목 차
그림 1. In vivo 실험 디자인
그림 2. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 PPARδ의 knockout확인
그림 3. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 wild type과 PPARδ knockout 유선의 조직학적 분석
그림 4. 퇴축기 셋째 날에서 wild type과 PPARδ knockout 유선조직 지방세포 (adipocyte)의 면적 비율
그림 5. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 유즙단백질 발현
그림 6. 퇴축기 첫째 날에서 유선조직의 세포자살 관련 유전자 발현
그림 7. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 wild type과 PPARδ knockout 유선조직의 세포자살
그림 8. 퇴축기 첫째 날에서 리소좀 단백질가수분해효소의 mRNA 발현
그림 9. 퇴축기 셋째 날에서 리소좀 단백질가수분해효소의 mRNA 발현
그림 10. 퇴축기 첫째 날 유선조직에서 리소좀 단백질가수분해효소의 protein 발현
그림 11. 퇴축기 첫째 날 유선조직의 cathepsin B 발현
그림 12. PPARδ 작용물질과 PPARδ 길항제 유무에 따른 cathepsin B 발현
그림 13. PPARδ 작용물질과 PPARδ 길항제 유무에 따른 lysotracker red staining
그림 14. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 전사인자 STAT3의 발현
그림 15. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 phosphoSTAT3의 발현
그림 16. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 LIF 수용체, OSM 수용체의 발현
표 1. Quantitative real time PCR primer
약 어 정 리
PPARδ : peroxisome proliferator-activated receptor delta
Csn2 : beta-casein
Wap : whey acidic protein
TUNEL : terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling
NMuMG : normal musculus mammary gland cell line
STAT3 : signal transducer and activator of transcription 3
LIFR : leukemia inhibitory factor receptor
OSMR : oncostatin m receptor
LMP : lysosome mediated programmed cell death
MgKO : mammary gland epithelial specific knockout
PPRE : PPAR response element
Ⅰ.서론
유선조직 (mammary glands)은 유즙을 만들어 자손들에게 공급하는 기관으로 임신기 (pregnancy), 수유기 (lactation), 퇴축기 (involution) 를 거치며 짧은 시간 동안 세포의 성장과 분화, 사멸이 급격하게 나타나 는 조직이다 (Macias H., 2012). 그 중, 퇴축기는 수유기의 유선조직이 임신 전 상태로 되돌아가는 기간으로, 이 시기에는 유즙생산을 위해 증 식되었던 상피세포의 사멸과 함께 지방세포의 재생이 나타난다. 이러한 특징을 가지는 퇴축기는 크게 두 시기로 나눠진다. 첫 번째 시기의 퇴축 기는 새끼가 suckling을 멈춘 후 48시간에 걸쳐 나타나며 유즙생산의 감소, 상피세포의 사멸이 관찰되지만 형태적인 변화는 보이지 않는다.
이 시기는 다시 새끼의 suckling이 있다면 수유기로 돌아갈 수 있는 가 역적인 기간이다. 두 번째 시기의 퇴축기는 보통 48시간이 지난 후에 나타나며 새끼의 suckling이 있다고 해도 다시 수유기로 되돌아 갈 수 없는 비가역적인 기간이다. 이 기간에는 알베올라 (alveolar)의 붕괴가 시작되며 첫 번째 시기의 퇴축기에 비해 더 많은 상피세포의 사멸이 나 타난다. 또한 사멸된 상피세포의 자리를 지방세포가 채우게 되는 것을 관찰 할 수 있다 (Christine J. Watson, 2011; Stein T., 2014).
이러한 특징을 가지는 퇴축기는 다양한 정보전달경로에 의해 시기적으 로 구분되어 조절된다. STAT3, NF-kB, AKT-PI3K, TGFβ 신호가 퇴축기에서 중추적인 역할을 담당하며, 그 중 STAT3는 강력한 사멸 신 호로 작용한다 (Champman R.S et al., 2000). STAT3는 전사인사의
한 종류로 인산화를 통해 활성화되며 수유기에 발현이 거의 없다가 퇴축 기가 시작되면서 발현이 급증한다 (Clarkson R.W et al., 2004). 퇴축 기에서 전사인자 STAT3의 역할은 형질전환 생쥐모델을 이용해 연구가 되어 있으며 세포사멸과 면역 관련 유전자를 조절함으로써 퇴축기에 영 향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Humphreys R.C et al., 2002;
Hughes K et al., 2012).
Peroxisome proliferator activated receptor delta(PPARδ)는 3가 지 PPAR subtype 중 하나로 리간드에 의해 활성화되는 핵 수용체이다.
PPARδ는 지방산과 콜레스테롤 대사에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 비만에 관련된 질병 치료의 잠재적인 타겟으로 연구되고 있다 (Bogna Grygiel-Gorniak, 2014). 또한 PPARδ는 세포 생존과 사멸의 조절에도 관여한다고 알려져 있다. 하지만 유선조직에서 세포의 생존과 사멸에 관련된 PPARδ의 기능 연구는 주로 암 세포에 관련된 것이 대부분이고 연구결과들도 상반된 결과를 보이고 있다. C20 cell (mouse mammary tumor cell line)에서는 PPARδ agonist를 처리 했을 때 암세포 성장을 방해하는 경향을 보이지만 (Jennifer E.
Foreman et al., 2010) 다른 연구결과에서는 PPARδ의 활성화가 PDK1와 AKT 신호를 통해 종양 촉진에 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다 (Pollock et al., 2011).
이전 연구결과, 퇴축기 넷째날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직의 지방세포 면적이 더 넓은 것을 관찰 했고, 그러한 차이는 caspase 의존적인 세포사멸의 영향 때문일 것이라 예상 했다.
하지만 형태적인 변화가 나타나지 않는 phase І에서의 퇴축기양상과 PPARδ 작용 기전에 대해선 연구가 되지 않았다. 따라서 본 연구는 이 전 연구를 토대로 유선상피세포 특이적으로 PPARδ가 knockout 된 생 쥐의 유선조직을 이용해 퇴축기 양상 확인과 함께 퇴축기에서 PPARδ 의 기능과 작용기전을 탐색하고자 한다.
Ⅱ. 재료 및 방법
Mouse husbandry and scheme of mating
Jackson lab을 통해 구입한 PPARδ flox line(B6.129S4-Ppardtm1Rev/J) 과 MMTV-cre line(B6.129-TG(MMTC-cre)4Mam/J)을 교배시켜 PPARδ fl/+;MMTV-cre를 만들었고, 이 생쥐를 다시 PPARδ fl/fl와 교배시켜 PPARδ fl/fl;MMTV-cre(MgKO)를 만들었다. 대조군은 PPARδ fl/fl를 사용하였다. 7주령의 처녀기 암컷 생쥐를 교배시킨 후 출산, 그리고 10일의 수유기를 가진 후 강제로 이유 (weaning)시켰다.
핵 수용체 PPARδ 유무에 따른 시기별 퇴축기 진행 양상을 확인하기 위해 24, 72시간이 지났을 때 4, 7번째 유선조직을 적출해서 -80℃ 초 저온냉장고에 보관하였다. Wild type과 PPARδ knockout 생쥐 각각 5 마리씩 부검하였으며 생쥐는 25℃, 60%의 습도가 유지되는 시설에서 12시간 주기로 밤과 낮을 바꾸며 사육하였다. 모든 동물실험은 서울대 학교 동물실험 윤리위원회의 규정에 따라 진행하였다.
Hematoxylin and eosin staining of mammary glands section
부검을 통해 적출한 유선조직은 조직 카세트에 담아 4℃, 10% 포르말 린 용액에서 보관하였다. 각 조직은 서울대학교 약학대학 병리조직실에 H&E staining을 의뢰하였고 형광현미경(Eclipse TS100, Nikon, Japan)으로 관찰하였다.
TUNEL staining of mammary glands section
Apoptosis Detection kit(#S7110, Merck millipore, USA)를 이용하 여 실험을 진행하였다. 서울대학교 약학대학 병리조직실에 의뢰하여 만 든 파라핀 블록을 xylene에 5분씩 3회 탈파라핀화 한 후 100%, 95%, 70% ethanol로 3분씩 재수화하였다. Proteinase K(20㎍/㎖)를 15분간 처리한 뒤 equilibrium buffer와 rTdT enzyme을 섞어서 각 시료 당 50㎕씩 처리하여 37℃에서 한 시간 반응시켰다. Working strength stop / wash buffer를 15분간 상온에서 처리한 후 anti-digoxigen conjugate로 30분간 반응 시켰고 형광 현미경(Eclipse TS100, Nikon, Japan)을 통해 관찰하였다.
Immunofluorescence
부검을 통해 적출한 유선조직은 조직 카세트에 담아 4℃, 10% 포르말 린 용액에서 보관하였다. 각 조직은 서울대학교 약학대학 병리조직실에 unstained slide를 의뢰하여 파라핀 블록을 만들었다. Xylene에 10분씩 3회 탈파라핀화 (dewax) 한 후 100%, 90%, 70%, 50%, 30%
alcohol으로 3분씩 재수화 (rehydration) 시켜주었다. 항원을 노출시키 기 위해서 retrieving buffer(Tris 500mM, EDTA 50mM)를 넣은 압 력밥솥에서 10분간 끓여주었다. 상온에서 뚜껑을 열고 30분간 식힌 후 slide를 꺼내 PBS로 3회 washing하였다. 10% goat serum이 들어간 PBS로 상온에서 1시간 30분 blocking 한 후 primary antibody를 blocking solution에 희석하여 4℃ damp chamber에서 O/N incubation하였다. 다음 날 PBS로 3회 washing 한 후, blocking solution에 희석한 secondary antibody를 상온에서 1시간동안 incubation 시켜주었다. PBS로 2회 washing 후 DAPI가 들어간
solution으로 mounting해 주었고 형광 현미경 (Eclipse TS100, Nikon, Japan)을 통해 관찰하였다. Cathepsin B(1:80, PC41, Calbiochem), PPARδ(1:100, #PA5-29678, Pierce), Alexa fluor 488(1:500, A11010, Invitrogen)
Quantitative real-time PCR
-80℃에서 보관해 두었던 조직 tube에 800㎕의 Trizol(Invitrogen)을 넣은 후 Tissue lyzerⅡ(QIAZEN)를 이용하여 조직을 깨주었다.
chloroform(366919, sigma)을 200㎕ 넣고 충분히 voltexing 한 후 4℃, 14000 RPM에서 15분간 원심분리 해주었다. 300㎕의 상층액을 새 tube에 옮긴 뒤 isopropanol(k40680934006, merck)을 300㎕ 넣 고 2~3번 inverting 한 후 4℃, 14000 RPM에서 10분간 원심분리 해 주었다. 상층액을 버린 뒤 800㎕의 70% alcohol(K42113283112, merck)을 넣어주고 2~3번 inverting 해주었다. 4℃, 14000 RPM에서 5분간 원심분리 한 후 상층액은 버려주고 pellet을 잘 말려주었다.
DEPC(w2004, 바이오세상)를 20~30㎕ 정도 넣고 tapping하여 RNA 를 녹여준 후 Nanovue(GE healthcare)를 이용하여 농도를 측정하였 다. PCR tube에 RNA 1㎍, oligo dT primer 1㎕를 넣은 후 DEPC로 12.5㎕를 맞춰주었다. 그 후, 65℃에서 10분 동안 RNA를 denaturation 시켜주었다. Transcriptor RT reaction buffer(5X), dNTP-Mix(10mM), protector RNase inhibitor(40U/㎕), transcriptor reverse transcriptase를 제조사의 지침대로 넣은 후, 4 2℃ 1시간, 70℃ 10분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. cDNA에 SYBR Green master mix(#204145, QIAGEN)를 넣고 rotorgene 3000을 이용하여 Quantitative real-time PCR을 수행하였다. 모든 데
이터는 18S로 표준화하였고 각각의 유전자 별로 delta delta ct 방법을 통해 값을 구하였다.
Western blotting
-80℃에서 보관해 두었던 조직 tube에 RIPA buffer(LPSS, LPS SOLUTION), phosphatase inhibitor cocktail tablets(1tablet/10㎖, PhosphosSTOP, Roche), protease inhibitor(5㎕/10㎖, 535140, Calbiochem)를 100~500㎕를 넣은 후 Tissue lyzerⅡ(QIAZEN)를 이 용하여 조직을 깨주었다. 4℃, 14000 RPM에서 15분간 원심분리하여 수용액층만 새로운 tube로 옮겨주었다. 그 후, 얻어낸 단백질을 Pierce BCA Assay Kit(#23225, Thermo Scientific)를 사용하여 정량 하였 다. 10% polyacrylamide gel을 만들어 60V에서 30분, 120V에서 1시 간 10분 동안 SDS-PAGE를 수행하였다. 20V에서 35분간 Transfer membrane에 transfer한 후 5% skim milk로 1시간 30분간 blocking 하였다. T-TBS로 5분간 3번 washing 한 후 primary antibody를 제 조사의 지침대로 희석하여 4℃에서 incubation하였다. 다음날, T-TBS 로 5분간 3회 washing 한 후, secondary antibody를 1:4000으로 PBS에 희석하여 상온에서 1시간 incubation하였다. T-TBS로 3회 washing하고 WEST-ZOL Plus(20330648, iNtRON)를 처리해서 LAS-4000(Fujifilm)으로 결과를 확인하였다. STAT3( 1:1000, Cell signaling, 4904S), pSTAT3(1:1000, Cell signaling, 9145S), GAPDH(1:1000, 2118S, Cell signaling), CathepsinB(1:200, PC41, Calbiochem), CathepsinL(1:1000, MAB9521, R&D systems), caspase3(1:1000, 9665S, Cell signaling), caspase6(1:1000, 9762S, Cell signaling), caspase7(1:1000, 9491S, Cell signaling),
cleaved caspase3(9661, 1:1000, 9661S, Cell signaling), Anti-rabbit IgG(1:4000, AP307P, Millipore)
Cell culture
생쥐 유선 상피세포 NMuMG 세포는 10% Fetal bovine serum, insulin(10㎍/㎖)을 넣은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였 다. 실험을 위해 NMuMG 세포를 12well plate에 5X105개씩 seeding 한 후 24시간 동안 배양하여 80% 포화도까지 키웠다. 그 후 리간드 (OSM(25ng/㎖), PPARδ agonist(0.5μM), PPAR δ antagonist(1μ M))를 처리하고 24시간동안 incubation시켜 준 후 RIPA buffer를 이 용하여 protein을 추출하였다. NMuMG cell은 서울대학교 의과대학 해 부학교실 이동섭 교수님으로부터 제공받았다. OSM(#495-MO, R&D systems), PPARδ agonist(N1, CMDD), PPARδ antagonist(#GSK-3787, abcam)
Lysotracker red staining
NMuMG 세포를 96well pate에 2X104개씩 seeding 한 후 24시간 배 양하여 70% 포화도까지 키웠다. 그 후 리간드(OSM(25ng/㎖), PPAR δ agonist(0.5μM), PPAR δ antagonist(1μM))를 처리 한 후 72시 간동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 1%
streptomycin/penicillin, 1% FBS가 들어간 DMEM으로 2번 washing 한 후 lysotracker red(50nM, L-7528, ThermoFisher scientific)와 Hoechst(12.3㎎/㎖, #62249, ThermoFisher scientific)를 처리 한 후
30분간 incubation 시켜주었다. DPBS로 1번 washing 하고 포르말린으 로 10분간 37℃에서 고정시켰다. DPBS로 1번 washing 한 후 형광현 미경(Eclipse TS100, Nikon, Japan)을 이용해 관찰 하였다.
OSM(#495-MO, R&D systems), PPARδ agonist(N1, CMDD), PPARδ antagonist(#GSK-3787, abcam)
Statistical analysis
모든 값은 평균±표준오차값으로 표시하였다. 통계적 유의성은 Student’s t-test를 이용하였으며 p<0.05 이면 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
Ⅲ. 결 과
퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 PPARδ의 knockout 확인 면역형광염색법 (immunofluorescence)을 이용해서 PPARδ의 유선상 피세포 특이적 knockout을 확인 하였다 (그림2).
퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 PPARδ knockout 유선의 조직학적 변화 PPARδ knockout에 따른 유선조직 퇴축기의 진행 양상을 확인하기 위해 수유기를 10일 가진 어미 생쥐에게서 강제적으로 새끼들을 분리한 후 24시간 (첫째 날), 72시간 (셋째 날)이 지났을 때 유선조직을 적출 해 관찰하였다. H&E staining을 통한 조직학적 분석 (histological analysis) 결과 퇴축기가 시작되고 24시간이 지난 후 wild type 유선조 직에 비해 PPARδ가 knockout된 유선조직에서 내강으로 shedding되 는 유선상피세포가 더 많은 것을 관찰하였다 (그림3). 이는 wild type 에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 세포 사멸 (cell death)이 더 활발히 일어나고 있기 때문이라고 생각한다. 또한, 72시간이 지났을 때 유선조직을 관찰한 결과, wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조 직의 알베올라 내에 적은 양의 유즙이 남아 있었으며 남아있는 상피세포 또한 적은 것을 확인 하였다 (그림3). 이는 wild type 유선조직에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 남아 있는 유즙성분의 제거와 상피세 포의 사멸이 더 빠르게 일어나고 있기 때문이라 여겨진다.
퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 PPARδ knockout 유선조직의 유즙 단백질 발현
유선상피세포는 수유기 동안 유즙을 생성해 자손에게 전달한다. 하지만 suckling이 없어지면서 퇴축기가 진행되게 되고 만들어진 유즙은 알베올 라 안에 머물게 된다. 또한 더 이상 유즙을 만들 필요가 없어진 유선상 피세포는 유즙 생성을 줄이기 시작한다 (Scribner KC et al., 2011).
만약 퇴축기가 PPARδ knockout 유선조직에서 더 빠르게 진행되고 있 다면 유즙을 구성하는 단백질의 발현 역시 빠르게 감소 할 것이라 예상 했고, 유즙 단백질의 대부분을 차지하는 β-casein(csn2)과 whey acidic protein(wap)의 mRNA 발현을 quantitative real time-PCR을 통해 확인하였다. 확인 결과, 퇴축기가 시작되고 24시간이 지났을 때 csn2와 wap의 mRNA 발현이 wild type에 비해 PPARδ knockout 유 선조직에서 유의미하게 감소 한 것을 관찰 할 수 있었다 (그림5). 이는 퇴축기 첫째 날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직의 퇴축기가 더 빠르게 진행되고 있기 때문이라 여겨진다.
퇴축기 첫째 날 PPARδ knockout 유선조직의 세포자살 관련 유전자 발현
퇴축기가 시작되고 48시간까지를 퇴축기 phase І이라 한다. 이 시기에 는 유즙 생성이 줄어들고 유선상피세포의 사멸이 나타나 내강 안으로 shedding되는 것을 관찰 할 수 있다 (그림3). 이전 연구 결과, 퇴축기 넷째 날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직의 세포자살 (apoptosis)이 더 많이 일어나는 것을 관찰하였다. 세포자살은 caspase 가 중심이 되어 나타나는 세포의 죽음을 의미하며 원형질막의 blebbing, 핵의 응축, caspase의 활성화 등이 나타난다고 알려져 있다 (David R.
McIlwain, 2013). 퇴축기 첫째 날에서 나타나는 shedding 현상도 세포 자살에 관련된 인자들의 차이 때문일 것이라 예상해 관련인자들의 발현 을 western blotting으로 확인해 봤으나 wild type과 PPARδ knockout 유선조직의 차이를 관찰할 수 없었다 (그림6). 또한 TUNEL assay 결과 퇴축기가 시작되고 24시간이 지났을 때 wild type과 PPARδ knockout 유선조직 모두에게서 TUNEL positive cell을 관찰 할 수 없었다 (그림7).
퇴축기 첫째 날 PPARδ knockout 유선조직의 리소좀 단백질 가수분해 효소 발현
퇴축기 첫째 날에서 나타나는 차이는 caspase 의존적인 세포사멸과는 관련이 없음을 실험을 통해 확인했다 (그림6, 그림7). 최근의 연구결과 를 살펴보면 퇴축기 초기에 나타나는 유선상피세포 사멸은 리소좀 단백 질 가수분해효소와 관련이 있음을 알 수 있다 (Peter A. Kreuzaler, 2011). 따라서 퇴축기 첫째 날에서 나타나는 wild type과 PPARδ knockout 유선조직의 세포 shedding 차이는 리소좀 단백질 가수분해효 소에 의한 세포사멸 때문일 것이라 예상했다. 리소좀 단백질 가수분해효 소인 cathepsin B와 L의 발현을 quantitative real time-PCR (그림8) 과 western blotting (그림10), 면역형광법 (그림11)을 통해 확인해 본 결과 퇴축기 첫째 날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조 직의 발현이 더 높은 것을 확인했다. 하지만 퇴축기 셋째 날에서는 발현 차이가 없음을 관찰하였다 (그림9).
In vitro에서 PPARδ 작용물질과 길항제 유무에 따른 리소좀 관련인자 발현
PPARδ 작용물질 (agonist)과 길항제 (antagonist)를 이용해 wild type과 PPARδ knockout 유선의 리소좀 단백질 가수분해효소 발현 차 이가 실제 PPARδ에 의한 것인지 western blotting을 통해 확인하였 다. 실험결과 유선상피세포 (NMuMG)에 PPARδ 길항제를 처리했을 때 cathepsin B의 발현이 증가하는 것을 관찰 하였고, PPARδ 작용물 질을 처리 했을 때는 cathepsin B의 발현이 감소하는 것을 관찰 할 수 있었다 (그림12). 또한 lysosomotropic dye인 lysotracker red staining을 통해 확인한 결과, PPARδ 길항제를 처리했을 때 음성대조 군에 비해 형광이 증가하였고, PPARδ 작용물질을 처리 했을 때는 형 광이 감소한 것을 관찰 할 수 있었다 (그림13). 이는 PPARδ가 cathepsin B의 발현을 억제하고 있었기 때문에, PPARδ를 knockout 시켰을 때 발현이 증가했을 것이라 여겨진다.
퇴축기 첫째 날, 셋째 날 PPARδ knockout 유선조직의 STAT3 발현 전임 연구자의 연구 결과, 퇴축기를 조절하는 여러 인자들 중 전사인자 STAT3의 mRNA 발현이 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조 직에서 높음을 확인했다. 전사인자 STAT3는 사이토카인 (cytokine)에 의해 유발되는 인자로서 특이적인 티로신 (tyrosine) 잔기의 인산화에 의해 활성화 되는 특징을 가지고 있다. 수유기에는 발현이 거의 없다가 퇴축기 시기가 되면서 발현이 증가하며 퇴축기가 진행되는 동안 중요한 사멸 신호로 작용한다고 알려져 있다 (Torsten Stein et al., 2003).
또한 리소좀 단백질 가수분해효소가 퇴축기 동안 전사인자 STAT3의 조절을 받는다는 것이 연구를 통해 밝혀져 있으므로 (Peter A.
Kreuzaler, 2011) PPARδ knockout에 따른 변화가 STAT3의 활성증 가 때문일 것이라 예상했다. 먼저, PPARδ가 knockout 됐을 때
STAT3의 발현을 western blotting과 quantitative real time-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 모두에서 PPARδ 가 knockout 됐을 때 전사인자 STAT3의 mRNA 발현이 유의미하게 증가한 것을 확인하였다. 또한 western blotting 결과 퇴축기 첫째 날에 서 STAT3의 발현이 wild type에 비해 PPARδ가 knockout 됐을 때 높은 것을 관찰하였다. 하지만 퇴축기 셋째 날에서는 protein 발현 차이 는 확인 할 수 없었고, 이는 퇴축기 셋째 날의 유선조직이 상피세포뿐만 아니라 지방세포, 면역세포 등으로 이루어진 혼합조직이기 때문이라 생 각된다 (그림 14).
퇴축기 첫째 날, 셋째 날 PPARδ knockout 유선조직의 STAT3 인산화
이전 연구 결과, STAT3 발현뿐만 아니라 STAT3 표적 유전자들의 발현이 증가하는 것을 mRNA 수준에서 관찰하였다. STAT3는 인산화 에 의해 활성화되어 표적 유전자들의 발현을 조절하므로 PPARδ가 STAT3 자체의 발현뿐만 아니라 인산화에도 영향을 미쳤을 것이라 예 상했다. 그러한 이유로 STAT3의 인산화를 western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, 퇴축기 첫째 날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 인산화된 STAT3의 발현이 더 높은 것을 확인 했다 (그림15). 또한 STAT3의 인산화를 조절한다고 알려진 leukemia inhibitory factor(LIF) 수용체와 oncostatin M(OSM) 수용체의 발현을 확인 한 결과, 퇴축기 첫째 날에서는 PPARδ knockout 유선조직의 LIF 수용체 발현이 유의미하게 증가했고, 퇴축기 셋째 날에서는 OSM 수용체의 발현이 유의미하게 증가한 것을 확인하였다 (그림16).
그림 1. in vivo 실험 디자인
수유기를 10일 가진 암컷 생쥐에게서 강제로 자손(pups)을 분 리한 후 퇴축기를 시작하게 하였다. (n=5, each group) Mouse model : B6.129 PPARδ fl/fl (wild type) B6.129 PPARδ fl/fl ; MMTV-cre
(mammary epithelial specific knockout mice)
그림 2. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 PPARδ의 knockout확인
퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 면역형광법을 이용하여 PPARδ 의 knockout을 확인하였다. 형광현미경을 사용하여 형광을 관찰 하였으며 Green은 PPARδ, Blue는 DAPI를 나타낸다 (X40배 율).
그림 3. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 wild type과 PPARδ knockout 유선의 조직학적 분석
Hematoxylin & eosin staining(H&E) staining을 통해 퇴축 기 첫째 날, 셋째 날에서의 유선조직을 현미경을 이용하여 관찰 한 결과 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 cell shedding이 더 많은 것을 퇴축기 첫째 날에서 확인하였다 (X10배율).
Adipocyte area
Day3WT Day3KO
% of Adipocyte area
0 10 20 30 40 50 60
그림 4. 퇴축기 셋째 날에서 wild type과 PPARδ knockout 유 선조직 지방세포 (adipocyte)의 면적 비율
퇴축기 셋째 날에서 유선조직의 hematoxylin & eosin staining 결과(10X)를 이미지 분석 프로그램을 이용하여 분석하 였다. 그 결과, wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직 의 지방세포 면적이 더 넓은 것을 관찰 할 수 있었다.
Csn2 Wap
그림 5. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 유즙단백질 발현
퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 유즙단백질인 csn2(β-casein) 와 wap(whey acidic protein)의 mRNA 발현을 quantitative real time-PCR을 통해 확인 한 결과, 퇴축기 첫째 날 유즙단백 질의 발현이 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직에 서 더 높은 것을 확인하였다. Black bar는 wild type을 나타내 고 gray bar는 PPARδ knockout을 나타낸다. ( **, p<0.01;
***, p<0.001)
그림 6. 퇴축기 첫째 날에서 유선조직의 세포자살 관련 유전자 발현
퇴축기 첫째 날의 유선조직에서 세포자살에 관련된 caspase3, 6, 7, cleaved caspase3의 발현을 western blotting을 통해 확 인하였다. 그 결과, wild type과 PPARδ knockout 유선조직에 서 차이를 관찰 할 수 없었다.
그림 7. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 wild type과 PPARδ knockout 유선조직의 세포자살
퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 면역형광법을 이용하여 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling) assay를 실시하였다. 그 결과, 퇴축기 첫째 날 wild type과 PPARδ knockout 유선조직 모두 TUNEL positive cell을 관찰 할 수 없었다. 형광현미경을 사 용하여 형광을 관찰하였으며 Green은 TUNEL, Blue는 Hoechst를 나타낸다 (X20배율).
그림 8. 퇴축기 첫째 날에서 리소좀 단백질가수분해효소의 mRNA 발현
퇴축기 첫째 날 유선조직에서 리소좀 단백질가수분해효소인 (a)cathepsin B와 (b)cathepsin L의 mRNA발현을 quantitative real time-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직의 리소좀 단백질가수 분해효소 발현이 더 높은 것을 관찰하였다. Black bar는 wild type을 나타내고 gray bar는 PPARδ knockout을 나타낸다.
(**, p<0.01)
그림 9. 퇴축기 셋째 날에서 리소좀 단백질가수분해효소의 mRNA 발현
퇴축기 셋째날 유선조직에서 리소좀 단백질가수분해효소인 (a)cathepsin B와 (b)cathepsin L의 mRNA발현을 quantitative real time-PCR을 통해 확인하였다. Black bar는 wild type을 나타내고 gray bar는 PPARδ knockout을 나타낸다.
그림 10. 퇴축기 첫째 날 유선조직에서 리소좀 단백질가수분해 효소의 protein 발현
퇴축기 첫째 날 유선조직에서 리소좀 단백질가수분해효소인 cathepsin B와 L의 발현을 western blotting을 통해 확인 하였 다. 그 결과, cathepsin B와 L의 활성화된 형태의 발현이 wild type에 비해 PPARδ 유선조직에서 더 높은 것을 확인할 수 있 었다. (sc : single chain)
그림 11. 퇴축기 첫째 날 유선조직의 cathepsin B 발현
퇴축기 첫째 날에서 면역형광법을 시행하였다. 그 결과, cathepsin B의 발현이 wild type에 비해 PPARδ knockout 유 선조직에서 더 높은 것을 관찰하였다. 형광현미경을 사용하여 형 광을 관찰하였으며 Green은 cathepsin B, Blue는 DAPI를 나타 낸다 (X40배율).
그림 12. PPARδ 작용물질과 PPARδ 길항제 유무에 따른 cathepsin B 발현
NMuMG cell(mammary epithelial cell line)을 이용해 PPAR δ 작용물질과 PPARδ 길항제 유무에 따라 cathepsin B의 발 현이 어떻게 달라지는지 western blotting을 이용해 확인하였 다. 그 결과 PPARδ 길항제를 처리 했을 때 cathepsin B의 발 현이 증가하였으며, PPARδ 작용물질을 처리하였을 때는 발현 이 감소하는 것을 관찰하였다.
그림 13. PPARδ 작용물질과 PPARδ 길항제 유무에 따른 lysotracker red staining
NMuMG cell(mammary epithelial cell line)을 이용해 PPAR δ 작용물질과 PPARδ 길항제 유무에 따라 lysotracker red staining을 확인하였다. n=5이며 student's t-test를 이용해 통 계 처리하였다. (*, p<0.05; **, p<0.01)
그림 14. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 전사인자 STAT3의 발현
퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 STAT3의 mRNA와 protein 발현을 (a)quantitative real time-PCR과 (b)western blotting을 통해 확인하였다. 그 결과, STAT3 beta form의 발 현이 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 더 높 은 것을 퇴축기 첫째 날 관찰하였다. Black bar는 wild type을 나타내고 gray bar는 PPARδ knockout을 나타낸다. (*, p<0.05)
그림 15. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 phosphoSTAT3 의 발현
퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 phosphoSTAT3의 protein 발현을 western blotting을 통해 확인한 결과, wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 phosphoSTAT3 의 발현이 더 높은 것을 퇴축기 첫째 날에서 관찰하였다.
LIF 수용체
OSM 수용체
그림 16. 퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 LIF 수용체, OSM 수용체의 발현
퇴축기 첫째 날, 셋째 날 유선조직에서 LIF 수용체, OSM 수용 체의 mRNA발현을 quantitative real time-PCR을 통해 확인하 였다. 그 결과, 퇴축기 첫째 날에서는 LIF 수용체의 발현이, 퇴 축기 셋째 날에서는 OSM 수용체의 발현이 유의미하게 증가한 것을 PPARδ knockout 유선조직에서 확인하였다. Black bar 는 wild type을 나타내고 gray bar는 PPARδ knockout을 나 타낸다. (*, p<0.05; **, p<0.01)
Gene Forward Reverse
STAT3 AGCTGGACACACGCTACCT AGGAATCGGCTATATTGCTGGT
Csn2 TGTGCTCCAGGCTAAAGTTCACT GGTTTGAGCCTGAGCATATGG
Wap TCAGTCCATGTTCCCAAAAGC CTCGTTGGTTTGGCAGATGA
CathepsinB TCCTTGATCCTTCTTTCTTGCC ACAGTGCCACACAGCTTCTTC
CathepsinL ATCAAACCTTTAGTGCAGAGT CTGTATTCCCCGTTGTGTAGC
PPARδ ATTCCTCCCCTTCCTCCCT TGTTGCGGTTCTTCTTCTGGA
LIFR GGCTCTGGAACCTTGGGCAAAACTG GCCTGCACTGCTCCAACCTCCTGTA
OSMR CATCCCGAAGCGAAGTCTTGG GGCTGGGACAGTCCATTCTAAA
표 1. Quantitative real time PCR primer
Ⅳ. 고찰
이전 연구 결과, wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직의 퇴 축이 더 빠르게 진행됨을 퇴축기 넷째 날에서 조직학적 분석결과 확인하 였다. 또한 그 차이가 퇴축기 넷째 날에서의 caspase 의존적 세포사멸 차이 때문일 것이라 예상했다. 그러한 연구결과를 토대로 유선조직 퇴축 기에서 PPARδ의 기능연구 및 작용 기전을 밝히기 위해 연구를 시작하 였다.
PPARδ 유무에 따른 시기별 퇴축기 양상을 확인하기 위해, 형태적인 변화가 거의 나타나지 않는 퇴축기 첫째 날과 형태적인 변화가 나타나는 퇴축기 셋째 날로 나누어 실험을 진행하였다. 그 결과, wild type과 PPARδ knockout 유선조직에서 세 가지 차이를 확인 할 수 있었다.
첫째, H&E staining을 통한 조직학적 분석 결과 퇴축기 첫째 날에서 내 강으로 shedding되는 세포가 wild type에 비해 PPARδ knockout 유 선조직에 더 많은 것을 관찰 하였다 (그림3). 둘째, 퇴축기 셋째 날에서 는 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 상피세포가 더 적게 남아있는 것을 확인 하였다 (그림3). 마지막으로, 유즙단백질 발현을 확인 한 결과 퇴축기 첫째 날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직의 csn2(β-Casein), wap(whey acidic protein) 발현이 유의 미하게 감소 한 것을 확인 할 수 있었다 (그림5). 이러한 결과들을 통해 PPARδ를 knockout 시켰을 때 퇴축기의 진행이 빨라졌고 그러한 차이
는 퇴축기가 시작되고 바로 나타났음을 확인 할 수 있었다.
세포사멸은 형태적인 특징에 따라 세포자살 (apoptosis), 세포괴사 (nectosis), 자가소화작용 (autophagy) 등으로 나뉘어진다. 이러한 세 포사멸은 비슷한 pathway를 가지며 때로는 동시에 나타나기도 한다 (Nikoletopoulou V. et al., 2013). 유선조직의 퇴축기는 유즙생산을 위 해 증식된 상피세포의 사멸이 주된 특징으로, 기존의 연구결과들에 따르 면 caspase 의존적 세포사멸에 의해 상피세포의 제거가 이루어 진다고 알려져 있었다 (Lund LR et al., 1996; Joshua VanHouten et al., 2010). 하지만 최근의 연구 결과를 살펴보면, 초기 퇴축기 phase Ⅰ에 서는 phase Ⅱ에서의 세포사멸과는 다른 방식으로 상피세포의 제거가 이루어진다고 보고되었다. 이 시기에는 세포자살에서 나타나는 원형질막 의 blebbing, 핵의 응축, DNA fragmentation 등의 특징이 나타나지 않 으며 caspase의 유무와는 상관없이 상피세포의 사멸이 진행된다. 대신, 이 시기에는 리소좀이 관련된 lysosome mediated cell death가 나타난 다. 수유기에는 발현이 억제되어 있던 리소좀 단백질 분해효소 cathepsin B와 L의 발현이 퇴축기가 되면서 급격히 증가하며, 그에 따 라 lysosome mediated cell death가 진행된다 (Kreuzaler PA et al., 2011). 본 연구 결과, 퇴축기 첫째 날에서 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선상피세포의 shedding이 더 많은 것을 관찰 할 수 있었 다. 이 시기의 cell shedding은 세포 사멸의 표지로 알려져 있기에 (Derek C, 2009) lysosome mediated cell death 때문에 shedding 차이가 나타났을 것이라 예상 했다. 단백질 분해효소 cathepsin B 와 L 의 발현을 확인 해 본 결과 wild type에 비해 PPAR δ knockout 유선
조직에서 발현이 증가하였다. 또한 세포실험을 통해 PPAR δ 길항제를 처리했을 때 cathepsin B의 발현과 lysotracker staining의 형광이 증 가함을 관찰 할 수 있었다. 이러한 실험 결과는 PPARδ가 평소 리소좀 단백질 분해효소의 발현을 억제하고 있었고 PPARδ의 knockout으로 리소좀 단백질 분해효소들의 발현이 증가했기 때문이라 여겨진다.
전사인자 STAT3는 유선조직 퇴축기에서 가장 중요한 역할을 하는 사 멸 신호 인자이다. 기존에 연구된 바에 따르면, STAT3가 knockout 된 생쥐의 유선조직은 퇴축기가 극도로 지연되었다 (Chapman RS et al., 2000). 이전 연구 결과, 퇴축기에 관여하는 여러 인자 중 STAT3의 mRNA 발현이 PPARδ knockout 유선조직의 퇴축기 넷째 날에서 증가 한 것을 확인하였다. 또한, 본 연구결과의 lysosome mediated cell death 관련 인자들은 유선조직 퇴축기에서 STAT3의 조절을 받는다는 사실이 기존연구 결과 알려져 있다 (Peter A. Kreuzaler et al., 2011). 이러한 이유로 PPARδ 유무에 따른 퇴축기 차이가 STAT3 활 성화를 통해 이뤄질 것이라 예상했다. 먼저 퇴축기 첫째 날, 셋째 날에 서 PPARδ 유무에 따라 STAT3의 발현이 어떻게 달라지는 지 확인 한 결과, 퇴축기 첫째 날에서 PPARδ가 knockout 되었을 때 STAT3의 mRNA와 protein 발현이 증가함을 확인 할 수 있었다.
인산화를 통해 활성화되는 STAT3는 퇴축기 초기와 후기, 각각 다른 요소에 의해 인산화 된다. 퇴축기 초기의 STAT3는 LIF에 의한 신호로, 후기의 STAT3는 OSM에 의한 신호로 인산화가 유지된다 (Tiffen PG
et al., 2008). 퇴축기 첫째 날, 셋째 날에서 STAT3의 인산화를 확인 한 결과 STAT3 발현과 유사한 양상을 보였다. 퇴축기 첫째 날에서는 wild type에 비해 PPARδ Knockout 유선조직에서 인산화가 된 STAT3의 발현이 높게 나타났다. 그러나 퇴축기 셋째 날에서는 차이를 확인 할 수 없었다. 또한 LIF 수용체와 OSM 수용체의 발현을 확인한 결과 퇴축기 첫째 날에서는 LIF 수용체, 퇴축기 셋째 날에서는 OSM 수 용체의 발현이 wild type에 비해 PPARδ knockout 유선조직에서 유의 미하게 증가하였다. 이는 PPARδ의 knockout으로 인하여 LIF 수용체, OSM 수용체의 발현이 증가했고, 그에 따라 STAT3의 인산화가 증가했 다고 유추할 수 있었다. 기존의 보고에 따르면 LIF와 OSM의 신호가 감 소할 경우 STAT3의 인산화뿐만 아니라, STAT3 자체의 발현도 감소 하는 것으로 알려져 있다 (Ichiba M et al., 1998). 따라서 퇴축기에서 의 PPARδ의 기능이 LIF 수용체과 OSM 수용체를 통해 작용할 것으로 예상하며 ChIP assay를 통해 LIF 수용체와 OSM 수용체의 promoter 에 PPAR response elements (PPRE)가 존재하는지 확인 해 볼 예정 이다.
지금까지 유선조직 퇴축기 과정에서 핵 수용체 PPARδ의 역할에 관한 연구는 보고된 적이 없다. 그렇기 때문에 PPARδ가 knockout 됐을 때 리소좀 단백질분해효소를 통해 퇴축기가 빠르게 진행된다는 사실 자체만 으로 매우 의미 있는 결과라 생각한다. 또한 퇴축기에서 중요한 전사인 자 STAT3의 발현과 관련된 결과는 굉장히 흥미로운 사실이라 여겨진 다. 하지만 PPARδ에 의한 STAT3 조절에 관한 정확한 메커니즘을 밝 히지 못한 것이 아쉬운 점이라 여겨지며 추후 연구를 통해 정확한 작용
기전을 밝히는 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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Abstract
Mammary glands are composed of alveolar structures with stromal cells during pregnancy and lactation. Each alveolar structure produces milk and gives the breast to pups. After a lactation state, alveolar structure returns to pre-pregnant state, which is called mammary glands involution. Mammary glands involution is orchestrated with epithelial cell death and adipocyte regeneration. PPAR family regulates metabolism, cell-proliferation, cell-differentiation, inflammation and development in the peripheral tissue including mammary glands. However, PPAR delta’s function in mammary glands involution has not been reported yet. In our group, it has been shown that mammary glands involution process accelerated in mammary glands PPAR delta knockout mice at involution day 4(MMTV-PPARdelta KO mice).
However, the process and the mechanism of involution associated with PPAR delta has not been studied yet. In this study, PPAR delta knockout mammary glands(MgKO) were shown enhanced involution at day1 and day3 involution.
Increased shedding cells and reduced milk protein expression were observed in MgKO during the first stage of the involution(day 1). An increase of cathepsin B and L expression were observed in MgKO at the beginning of the involution, which means that PPAR delta regulates the lysosome mediated cell
death in early stage of involution. Moreover, expression of STAT3 and phosphorylated STAT3 is increased in MgKO. And expression of LIF receptor and OSM receptor, well known to STAT3 phosphorylation, is enhanced at the each phase of the involution. The results suggest that PPAR delta strongly governs the regulation of involution through the lysosome mediated cell death by regulating STAT3 activation.
