프로시아니딘의 항종양 효능 및 혈구와 면역반응에 미치는 영향
신유진․이제형․이용규 동서대학교 화학공학부
Anti-Tumor Activity of Procyanidin and Its Effect on Hemocytes and Immunity
Yu Jin Shin, Je Hyung Lee, and Yong Kyu Lee Division of Chemical Engineering, Dongseo University
ABSTRACT We investigated the antitumor and immune regulatory responses of mice bearing tumors following treat- ment with procyanidin. Studies of apoptotic effects and molecular targets of procyanidin based on in vitro experiments have been reported, but few in vivo investigations have been conducted. Therefore, we evaluated the effects of procyani- din on tumor growth, lymphocyte proliferation and immune response in mice bearing P388D1 induced tumors after procyanidin treatment for 21 days. Procyanidin treatment inhibited proliferation of human breast, colon, lymphoma and hepatocarcinoma cancer cells, with IC50 values of 48.5∼63.8 μg/mL being observed. Oral administration of procya- nidin (200 mg/kg) or Glivec (10 mg/kg) for 21 days, resulted in tumor inhibition ratios of the procyanidin group (P388D1+procyanidin) and Glivec group (P388D1+Glivec) of 12.89% and 21.22%, respectively. Hemocyte analysis revealed that procyanidin decreased significantly white blood cell (WBC) counts and neutrophil% were significantly increased in the control group (P388D1+CMC), and significantly increased lymphocyte%, red blood cell counts, and hemoglobin levels were significantly decreased in the control group. When the effects of procyanidin on lymphocyte proliferation activity were measured, the procyanidin or Glivec groups showed increased levels compared to the control group. Based on these results, procyanidin is considered to have antitumor activity in vitro and in vivo studies. Moreover, procyanidin treatment restored the increased or decreased hemocyte changes induced in tumor bearing mice to some extent relative to the original state. Procyanidin treatment also enhanced the decreased immune function induced in tumor bearing mice as indicated by lymphocyte proliferation of the procyanidin group being increased significantly compared to the control group. Taken together, these findings indicate that procyanidin plays a crucial role in immunity regulation and tumor inhibitory activity in tumor bearing mice.
Key words: procyanidin, anti-tumor activity, immune response, BDF1 mouse
Received 24 July 2018; Accepted 31 August 2018
Corresponding author: Yongkyu Lee, Department of Food and Nutrition, Division of Chemical Engineering, Dongseo University, Busan 47011, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-51-320-1795
서 론
현재까지 알려진 암의 치료 방법에는 화학요법, 방사선요 법, 광역동요법과 활성면역요법 등이 있지만, 이들 요법은 암세포만 파괴하는 것이 아니라 주위의 정상적 세포도 파괴 하고 면역억제 작용으로 인한 부작용도 수반하게 된다. 그러 므로 효과적인 암 치료법은 초기 단계에서부터 종양과 투쟁 하여 종양의 발전과 진행을 방지하고 새로운 전이 상태의 형성을 방지하는 것이다. 그런데 화학요법제 단독 사용 시 면역감시에서 벗어나기 위해 종양억제 효능을 반감시키는 면역 반응이 나타날 수 있으므로, 최근의 종양 치료 연구는 종양에 대항하는 면역반응을 증가시키면서도 기존 화학요
법제와 병용 또는 보조 투여될 수 있는 면역치료제에 많은 관심을 보이고 있다(1). 면역학적으로 볼 때 생체는 종양을 항원으로 인식하기 때문에 숙주세포인 생체의 면역반응을 증강시키거나 자극하여 종양 항체의 발현을 증폭시키며 종 양 치료가 가능하다. 이때 세포성 혹은 체액성 면역반응으로 의 진전도 가능해져 관련 사이토카인의 분비가 이루어지게 된다. 이러한 면역 증강 효능을 나타낼 수 있는 화학요법제 와 관련하여 부작용을 우려하지 않아도 되는 식이성 천연 물질에 관심이 모아지고 있다(2,3).
식이성 또는 치료용 식물에서 유래한 화학물질 가운데 구 체적으로 항암 효능을 보여주는 좋은 예로 폴리페놀계 화합 물이 있다. 1990년대 이후로 폴리페놀에 대한 항암 효능 및 분자타겟을 확인하기 위하여 레스베라톨, 헤스페리딘, 제 니스타인, 커큐민 및 프로시아니딘에 대한 상세 연구가 수행 되어왔다. 이 가운데서도 프로시아니딘의 항산화 효과(4,5) 와 항염증 효능(6,7)에 대한 집중적 연구가 최근 10년간 활
발히 이루어지고 있다. 프로시아니딘이 가진 구체적인 항암 효능에 대한 in vitro 실험 결과는 아래와 같다. 사람의 유방 암세포(8,9), 폐암세포(10), 구강상피암세포(11), 전립선암 세포(12-15), 방광암세포(16), 직장암세포(17-20)의 증식 을 억제하거나, 정상세포에 대하여는 억제작용이 없이 암세 포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다(17,20-22). 나아가 프 로시아니딘 항암 효능의 분자타겟에 대하여도 많은 in vitro 연구가 이루어진 데 비하여, 종양동물에 대하여는 다음과 같은 극소수의 보고만 이루어졌다. 즉 면역억제 마우스를 이용한 종양동물 모델에서 프로시아니딘 투여가 관계 유전 자의 발현을 증가시키고 종양성장을 억제한다거나(23), 종 양 혈관 생성을 억제하면서 항종양 효능을 나타낸다(24)는 보고가 있다.
최근에는 종양치료를 위한 접근으로 면역치료(immuno- therapy)에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이때 면역반응과 종양 발전과의 관계를 밝히는 면역편집(immunoediting)(25) 에 대한 연구 비중도 커지고 있다. 프로시아니딘이 면역체계 에 미치는 작용에 관한 연구로는 프로시아니딘이 활성화된 CD4+ T-세포에서 해당작용(glycolysis)을 억제하거나(26), 말초성 단핵구에서 내재성 면역의 자극제로 작용하고(27), 또는 돼지의 T-세포를 활성화시킨다(28)는 보고 등이 있다.
또한 in vivo 연구로서 식이로 섭취된 프로시아니딘은 동물 의 비장세포에서 사이토카인(cytokine)의 생성을 증가시킨 다는 보고 등(29,30)이 있으나, 이러한 연구들은 종양 치료 과정과는 무관하게 정상 세포 및 정상 동물 등에서 연구된 면역반응 결과들이다. 그러므로 본 연구는 종양이 유발된 동물 모델에서 프로시아니딘의 항종양 효능을 검색하고 이 에 따르는 면역반응을 연구하기 위하여 시도되었다.
재료 및 방법
재료 및 세포배양
프로시아니딘은 플라보노이드 계열로서 카테킨과 에피카 테킨의 dimer(A1, A2, B1, B2, B3, B4, B5, B6, B8), trim- er(C1, C2), tetramer(A2) 혹은 oligomer로 존재한다. 본 연구에서는 식이용으로 사용되고 있는 oligomeric 프로시 아니딘 분말을 Puritan’s Pride Inc.(Oakdale, NY, USA)에 서 구입하였다. 이는 95% oligomeric 프로시아니딘으로 조 성된 grape seed procyanidin(GSP)이며, 플라보노이드 등 의 식물 성분 함량은 이전의 결과(18,31)에서 확인되었다.
암세포 증식억제를 확인하기 위하여 사용한 세포주와 종양 동물 모델을 제조하기 위하여 사용한 P388D1 세포는 한국 세포주은행(Seoul, Korea)에서 공급받아 사용하였다. 암세 포 증식 억제능을 측정하기 위한 in vitro 실험법으로 본 연 구실에서 이전에 시행하였던 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2- yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법(32) 을 사용하여 50%로 암세포의 성장을 억제하는 농도(IC50)를 측정하였다.
종양동물 모델
수컷 BDF1 마우스(4주령, 체중 18~20 g)를 (주)쌤타코 (Osan, Korea)로부터 구입하여 일반 고형사료로 7일간 순 화, 사육하였다. 사육실의 온도는 22±2°C, 습도는 40~60
%, 명암주기는 12시간으로 일정하게 유지하였다. 종양 형성 은 미국 National Cancer Institute(NCI)의 공인된 방법 (33)에 따라 아래와 같이 시행하였다. 6×106 cells/0.1 mL/
mouse의 P388D1 림프모구(lymphoblast) 암세포의 부유 액을 BDF1 마우스의 왼쪽 겨드랑이 부위에 23일간 주사하 였다. 종양세포 이식 3일째부터는 대조군(P388D1+CMC), 프로시아니딘 투여군(P388D1+procyanidin), 글리벡 투여 군(P388D1+Glivec)으로 나누어 각기 carboxymethyl- cellulose(CMC), 200 mg/kg의 프로시아니딘, 10 mg/kg의 글리벡(34)을 경구로 21일간 투여하였다. 예비실험 중 300 mg/kg의 프로시아니딘이 투여된 군에서 간헐적으로 무른 변이 관찰되었는데, 이는 암이 증식되고 있는 마우스에서 프로시아니딘의 흡수가 완전하지 않은 것으로 판단되어 본 연구에서는 투여용량을 200 mg/kg으로 시도하였다. P388 D1 세포를 이식받지 않은 정상군에 대하여는 phosphate buffered saline(PBS)을 피하주사하였다. 암 세포의 성장은 계측기(Mitutoyo Corp., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하 였으며, 각 군의 종양 성장 억제율은 아래와 같이 계산되었 다.
종양성장 억제율(%)＝ C(V1－V0)－T(V1－V0) C(V1－V0) C: 대조군
T: 실험군, 즉 프로시아니딘 혹은 글리벡(Glivec) 투여군 V1: 투여 전의 최초 부피(mm3)
V0: 투여 후의 부피(mm3)
본 실험은 동물실험 윤리위원회(동서대학교, ECAD1102) 의 승인을 받아 미국 연구심의위원회의 실험동물 지침서 (35)와 한국 동물보호법 8852에 따라 실행되었다.
혈액분석
23일간의 처치 후 마우스를 경추탈골법으로 사멸 후 즉각 혈액채취를 하여 전처치없이 동물전용 혈구측정 장치인 Hemavet 950(Drew Scientific Inc., Dallas, TX, USA)을 사용하였다. 마우스 프로그램(Hemavet 950)으로 백혈구 수치, 백혈구 중 호중구의 비율(호중구%), 백혈구 중 림프구 의 비율(림프구%), 적혈구 수치 및 헤모글로빈 함량을 분석 하였다.
비장세포 증식능 측정
각 실험군에서 체외로 적출한 비장세포를 배양 후 간접 면역활성 측정법으로 림프구 증식능에 미치는 영향을 정상 군(PBS), 대조군(P388D1+CMC), 프로시아니딘군(P388D1 +procyanidin)과 글리벡군(P388D1+Glivec)으로 나누어
Table 1. IC50 (μg/mL) values of procyanidin against cancer cell lines
Sample MCF-7 SW-480 U937 HepG2 Procyanidin
(μg/mL) 48.5±4.6 55.1±2.7 63.8±2.6 61.3±2.8 Cancer cell proliferation was checked by MTT method, and in- cubated for 36 h after procyanidin treatment.
Each value represents the mean±SD from three independent ex- periments (n=3).
Table 2. Effect of procyanidin on tumor growth in mice bearing P388D1 induced tumor
Treatment (N) Tumor volume (mm3)
Inhibition rate (%)
Beginning Ending
PBS (7)
P388D1+CMC (7) P388D1+procyanidin (7) P388D1+Glivec (7)
23.11±1.39 22.99±1.04 22.04±0.92
2,104.8±181.2 1,836.3±113.7* 1,660.6±141.8**#
12.89 21.22 P388D1 (6×106 cells/day) was intraperitoneally injected in BDF1 mice for 23 days.
The * and # indicate the values significantly different from positive control (P388D1+CMC) and P388D1+procyanidin, respectively.
Significance of * and # is at P<0.05, and that of ** is at P<0.01.
비교하였다. Guppy 등(36)의 방법에 따라 실험동물에서 적 출된 비장은 Earle’s balanced salt solution(EBSS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)으로 세척하여 다시 30 mm 의 세포배양용 접시에 옮긴 다음, 40 μm nylon cell strainer 를 이용하여 파쇄하여 세포를 분리하였다. 300×g에서 5분 간 원심분리 후 적혈구 lysis buffer(Sigma-Aldrich Co., St.
Louis, MO, USA)를 사용하여 적혈구를 제거하였다. 비장세 포는 5% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 50 μM mercaptoethanol을 함유 하는 RPMI 1640 배양액에 현탁하여 사용하였다. 1.25×
106 cells/mL로 현탁시킨 세포를 96-well plates(Costar, Cambridge, MA, USA)에 180 μL 분주한 후, mitogen으로 서 lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich Co.) 50 μg/
mL 혹은 concanavalin A(Con A, Sigma-Aldrich Co.) 1 μg/mL를 20 μL로 가한 후에 5% CO2 배양기에서 37°C 상 태로 72시간 배양하였다. 배양 후 상용화된 키트액(Cell Titer 96, Promega, Madison, WI, USA)을 20 μL로 각 세 포에 분주한 후 4시간 더 배양하였다. ELISA reader(Bio- Rad 570, Berkeley, CA, USA)의 490 nm의 파장에서 흡광 도를 측정하였다.
자료분석
자료의 통계처리에서 Prism7(Systat Software, La Jolla, CA, USA)을 이용하여 one-way ANOVA로 분석 후 Stu- dent’s t-test를 실시하여 평균치(mean)와 표준편차(SD)로 나타내었다.
결과 및 고찰
In vitro 연구를 통한 항암 효과 측정
프로시아니딘을 0~120 μg/mL의 농도로 유방암세포 (MCF-7), 직장암세포(SW-480), 림프종세포(U937), 간암 세포(HepG2)에 처리하여 36시간 배양 후, IC50값을 구하여 항암 효능을 측정하였다(Table 1). 각 세포에서 프로시아니 딘의 농도 증가에 따라서 암세포 성장이 저하됨이 관찰되었 고, IC50값은 유방암세포, 직장암세포, 림프종세포, 간암세 포에서 48.5~63.8 μg/mL를 나타내었다(Table 1). IC50이 230 μg/mL보다 작을 경우에는 항암물질이라고 판단하는 NCI 규정(37)에 따라서 프로시아니딘은 암세포 4종에 대하
여 항암 효능이 있다고 판단된다. 본 연구 결과에서 나타난 프로시아니딘의 직장암세포 증식억제 효과는 Hsu 등(18)의 발표와 거의 일치하는 결과를 보여주었다. 본 연구 결과는 고농도의 oligomeric 프로시아니딘 추출 분획(TP-6)이 간 암세포에 대하여 증식억제 효능을 나타낸 보고(38)와 프로 시아니딘 B2가 림프종세포에서 또는 유방암세포에서 각기 증식억제 효능을 나타낸 보고들(8,39)과 유사한 결과를 나 타내었다. 동물 모델에서 종양억제 효능을 검색하기 위하여 사용되는 본 oligomeric 프로시아니딘 분말은 in vitro 암세 포주에서도 항암 효능을 나타내는 것으로 판단된다.
In vivo 연구를 통한 항종양 효능, 혈액분석 및 림프구 증식 효능 측정
프로시아니딘의 항종양 효능 측정: 마우스에 림포블라스 트 암세포(P388D1)를 투여한 3일째부터 육안으로 종양 생 성이 확인되었으며, 23일간의 처치 후 대조군(P388D1+
CMC)에서 유발된 종양의 크기는 2,104.8 mm3로 NCI 매뉴 얼(33)에서 제시하는 종양성장의 범위에 속하는 크기로 확 인되었다. 프로시아니딘 투여군(P388D1+procyanidin)과 글리벡 투여군(P388D1+Glivec)의 종양성장 억제율은 각 기 12.89%(P<0.05), 21.22%(P<0.01)로 유의성 있게 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다(Table 2). 프로시아니딘 의 동물 모델에 대한 항종양 효능 연구로 Feng 등(24)은 프로시아니딘이 혈관생성 억제를 통해 면역억제 마우스에 서 종양의 성장을 억제한다고 보고하였으나, 종양성장 억제 율이 구체적으로 표현되지는 않았다. 최근에 프로시아니딘 은 폐암세포(A549)의 일회성 투여로 면역억제 마우스에 생 성된 소형의 종양(약 330 mm3)에 대하여 종양성장을 억제 한다고 보고하였으나(23), 본 연구에서는 공인된 방법에 따 라서 23일간의 지속적 투여로 성장된 고형암(약 2,100 mm3)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
No mitogen LPS Con A
normal P388D1+CMC P388D1+procyanidin P388D1+glivec
**
*
**
**
**
# ## **
##
Glivec
Fig. 1. Effect of procyanidin on ex vivo lymphoproliferative re- sponses in splenocyte cultures from BDF1 mice bearing P388D1 induced tumor. Splenocytes isolated from each drug-treated mouse were cultured for 72 h in the presence of either bacterial lipopoly- saccharide (LPS) or concanavalin A (Con A). Each bar repre- sents the mean absorbance at 490 nm/well±SD of 7 animals. The
* and # indicate the values significantly different from normal and positive control (P388D1+CMC), respectively. Significance of * or # is at P<0.05, and ** or ## is at P<0.001.
Table 3. Effect of procyanidin on hemocytes in mice bearing P388D1 induced tumor Hemoglobin treatment (N) WBC
(K/μL) Neutrophil
(% of WBC) Lymphocyte
(% of WBC) RBC
(M/μL) Hemoglobin (g/dL) PBS (7)
P388D1+CMC (7) P388D1+procyanidin (7) P388D1+Glivec (7)
6.82±0.77 17.75±1.94***
11.90±1.43***###
10.26±1.31**###
47.16±4.37 67.18±7.30***
51.02±5.86###
62.06±5.41***†
43.78±4.54 20.87±2.05***
38.78±4.32###
26.19±3.45***†††
9.51±0.42 6.24±0.70***
8.14±0.97*###
6.49±0.78***††
11.64±1.15 8.58±1.03***
10.51±0.93# 8.18±0.99***††
P388D1 (6×106 cells/day) was intraperitoneally injected in BDF1 mice for 23 days.
The *, #, and † indicate the values significantly different from normal, positive control (P388D1+CMC), and P388D1+procyanidin, respectively.
Significance of *, # or † is at P<0.05, and that of ** or †† is at P<0.005, and that of ***, ### or ††† is at P<0.001.
에 대한 프로시아니딘의 종양성장 억제 효능이 관찰되었다.
프로시아니딘이 종양이 유발된 동물 모델의 혈액성분에 미치는 영향: 23일간의 종양 유발과 시험물질 처치 후 정상 군(PBS), 대조군(P388D1+CMC), 프로시아니딘 투여군 (P388D1+procyanidin)과 글리벡 투여군(P388D1+Glivec) 의 혈액성분을 분석하였다(Table 3). 백혈구는 정상군과 비 교 시 3군의 종양 생성군, 즉 대조군, 프로시아니딘 투여군 과 글리벡 투여군에서 각기 유의성 있게 증가하였으며, 호중 구%는 정상군과 비교 시 대조군과 글리벡 투여군에서만 유 의성 있게 증가하였다. 림프구%와 헤모글로빈 함량은 정상 군과 비교 시 대조군과 글리벡 투여군에서만 유의성 있게 감소하였으며, 적혈구의 함량은 3군의 종양 생성군, 즉 대조 군, 프로시아니딘 투여군과 글리벡 투여군에서 각기 유의성 있게 감소하였다. 림포블라스트 암세포(P388D1)를 이식하 여 종양 생성으로 인하여 백혈구와 호중구%는 증가하고 림 프구%, 적혈구 수와 헤모글로빈 함량은 감소하는 것으로 판 단된다. 종양 생성으로 인한 백혈구와 호중구%의 증가는 이 전의 연구 결과들(40,41)에서 공통으로 보고된 바 있으나, 호중구의 증가로 항체의존성 세포 독성을 매개하여 종양 성 장을 억제한다는 연구 결과(41,42)와 호중구 세포의 팽창과 축적으로 종양 성장을 가속화하고 전이를 촉진한다는 상반 된 연구 결과(43-45)가 있다.
프로시아니딘 투여군에서는 종양성장을 나타내는 대조군 (P388D1+CMC)에서 증가한 백혈구와 호중구%가 유의성 있게 감소했고, 감소하였던 림프구%, 적혈구 수 및 헤모글 로빈 함량은 유의성 있게 증가하였다. 글리벡 처치군에서는 종양성장을 나타내는 대조군(P388D1+CMC)에서 증가한 백혈구만 유의성 있게 감소하였다. 본 결과로 프로시아니딘 투여군에서 대조군, 즉 종양성장에서 증가하였던 백혈구와 호중구%는 유의성 있게 감소했고, 감소하였던 림프구%, 적 혈구 수 및 헤모글로빈 함량은 유의성 있게 증가했으므로 프로시아니딘은 종양성장으로 발생된 혈액성분의 변화를 정상군(normal)으로의 회복 또는 중재시키는 것으로 판단 된다. 글리벡 처치군에서는 증가한 백혈구 수치만 유의성 있게 감소시킨 것을 고려할 때 프로시아니딘의 중재 효과가 더 우수한 것으로 생각된다.
프로시아니딘의 림프구 증식 효능 측정: 비장에서 항원특 이 수용체를 가지고 있는 림프구는 혈액으로부터 항원을 수
집하여 B 및 T 림프구가 자극을 받아서 증식 분화한다. B 림프구는 항체를 합성하고 분비하며 체액성 면역에 관여하 며, T 림프구는 사이토카인을 합성하고 분비하며 세포성 면 역에 관여한다. 이때 사이토카인은 다른 세포의 성장과 활성 화를 유도함으로써 항원 제거를 촉진한다. 또한, T 림프구의 도움이 없으면 B 림프구는 정상적인 항체반응을 나타내지 못하므로, T 또는 B 림프구의 증식은 면역시스템에서 매우 중요하다(46,47).
각 실험군의 비장을 체외적출 후 배양하여 mitogen 투여 에 따라 LPS 처치군 혹은 Con A 처치군으로 나누어 림프구 증식 효능을 측정하였다(Fig. 1). 대조군(P388D1+CMC), 프로시아니딘 투여군(P388D1+procyanidin)과 글리벡 투 여군(P388D1+Glivec)의 림프구 증식은 정상군(PBS)에 비 하여 유의성 있게 감소하였다. 프로시아니딘 투여군과 글리 벡 투여군은 대조군(P388D1+CMC)에 비하여 림프구 증식 능이 증가하였으며, 이는 Con A 처리 시에는 각각 유의성 있게 증가하였다. 본 결과에서 대조군, 프로시아니딘 투여군 과 글리벡 투여군의 림프구 생성능은 정상군과 비교 시 종양 생성으로 인하여 감소한 것으로 판단된다. 그러나 프로시아 니딘 투여군과 글리벡 투여군의 림프구 증식능을 대조군
(P388D1+CMC)과 비교 시, Con A 처리 시에는 각기 유의 성 있게 증가하였으므로 프로시아니딘과 글리벡은 각기 저 하된 면역기능을 증강시키는 효과가 있으며, 이는 글리벡보 다는 식이성 프로시아니딘의 장기 투여에 의한 효과가 더 뚜렷한 것으로 판단된다. 이같이 프로시아니딘 투여군에서 B 혹은 T 림프구의 증식능이 증가한 결과로 혈액분포 (Table 3)에서도 프로시아니딘 투여로 저하되었던 림프 구%가 증가 또는 회복된 것으로 추측된다.
한편 프로시아니딘은 항산화 효과(4,5)와 항염증 효능 (6,7)에 대하여 여러 보고가 있으며, 특히 항산화 작용에 대 하여는 활성 라디칼을 제거하고(48), 활성산소종의 발생을 억제하며(49), 마우스에서 카드뮴(Cd) 유발 산화적 손상 (oxidative damage)을 보호하는(4) 등 항산화능이 매우 뛰 어난 물질로 알려져 있다(5). 그러므로 본 연구에서는 프로 시아니딘의 항종양 효능을 면역증강에 대하여 중점적으로 연구하였지만, 타 연구 결과를 바탕으로 항산화 또는 항염증 효능과의 연계성도 고찰하였다. Wu 등(50)은 정상마우스에 장기간 피하주사된 프로시아니딘이 갈락토오즈로 유발된 산화적 손상을 억제함을 관찰하였고, 또 다른 종양(소형)유 발 마우스에 경구 투여된 프로시아니딘이 항산화 효소의 활 성을 증가시키고, 나아가서 종양 형성과 전이 상태(metasta- sis) 형성을 억제하는 것으로 보고하였다. 그러므로 프로시 아니딘의 항종양 기능성에 관여하는 항산화 작용에 관해 보 다 구체적인 연구가 요구된다.
본 연구에서 이루어진 면역시스템 조절을 이용한 항암 활 성을 두 단계로 나누어 볼 때 첫째는 인체 면역시스템의 메 모리 기능을 이용하여 T 세포(세포성 면역) 또는 항체(체액 성 면역)를 종양 항원에 의해 활성화시키고, 둘째는 T 세포 의 성장인자인 인터페론류 또는 암세포 괴사에 작용하는 tumor necrosis factor(TNF)-α 등의 사이토카인 분비를 증가시키는 것이다(48). 또한, 종양 면역에 주요 효능 물질 로 입증된 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)인 CD8+가 T 림프구의 활성 증가와 분화로 형성되는 아종임(47,51)을 고려할 때 본 연구 결과에서 프로시아니딘 에 의해 T 림프구의 증식이 증강된 것은 항종양 효능과 관련 된 것으로 판단된다. 그러므로 프로시아니딘은 세포 및 체액 성 면역반응의 증진을 통하여 항종양 효능을 나타낸 것으로 추측되며 작용기전 규명 등이 계속 연구되어야 할 것으로 기대된다.
요 약
본 연구에서는 프로시아니딘의 항종양 효능과 면역 조절기 능을 마우스를 이용한 동물 모델에서 평가하였다. 프로시아 니딘의 암세포 사멸 효능과 그 분자기작에 대한 여러 연구들 이 있지만, 동물 모델에 대한 연구는 거의 보고되어 있지 않다. 이에 본 연구는 P388D1 세포주를 피하이식 받은 동물 모델에서 프로시아니딘을 21일간 경구 투여한 후 종양성장
억제능, 혈액성분에 미치는 영향, 림프구 생성능을 측정하였 다. In vitro 상에서 프로시아니딘의 암세포증식 억제능이 현재까지 보고되지 않은 인체 유방암, 직장암, 림프종, 간암 세포에서 측정하였으며 IC50 값은 48.5~63.8 μg/mL로 확 인하였다. 프로시아니딘(200 mg/kg)과 글리벡(10 mg/kg) 을 종양 유발 마우스에 각각 21일간 투여하였을 때 프로시 아니딘 투여군(P388D1+procyanidin)과 글리벡 투여군 (P388D1+Glivec)의 종양 억제율은 각기 12.89%, 21.22%
로 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 프로시아니딘의 장기투여 효과를 혈액성분으로 분석 시 프로시아니딘 처치 군은 대조군(P388D1+CMC)에 비하여 백혈구와 호중구%
가 유의성 있게 감소하였고, 림프구%, 적혈구 및 헤모글로 빈은 유의성 있게 증가하였다. 체외 적출한 비장세포를 배양 하여 림프구 증식 효능을 측정 시 프로시아니딘 투여군과 글리벡 투여군은 대조군에 비하여 림프구 증식능이 증가하 였으며, 프로시아니딘 투여군의 림프구 증식능은 글리벡 투 여군에서의 증식보다 활발한 것으로 나타났다. 이상의 결과 를 종합해보면 프로시아니딘은 in vitro 연구에서 암세포 증 식억제 효능을 나타내었으며, 동물 모델에서는 종양성장 억 제능과 함께 면역반응 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.
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