황금이 천식모델 생쥐의 폐조직내 면역세포에 미치는 영향

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第14卷第1號 2005年 6月 30日

황금이 천식모델 생쥐의 폐조직내 면역세포에 미치는 영향

박길병·박양춘

Effect of Scutellariae Radix extract on immune cells in OVA-induced asthmatic mice lung tissue

Gil-Byung Park · Yang-Chun Park

Dep. of Internal Medicine College of Oriental Medicine, Daejeon University, Daejeon, Korea

Objective : The purpose of this research is to examine the effects of Scutellariae Radix(SR) extract on immune cells in ovalbumin(OVA)-induced asthmatic mice.

Methods : In vitro, C57BL/6 mice were exposed to OVA for 6 weeks. The mice lungs were taken out, chopped, grinded with collagenase and activated by rIL-3/rIL-5. The lung cells were treated with SR extract and analyzed by a flow cytometer.

Results : The population of granulocytes/lymphocytes, CD3e-/CCR3+, CD69+/CD3e+, CD23+/B220+, CD4+

cells in the SR group in vitro decreased and population of CD8+ cells in the 100 and 10㎍/㎖ SR group in vitro decreased, compared with that of control group.

Conclusion : The results of this study support a role for SR as an effective treatment for asthma in its experimental success in significantly decreasing inflammation and asthma reactions.

Key words : Scutellariae Radix, asthma, immune cell

1)

Ⅰ. 서 론

한의학에서 효천증의 범주에 해당하는 기관지천 식(이하 천식)은 가역적인 기도폐쇄 증상을 보이면 서, 기도과민반응을 나타내고, 기도의 염증소견이 관찰되는 염증성 기도질환이다¹⁾. 병리학적으로는 항원, 비만세포 및 IgE가 관여하여 분비되는 화학 매체의 직접적인 약리작용에 의하거나, 화학매체, 사이토카인 및 유착분자가 관여하여 기관지로 모여 온 염증세포에 의하여 발생하는 기도의 만성 알레 르기 염증성 질환으로 이해되고 있다²⁾. 따라서 폐

* 대전대학교 한의과대학 폐계내과학교실

· 교신저자 : 박양춘 · E-mail : omdpyc@dju.ac.kr

· 채택일 : 2005년 5월 9일

조직의 호산구, 비만세포, T임파구, 기관지상피세포 등은 천식의 염증반응에서 중요한 역할을 하며 관 련 화학매체 및 사이토카인 등은 천식연구에서 중 요한 연구대상이다³⁾.

황금(Scutellariae Radix)은 性은 寒無毒하고 味 는 苦하며 瀉實火, 除濕熱, 止血, 安胎하여 壯熱煩渴, 肺熱咳嗽, 濕熱瀉痢, 黃疸 등을 치료하는 효능 이 있으며^4), 알레르기성 접촉성피부염에 대한 연구

5), oxidant에 의한 세포손상에 미치는 영향^6,7), gastrin 및 uropepsin의 분비에 미치는 영향에 대 한 연구⁸⁾와 같은 다양한 연구들이 있었으나 천식모 델을 대상으로 하는 연구는 없었다.

이에 저자는 황금이 천식모델 생쥐의 폐조직에서 면역세포에 미치는 영향을 규명하고자 invitro 실험 으로 식을 유발시킨 생쥐의 폐세포에서 과립구/림

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프구, CD3e-/CCR3+, CD69+/CD3e+, CD23+/B220+, CD4+와 CD8+의 비율에 미치는 영향을 측정한 결과 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 재료 1) 동물

동물은 체중 18~25g의 C57BL/6(한국화학연구 소) 생쥐를 사료와 물을 충분히 공급하고, 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 동물만을 선별하여 실험에 사용하였다.

2) 약재

황금은 대전대학교부속한방병원에서 구입 정선하 여 사용하였다.

2. 실험방법

1) 황금 추출물 분리

황금 200g에 증류수 2,000㎖를 넣고 열탕 추출 기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과한 후 이를 감압 증류장치(rotary evaporator)로 농축하 였다. 이를 다시 동결 건조기(freeze dryer)를 이용 하여 완전 건조하여 얻은 최종 추출물을 냉동(-8 4℃) 보관하면서 적당한 농도로 희석하여 사용하였 다.

2) 천식모델 생쥐⁹⁾

500µg/㎖의 난알부민(OVA, chicken egg ovalbumin; Grade Ⅳ)과 10%(w/v) aluminum potassium sulfate(Alum)의 혼합물 0.2㎖(100㎍)를 복강내로 주사하여 전신 감작을 시켰고, 2주째에 생쥐를 마취한 후 난알부민(500㎍/㎖) 100㎕를 기 도 투여하였다. 3주째부터 분무기를 이용하여 2.5

㎎/㎖ 난알부민 용액을 하루에 30분씩 일주일에 3 회씩 6주 동안 비강 및 기도내로 흡입시켰다. 천식 이 유발된 생쥐의 폐를 적출하여 폐 조직을 잘게 절편한 후 2% 우태아 혈청(fetal bovine serum;

FBS)이 포함된 RPMI 1640 배지에 1㎎/㎖의 collagenase Ⅳ를 가한 용액 15㎖로 37oC, shaking 배양기에서 30분 동안 5회 이상 조직을 분해하여 폐세포를 분리하였다.

3) 폐세포 배양

24 well plate에 폐세포(2×106cells)를 배양하고 황금 추출물(이하 SR) 100, 10, 1㎍/㎖을 각각 처 리하고 1시간 후, rIL-3(30U/㎖)와 rIL-5(10㎍/㎖) 로 호산구 활성화 유발을 위하여 각각의 well에 첨 가하여 48시간 배양하였다.

4) 형광 유세포 분석

양성대조군으로 recombinant mouse interleukin-10(rmIL-10, 50ng/㎖)을 사용하였다.

배양 후 폐세포를 인산완충생리식염수(3% 우태아혈 청, 0.1% NaN3)로 2회 수세하였고, 4℃에서 면역 형광 염색(immunofluorescence staining)을 실시하 였다. 각각에 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또 는 PE(phycoerythrin) 형광물질이 결합된 CD3e, CCR3, CD69, CD23, B220, CD4, CD8 항체를 넣 고 30분간 얼음에서 반응시켰다. 반응시킨 다음 3 회 이상 인산완충생리식염수로 수세한 뒤에 유세포 형광분석기(FACS, Becton Dickinson, U.S.A.)로 생쥐 폐세포에서 CD3e, CD4, CD8, CD69, CCR3, B220, CD23(Fcε)의 발현을 분석하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 과립구/림프구에 미치는 영향

폐세포 중 과립구의 비율이 정상군에서는 24.8%, 대조군에서는 31.2%이었고, 양성대조군에서는 26.9%, SR를 100, 10, 1㎍/㎖ 투여한 실험군에서 는 각각 28.0, 29.1, 30.4%로 나타나 대조군에 비 하여 감소하였다(Fig. 1).

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SSC

FSC

31.2

44.2

26.9

44.3

41.8 L y m p h o c y t e s

G r a n u l o c y t e s(24.8)

(43.1)

-/- + / + + / + rIL-5/rIL-3 Normal OVA-control OVA- rIL-10

OVA- SR(100 mg/ml) OVA- SR(10 mg/ml) OVA- SR(1 mg/ml)

SSC

28.0

43.5

29.1 30.4

42.5

+ / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

FSC

SSC

FSC

31.2

44.2

26.9

44.3

41.8 L y m p h o c y t e s

G r a n u l o c y t e s(24.8)

(43.1)

-/- + / + + / + rIL-5/rIL-3 Normal OVA-control OVA- rIL-10

SSC

28.0

43.5

29.1 30.4

42.5

+ / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

FSC

Fig. 1. Inhibitory effect of Scutellariae Radix(SR) extract on granulocytes / lymphocytes population(%) in lung cells of OVA-induced asthmatic mouse.

C57BL/6 mice were exposed OVA for 6weeks. The mice lungs were taken out, chopped and disposed with collagenase.

Eosinophils were activated by rIL-3/rIL-5. The lung cells were treated with SR extract and incubated for 48hr at 37℃ and analyzed by flow cytometer.

Normal : Normal C57BL/6 mice.

OVA-Control : OVA-induced asthma lung cells.

OVA-rIL-10 : Positive control.

OVA-GS : OVA inhalation and SR extract (100, 10, 1 mg/ml).

SSC : side scatter.

FSC : forward scatter.

2. CD3e-/CCR3+에 미치는 영향

CD3e-/CCR3+ 세포의 비율이 정상군에서는 14.9%, 대조군에서는 26.9%이었고, 양성 대조군에 서는 16.9%, SR를 100, 10, 1㎍/㎖ 투여한 실험군

에서는 각각 14.5, 15.2, 19.34%로 나타나 대조군 에 비하여 감소하였다(Fig. 2).

CD3e

CCR3

Normal OVA-control OVA- rIL-10

OVA- SR(100 mg/ml) OVA- SR(10 mg/ml) OVA- SR(1 mg/ml)

CD3e

-/- + / + + / + rIL-5/rIL-3

CCR3 3 4 . 9

1 4 . 9 2 7 . 6

2 6 . 9 3 2 . 5

1 6 . 9

3 5 . 6

1 4 . 5 3 5 . 1

1 5 . 2 2 9 . 5

1 9 . 3 + / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

CD3e

CCR3

CD3e

-/- + / + + / + rIL-5/rIL-3

CCR3 3 4 . 9

1 4 . 9 2 7 . 6

2 6 . 9 3 2 . 5

1 6 . 9

3 5 . 6

1 4 . 5 3 5 . 1

1 5 . 2 2 9 . 5

1 9 . 3 + / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

Fig. 2. Inhibitory effect of Scutellariae Radix(SR) extract on CD3e-/CCR3+ population(%) in lung cells of OVA-induced asthmatic mouse.

C57BL/6 mice were exposed OVA for 6weeks. The mice lungs were taken out, chopped and disposed with collagenase. Eosinophils were activated by rIL-3/rIL-5. The lung cells were treated with SR extract and incubated for 48hr at 37℃ and analyzed by flow cytometer.

SSC : side scatter.

3. CD69+/CD3e+에 미치는 영향

CD69+/CD3e+ 세포의 비율이 정상군에서는 9.9%, 대조군에서는 16.9%이었고, 양성 대조군에 서는 60.2%, SR를 100, 10, 1㎍/㎖ 투여한 실험군 에서는 각각 9.6, 10.9, 13.3%로 나타나 대조군에

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비하여 감소하였다(Fig. 3).

CD69

CD3e

Normal OVA-control OVA-A23187

CD69

CD3e

-/- + / + + / + rIL-5/rIL-3

9 . 9 1 6 . 9 6 0 . 2

+ / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

9 . 6 1 0 . 9 1 3 . 3

CD69

CD3e

Normal OVA-control OVA-A23187

CD69

CD3e

-/- + / + + / + rIL-5/rIL-3

9 . 9 1 6 . 9 6 0 . 2

+ / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

9 . 6 1 0 . 9 1 3 . 3

Fig. 3. Inhibitory effect of Scutellariae Radix(SR) extract on CD69+/CD3e+

population(%) in lung cells of OVA-induced asthmatic mouse.

Eosinophils were activated by rIL-3/rIL-5. The lung cells were treated with SR extract and incubated for 48hr at 37℃ and analyzed by flow cytometer.

SSC : side scatter.

4. CD23+/B220+에 미치는 영향

CD23+/B220+ 세포의 비율이 정상군에서는 2.63%, 대조군에서는 5.36%이었고, 양성 대조군에

서는 2.82%, SR를 100, 10, 1㎍/㎖ 투여한 실험군 에서는 각각 2.81, 3.13, 4.87%로 나타나 대조군에 비하여 감소하였다(Fig. 4).

-/- +/+ +/+ rIL-5/rIL-3

CD23

B220

CD23

B220

2.63 5.36 2.82

30.1 16.7 24.8

2.81 3.13 4.87

21.6 20.3 20.5

+/+ +/+ +/+ rIL-5/rIL-3 -/- +/+ +/+ rIL-5/rIL-3

CD23

B220

CD23

B220

2.63 5.36 2.82

30.1 16.7 24.8

2.81 3.13 4.87

21.6 20.3 20.5

+/+ +/+ +/+ rIL-5/rIL-3

Fig. 4. Inhibitory effect of Scutellariae Radix(SR) extract on CD23+/B220+

Eosinophils were activated by rIL-3/rIL-5.

The lung cells were treated with SR extract and incubated for 48hr at 37℃ and analyzed by flow cytometer.

SSC : side scatter.

5. CD4+와 CD8+에 미치는 영향

CD4+ 세포의 비율이 정상군에서는 37.6%, 대조 군에서는 46.4%이었고, 양성 대조군에서는 41.2%, SR를 100, 10, 1㎍/㎖ 투여한 실험군에서는 각각

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42.9, 44.1, 45.4%로 나타나 대조군에 비하여 감소 하였고, CD8+ 세포의 비율이 정상군에서는 25.5%, 대조군에서는 29.6%이었고, 양성 대조군에 서는 26.7%, SR를 100, 10, 1㎍/㎖ 투여한 실험군 에서는 각각 28.8, 26.1, 29.9%로 나타나 100, 10

㎍/㎖ 투여한 실험군에서 대조군에 비하여 감소하 였다(Fig. 5)

CD4

CD8

CD4

CD8

3 7 . 6 4 6 . 4 4 1 . 2

2 5 . 5 2 9 . 6 2 6 . 7

4 5 . 4

2 9 . 9 -/- + / + + / + rIL-5/rIL-3

4 4 . 1

2 6 . 1 4 2 . 9

2 8 . 8

+ / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

CD4

CD8

CD4

CD8

3 7 . 6 4 6 . 4 4 1 . 2

2 5 . 5 2 9 . 6 2 6 . 7

4 5 . 4

2 9 . 9 -/- + / + + / + rIL-5/rIL-3

4 4 . 1

2 6 . 1 4 2 . 9

2 8 . 8

+ / + + / + + / + rIL-5/rIL-3

Fig. 5. Inhibitory effect of Scutellariae Radix(SR) extract on CD4+ and CD8+

C57BL/6 mice were exposed OVA for 6weeks. The mice lungs were taken out, chopped and disposed with collagenase. Eosinophils were activated by rIL-3/rIL-5. The lung cells were treated with SR extract and incubated for 48hr at 37℃ and analyzed by flow cytometer.

SSC : side scatter.

Ⅳ. 고 찰

기관지천식(이하 천식)은 인구의 10%가 앓고 있 는 흔한 질환으로 지난 20년간 많은 나라에서 천식 의 발병율과 유병율이 증가하고 있다고 알려져 있 는데 최근 천식에서 기초가 되는 염증반응의 중요 한 역할을 인식하게 되어 많은 세포와 세포성 요소 들이 역할을 하는 만성 염증성 기도질환으로 기도 의 과민성과 가역적인 기류제한을 동반하는 질환으 로 정의하고 있다¹⁾.

천식의 병인에 있어 보조 T세포(이하 Th세포)는 서로 길항작용을 나타내는 Th1세포와 Th2세포로 나뉘는데 Th1세포는 주로 IFN-γ, TNF-β, IL-2를 생산하고, Th2세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 등 을 생산한다. 이때 Th2 경로는 기관지천식과 같은 알레르기성 질환의 기초가 되어 천식환자의 기관지 폐포세척액에서 Th2세포 기능의 활성화가 관찰되 고 있다^10~12). 따라서 항진된 Th2 형의 면역 반응 을 억제하는 것이 천식의 치료에 있어 중요하게 생 각되고 있다¹³⁾.

호산구는 여러 가지 사이토카인들을 분비하여 다 른 세포들을 활성화 시키며 기도조직의 손상을 가져 오는데 천식환자의 혈액, 기관지폐포액, 기도상피 그 리고 객담에 많이 존재하고 있다¹⁴⁾. 즉 기관지에 모 여든 호산구는 자사(apoptosis)가 억제되고 활성화된 상태로 major basic protein(MBP), eosinophil cationic protein(ECP), eosinophil derived neurotoxin(EDN), eosinophil peroxidase(EPO) 등 의 세포독성단백을 분비하여 기도 상피의 섬모운동 을 억제하고 상피세포를 탈락시키며 기도 과민증을 초래한다. 또 활성화된 호산구는 지질 대사물질을 새로 형성하고 합성하는데 즉 arachidonic acid, leukotrien C4(LTC4), 혈소판 활성 인자(platelet activating factor, PAF) 등을 유리하여 혈관과 기도 평활근에 작용함으로써 알레르겐 흡입 유발시에 조 기반응과 후기반응을 일으킨다³⁾.

천식은 韓醫學에서 呼吸急促, 喉中有聲하는 哮喘證의 範疇에 해당하며, 寒冷說, 心因說, 痰因說, 素因說, 感染說, 過敏性反應 등을 원인으로 보고 있 다¹⁵⁾. 哮喘證의 치료에 있어 實證은 外感風寒, 痰濕內盛으로 나누어 宣肺定喘, 化痰定喘하는 치법을 사

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용하고, 虛證은 肺虛, 心腎虛損, 上實下虛로 나누어 養肺定喘, 補益心腎納氣定喘, 瀉肺化痰補益腎元하 는 치법을 사용한다¹⁵⁾.

황금(Scutellariae Radix)은 꿀풀과(Labiatae)에 속한 다년생 초본인 황금(Scutellaria baicalensis GEORGI)의 근을 건조한 것으로, 性은 寒無毒하고 味는 苦하며 瀉實火, 除濕熱, 止血, 安胎하여 壯熱煩渴, 肺熱咳嗽, 濕熱瀉痢, 黃疸 등을 치료하는 효 능이 있으며⁴⁾, 기존의 연구로 전 등⁵⁾은 알레르기성 접촉성피부염에 대한 효능에 대하여, 허 등⁶⁾과 김 등⁷⁾은 oxidant에 의한 세포손상에 미치는 영향에 대하여, 김 등⁸⁾은 gastrin 및 uropepsin의 분비에 미치는 영향에 대하여 보고하고 있으나 천식모델을 대상으로 하는 연구는 없었다.

이에 저자는 황금이 천식유발 면역세포에 미치는 영향을 규명하고자 in vitro 실험으로 천식을 유발시 킨 생쥐의 폐세포에서 rIL-3(30U/㎖)와 rIL-5(10㎍/

㎖)로 호산구를 활성화시킨 다음 유세포분석을 통하 여 과립구/림프구, CD3e-/CCR3+, CD69+/CD3e+, CD23+/B220+, CD4+와 CD8+의 비율에 미치는 영향을 측정한 결과 황금을 처리한 실험군에서 과립 구, CD3e-/CCR3+, CD69+/CD3e+, CD23+/B220+, CD4+ 세포의 비율이 대조군에 비 하여 농도의존적으로 감소하였고, CD8+ 세포의 비 율은 황금을 100, 10㎍/㎖ 처리한 실험군에서 감소 하였다(Fig. 1~5).

과립구의 증가 및 활성화는 호산구의 인입과 나 란히 일어나는데¹⁶⁾, 실험군에서 대조군에 비하여 과 립구의 비율이 감소하는 것은 천식유발과 관련되는 호산구의 유입을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 생각된다.

화학주성을 갖는 사이토카인을 케모카인이라고 하는데, eotaxin같은 케모카인에 노출된 백혈구들은 케모카인 수용체를 발현하게 된다. 주로 호산구에서 발하는 케모카인 수용체인 CCR3는 호산구가 혈관 내피세포와 결합한 후 조직내로 침투하도록 한다

17~19). 따라서 CCR3의 발현을 조절하면 천식을 억

제할 수 있을 것으로 기대되는데^{20, 21)} 실험군에서 CCR3의 비율이 대조군에 비하여 감소한 것은 황금 이 호산구의 활성화를 억제하여 호산구의 기도조직 내 유입을 감소시킴으로써 천식에 대한 효과를 나

타낼 수 있다는 가능성을 보여준다고 생각된다.

CD3는 T세포 표면분자이고 CD69는 활성화된 B 세포 및 T세포 및 대식세포, 세포독성 세포에 존재 하는 표면분자로 T세포의 초기 활성화를 나타내며, 활성화된 호산구에서 분비되므로 천식환자의 기도 에서 호산구침윤의 표지가 될 수 있다²²⁾. 실험군에 서 CD69의 비율이 대조군에 비하여 감소하는 것은 황금이 호산구의 기도내 침윤을 억제하는 작용이 있음을 보여준다고 생각할 수 있다.

항원에 의하여 생성된 IgE가 결합되는 표적세포 에 존재하는 Fc 수용체의 하나인 FcεRⅡ/CD23은 homotypic adhesion, B세포의 autostimulation, T 세포에의 항원전달 등의 기능을 가지고 있는데, 항 CD23 항체에 의해서 IgE 항체 생성이 억제된다는 보고들을 볼 때 전반적인 B세포의 성장의 조절 및 IgE 항체 생성의 조절에 관여할 것으로 생각되고

있다^{23, 24)}. 실험군에서 CD23의 비율이 대조군에

비하여 감소하는 것은 황금이 B세포의 분화와 IgE 의 생성을 조절함으로써 천식에 대한 효과를 나타 낼 수 있다는 근거를 제시하는 것으로 생각된다.

T세포 표면 항원 수용체를 T세포 수용체(T cell recepter, 이하 TCR)이라 하며 TCR은 다시 TCR1 과 TCR2로 구별되고 그 중 TCR2를 가진 T세포는 CD4+인 보조 T세포와 CD8+인 세포독성T세포로 나뉜다²⁵⁾. 보조 T세포(이하 Th세포)는 사이토카인 분비양상에 따라 Th1세포와 Th2세포로 나뉘는데 Th2에서 분비되는 사이토카인들이 기관지천식의 과민반응에서 주요한 역할을 하게 된다^{26, 27)}. 따라 서 실험군에서 CD4+ 세포의 비율이 대조군에 비 하여 감소하는 것은 Th세포의 발현을 억제하여 천 식에 관련되는 면역반응의 발생을 억제하는 것으로 생각된다. CD8+ 세포는 세포독성T세포로 Th세포 와 마찬가지로 사이토카인 분비 양상에 따라 IL-2, IFN-γ를 분비하는 T cytotoxic 1(Tc1) 세포와 IL-4, IL-5 등을 분비하는 T cytotoxic 2(Tc2) 세 포로 분류하기도 하는데²⁸⁾ 기관지천식 환자의 기관 지폐포세척액내에서 CD8+ 세포 분율의 증가를 보 고하고 있다²⁹⁾. 황금을 100, 10㎍/㎖ 투여한 실험 군에서 CD8+ 세포의 비율이 대조군에 비하여 감 소하였고 1㎍/㎖ 투여한 실험군에서는 증가하였다.

이상의 결과를 종합해 보면 황금은 천식의 병리

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에서 중요하게 작용하는 면역세포의 조절에 영향을 줌으로써 천식의 염증반응에 효과를 나타낼 수 있 을 것으로 생각된다.

Ⅴ. 결 론

황금이 알레르기 천식 모델 생쥐의 폐조직내 면 역세포에 미치는 효과를 관찰한 결과 과립구/림프 구, CD3e-/CCR3+, CD69+/CD3e+, CD23+/B220+, CD4+의 비율이 실험군에서 대조 군에 비하여 감소하였고, CD8+의 비율은 100, 10

㎍/㎖ 투여한 실험군에서 감소하였다.

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