1)
본 연구는 1997년 서울대학교병원 연구비 지원과 한국과학재단 의 연구비 지원으로 이루어졌음.
접수 : 2002년 5월 27일, 수정 : 2002년 8월 20일, 승인 : 2002년 8월 25일
책임저자 : 김병국, 서울대학교 의과대학 내과학교실 Te l : 02)760- 2252, Fax : 02)762- 9662 E- ma il : bkkim@s nu.ac.kr
서 론
강화된 관해유도요법과 관해 후 치료에 힘입어 성인 급 성골수성백혈병의 치료 성적이 향상되어 왔다. 그럼에도 불구하고 60세 이하 환자 중 65～70% 환자가 완전관해에 도달하고, 약 23～33%의 환자에서만 장기 무병생존을 기
급성골수성백혈병에서 K i - 67 단클론항체를 이용한 세포주기 분석
서울대학교 의과대학 내과학교실1, 암연구센터2, 단국대학교 의과대학 내과학교실3
안진석1 , 2・김은실2・김흥태3・박선양1 , 2・김병국1 , 2
Cell Cycle Analysis by Ki-67 Monoclonal Antibody in Acute Myelogenous Leukemia
J in Seok Ahn , M.D.1 , 2, Eun S hil Kim2, He ung Ta e Kim, M. D.3, Seonya ng Pa rk, M. D.1 , 2, a nd Byoung Kook Kim, M. D.1 , 2
D ep artm ent of I n t ernal M ed icin e1 and Can cer R es earch Cen t er2, S eoul N at ional Un iv ers ity Colleg e of M ed icin e, S eoul, K orea,
D ep artm en t of I nt ernal M ed icin e3, D ank ook Un iv ers ity M ed ical Colleg e, Chunan, K or ea
B ac k g roun d : Flow cyto metric meas ure me nt of DNA c a n reve a l G0/ G 1, S, G2/ M phase s of c e ll cyc le , a nd Brd U la be ling c a n dete rmine t he pe rce ntage of c e lls in active DNA synt hes is . A monoc lo na l a ntibody (MoAb), Ki- 67, re cognizes a prote in that is pres e nt o nly in the nuc le us of cyc ling ce lls but a bs e nt in re st ing c e lls . We a na lyzed whet he r the resting a nd the prolife r- at ing fraction co uld be diffe re ntiated by double sta ining with Ki- 67 MoAb a nd pro pidium iodide (PI), a nd o bs e rved t he effects of GM- CS F o n c e ll cyc le in ac ute mye loge nous le uke mia (AML) ce lls by Ki- 67 MoAb .
Me th ods : Blast ce lls we re pre pa red fro m 9 AML patie nts . The ce lls we re inc ubate d fo r 48 hours with or without GM- CSF. Ce lls we re sta ine d with Brd U/ PI a nd Ki- 67/ PI. Ce ll cyc le was a na lyze d by flow cytometry.
Re s ult s : The ave rage fra ction of G0/ G1, S , a nd G2/ M phase s wa s 84.6%, 10 .9%, a nd 4.5
% by Brd U/ PI a nd 87.8%, 8 .6%, a nd 3 .7% by Ki- 67/ PI, re s pective ly. Ki- 67/ PI sta ining d is- -c riminated betwee n G0 a nd G1 phas es a nd
the ave rage was 7 1.5% a nd 16 .3%, re s pec- tive ly. In ce lls inc ubated with GM- CS F, Brd U/
PI method s howed t hat the ave rage S pha se fraction (S PF) s ig nifica ntly inc reas ed from 10 .9 to 16 .2% (P=0 .0 1) a nd the fraction of G0/ G 1 phase dec reas ed fro m 84.6% to 78 .4% (P=
.02). Ki- 67/ PI method s howed that the me- dia n SPF s ignific a ntly inc reas ed fro m 8.6% to 13 .7% (P=0.05) a nd G0 fraction dec reas ed from 7 1.5% to 58 . 1% (P=0 .02) but G 1 fraction inc rea se d from 16 .3% to 22.3% (P=0.0 1).
Con c lu s ion : Ce ll cyc le a na lys is by Ki- 67 MoAb a nd PI in AML is ra pid a nd s imple . It is es pec ia lly us eful to dete rmine t he growth fraction a nd G0 fraction c ompa red to Brd U/ PI sta ining . (Ko re a n J He m ato l 2002 ;3 7 :19 1 ～ 199)
K e y W ords : Ac ute mye loge no us le uke mia , Ce ll cyc le , Ki- 67 a ntige n, G0 pha s e , Gra nulocyte- mac ro pha ge c o lo ny- stimulat ing facto r
19 1
은 환자에게만 국한되어 있고 완전관해에 도달한 환자를 주 대상으로 하고 있는 실정이어서 골수이식의 적용은 제한적 이다.
급성골수성백혈병의 세포동력학 분석 (cytokinetic anal- ysis) 에 의하면 상당수의 모세포 (blast) 가 증식하지 않거나 매우 천천히 증식하는 것으로 확인되었다.2～ 4) 이러한 사실 이 주로 cycling cell을 표적으로 하고 있는 항암화학치료에 대한 내성에 중요한 역할을 할 수 있다. 급성골수성백혈병 치료의 근간을 이루는 cytosine arabinoside는 백혈병 세포 에서 활성화된 대사산물로 전환되어 DNA 합성을 방해하므 로 주로 S기에 세포독성을 나타내는 세포주기 특이적 (cell cycle-specific) 약물이다.5) 따라서 비증식 세포는 cyto- sine arabinoside의 세포독성으로부터 벗어날 수 있게 된 다. 이러한 G0 분획이 세포동력학적 내성 (cytokinetic resistance) 에 대한 설명이 될 수 있다. Daunorubicin의 효 과는 DNA 삽입 (intercalation)과 topoisomerase- II에 대한 작용으로 이루어지는데 이 효소는 휴지기인 G0 세포에는 매우 낮게 존재하고 세포가 G1, S기로 들어감에 따라 증가 한다. 따라서 급성골수성백혈병의 치료에 있어 증식 분획 을 증가시키는 것이 종양 세포를 효과적으로 파괴시킬 수 있다. 여러 연구에서 interleukin-3, granulocyte-macro- phage colony- stimulating factor (GM- CSF) 와 granulo- cyte colony- stimulating factor가 정상 전구세포의 증식 및 분화의 조절인자이며, 또한 백혈병 세포의 증식과 분화를 촉진시킬 수 있음을 보여 주었다.6～ 10 ) Cannistra 등1 1)은 GM- CSF가 S기 분획을 증가시켜 S기 특이성 약물에 대한 세포독성을 증가시킴을 보고하였다. Tafuri 등12)은 단순한 S기 분획의 증가보다 G 세포의 감소와 S 세포의 증가로 정 의할 수 있는 동원 (recruitment)이 성장인자의 세포살상 증강 효과를 더 잘 반영한다고 보고하였다.
전통적으로 유세포 분석 (flow cytometry)을 통한 세포주 기 분석은 DNA 양을 측정함으로써 각 세포주기에 따른 DNA 양의 차이를 이용하여 이루어졌다. 이 방법은 빠르고 재현성이 높으며 G0/ G1, S, G2/ M기의 세포수를 추정할 수 있게 해 준다.13) Bromodeoxyuridine (BrdU)은 DNA 전구물질로 DNA를 합성하는 세포에 흡수되어 DNA에 포 합된다. Anti- BrdU 항체를 이용하여 포합된 BrdU 양을 측 정할 수 있어 활발히 DNA를 합성하는 세포의 분획과 DNA 합성 속도를 측정할 수 있다.14) 그러나 이를 이용한 세포주기 분석 결과에는 휴지기의 세포 즉, G0 분획과 G1 분획이 구분되지 못하는 단점이 있어서 세포주기 분석에 따른 항암화학요법의 영향을 연구하는데 장애가 되고 있 다. 활발히 분열하는 세포는 여러 가지 특이한 단백질을 생
수 있다. 이러한 단백질중 핵항원 Ki-67은 휴지기 세포에 는 존재하지 않고 cycling cell에만 존재하는 증식과 연관된 핵항원이며 이에 대한 Ki-67 단클론항체는 cycling cell을 인지할 수 있는 것으로 알려져 있다.15) Ki- 67 항체는 DNA 전구물질의 사용 없이 성장분획을 신속히 구할 수 있어 매 우 실용적이며,16) DNA 염색과 병행하여 휴지기를 포함한 세포주기의 전 단계를 분석하는데 사용될 수 있다. 본 연구 에서는 Ki-67 단클론항체와 DNA에 대한 형광염료인 propidium iodide (PI)를 사용하여 휴지기의 세포 분획과 증식기의 세포 분획을 구분할 수 있는지를 분석하고 GM- CSF가 급성골수성백혈병 세포의 세포주기에 미치는 효과를 관찰함으로써 세포주기분석에 있어 Ki-67 단클론항 체의 유용성을 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
1 . 대상 환자 및 세포
서울대학교병원 내과에 입원한 9명의 급성골수성백혈병 환자의 말초 혈액 혹은 골수 세포를 대상으로 하였다. 진단 은 골수세포의 형태학적, 조직화학적, 면역학적 방법에 따 라 이루어졌다. 8명은 처음으로 백혈병을 진단 받고 치료 이전 상태였고, 1명은 관해유도요법으로 완전관해에 도달 한 후 재발한 환자였다. 이들의 French -American- British 분류에 따른 진단 아형은 M2가 4명, M4가 4명, M6가 1 명이었다. 세포 채취시 말초 혈액에서 백혈구수는 평균 26. 4×109/ L이었고 모세포는 평균 63%였다 (Table 1) .
Ta b le 1 . P a t ie nt s c ha ra c t e r is t ic s
No. Case Sex Age Type WBC (×109/L) Blasts (%) Source 1
2 3 4 5 6 7 8 9
F M M F M F M F M
24 41 56 21 36 29 61 55 35
M4 M2 M4 M2 M2 M4 M6 M4 M2
2.7 5.1 16.4 45.7 56.7 5.4 2.3 27.6 75.6
44 29 67 75 88 45 38 92 88
PB PB PB PB PB BM PB PB PB Abbreviations : PB, peripheral blood; BM, bone marrow
2 . 방 법
1) 세포 준비
8명의 환자로부터 말초혈액을 채취하였고 1명으로부터 는 골수를 채취하였다. 채취한 혈액 혹은 골수를 1:1의 비 율로 RPMI배양액 (Gibco, USA)으로 희석한 다음 미리 Ficoll- Hypaque (Pharmacia, Sweden : S. G. 1. 007) 100
% 원액과 80% 희석액을 2층으로 넣어 둔 튜브에 중층한 후 400g로 30분간 원심분리하여 림프구가 제거된 모세포층 을 채취한다. RPMI배양액으로 2회 세척한 후 단핵세포의 제거를 위해 10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI배양액에 부 유시킨 다음 조직배양 플라스크 (Becton Dickinson, USA) 에 넣고 37℃, 5% CO2배양기에서 1시간 배양 후 다시 용 기를 바꿔 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 취하 여 혈구계 (hemocytometer)로 세포수를 계산하였다.
2 ) 세포 염색
백혈병 모세포의 세포주기 분석을 위해 별도의 두 가지 염색 방법을 사용하였다.
(1) BrdU/ PI 방법
10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI 배양액에 1×106/ mL로 세포를 부유시킨 후 polystyrene 튜브에 1mL씩 넣었다. 100 μL의 BrdU (Boehringer Mannheim, Germany)를 넣고 37℃, 5% CO2하에서 30분간 배양하였다. PBS로 두번 세척 하고 100μL의 생리식염수를 첨가하였다. 5mL의 찬 (-20℃) 70% 에탄올을 흔들면서 튜브에 방울방울 넣고 하룻밤동안 고 정시켰다. PBS로 세척 후 1mL의 2N HCl/ 0. 5% Triton X- 100 (Sigma, USA) 을 넣고 실온에서 30분간 배양하였다.
PBS로 세척한 후 1mL의 0. 1M sodium tetraborate에 재부 유하였다. PBS로 세척 후 50μL의 0. 5% Tween 20 (Sigma) / BSA/ PBS에 부유시켰다. 20μL의 anti- BrdU (Becton Dickinson) 를 넣고 실온에서 30분간 배양하였다.
PBS로 세척 후 50μL의 0. 5% Tween 20 (Sigma) / 1%
BSA/ PBS에 재부유시켰다. 1mL의 FITC- goat anti- mouse IgG (Becton Dickinson) 를 넣고 실온에서 30분간 배양하였다. 대조군 세포에는 첨가하지 않았다. PBS로 세척 후 PBS로 100배 희석된 1mL의 PI (Sigma)를 넣었다. 차광 한 상태로 실온에서 30분간 배양하였다.
(2) Ki- 67/ PI 방법
약 50μL의 용액에 105개의 신선 세포 혹은 냉동/ 해동 세포가 든 튜브를 얼음이 든 통에 넣고 진탕기 (shaker) 위 에서 천천히 흔들면서 염색을 하였다. 세포의 냉동은 냉동 완충액 (sucrose 250mM, dimethylsulfoxide 5% v/ v, Na citrate 40mM, pH 7. 6) 에 세포를 넣고 - 70℃에서 보관하
였다.
200μL의 용해/ DNA 염색 용액 (PI [Sigma] 20μg/ mL, RNase (Boehringer Mannheim) 0. 2mg/ mL, Nonidet P40 (Sigma) 0. 5% v/ v, EDTA 0. 5mM in Dulbeco ' s phosphate- buffered saline at pH 7. 2) 을 15분간 첨가하였 다. 25μL의 단클론 Ki-67 항체 (DAKO, USA, code No.
M- 722, lot 101) 혹은 동량의 대조 항체 (DAKO X- 931) 를 15분간 첨가하였다. 25μL의 FITC- conjugated rabbit anti- mouse antibody (DAKO F - 313, F [ab ' ] 2 fragment, 5% 정상 토끼 혈청 (DAKO X- 902) 이 포함된 PBS로 10배 희석)를 15분간 첨가하였다.
3 ) G M- C S F에 의한 세포동력학적 동원 (c yt o kine t ic re c ru it me nt )
1×106/ mL로 백혈병 모세포수를 맞춘 후 튜브에 5mL를 넣고 10ng/ mL의 농도로 GM- CSF (럭키 바이오텍)를 첨 가하였다. 대조군에는 GM- CSF를 첨가하지 않았다. 3 7℃, 5% CO2하에서 48시간 배양한 후 염색하였다. 배양 액은 10% 우태아혈청이 첨가된 RPMI를 사용하였다. 저자 들은 세포주를 이용한 실험에서 GM- CSF 투여 48시간 후 에 S기가 최고로 증가함을 확인하였다.17)
4 ) 유세포분석
염색된 시료는 FACStarPLUS (Becton Dickinson) 세포 분리기 (cell sorter)를 이용하여 분석하였다. 488nm 아르 곤레이저 (400mW)를 사용하여 515～540nm에서 로그 (log) 녹색 형광과 >620nm에서 직선 (linear) 적색 형광을 이중 변수 (dual-parameter)로 측정하였다. 세포당 Ki-67 양은 FITC의 녹색 형광으로, DNA 양은 PI의 적색 형광으 로 측정되었다. 사용된 필터는 narrow band pass filter (Becton Dickinson)로 band width는 15nm이었다. 형광 신호는 전자적으로 보상되지 않았다. 노즐 (nozzle)의 지름 은 70μm이었고 sheath fluid는 증류수를 사용하였다. 보 정 (calibration)을 위해 녹색 형광 비드 (bead) (Becton Dickinson) 와 PI로 염색된 비고정된 chicken 적혈구핵을 사용하였다. Data lister를 이용하여 자료는 HP 9000 computer (Hewlett Packard, USA) 로 전송되어 저장과 분 석 (list mode)이 이루어졌다. 분석을 위해 CellFIT과 LYSIS II software (Becton Dickinson) 를 사용하였다. 응 집체 (aggregate)는 pulse shape analysis (red fluores- cence peak versus area cytogram) 를 이용한 gating으로 이후의 분석에서 제외시켰다.
3 . 통계 분석
GM- CSF를 이용한 세포동력학적 동원에서 대조군과 비
이용하여 통계적 분석을 하였다. 유의수준은 P< 0. 05로 하 였다.
결 과
급성골수성백혈병 세포를 BrdU/ PI로 염색하여 세포주 기를 분석한 예를 Fig. 1에, Ki-67/ PI로 염색한 예는 Fig.
2에 도시하였다. Pulse shape analysis로 응집체를 제외한 후 Ki-67 음성 대조군의 형광 상한값을 Ki-67 양성의 기준 으로 삼았다.
1 . Ki- 6 7/ P I 염색과 Brd U/ P I 염색에 의한 세포주기 분석의 비교
GM- CSF를 첨가하지 않고 48시간 동안 배양했던 대조 세포군에서 BrdU/ PI 염색과 Ki-67/ PI 염색에 의한 급성 골수성 백혈병의 세포주기 분석은 서로 유사한 결과를 보
평균치는 각각 84. 6%, 10. 9%, 4. 5%를 보였고, Ki-67/
PI 염색으로는 각각 87. 8%, 8. 6%, 3. 7%를 보였다.
Ki- 67/ PI 염색에 의해서는 G0/ G1기를 G0와 G1기로 나눌 수 있었고 평균치는 각각 71. 5%와 16. 3%였다. 그리고 Ki- 67 labeling index의 평균치는 24. 4%였다.
2 . G M- C S F를 이용한 세포동력학적 동원에서 Ki- 6 7/
P I 염색에 의한 세포주기 변화의 관찰 (Ta b le 3 , 4 )
Fig. 3은 GM- CSF로 48시간 동안 배양한 세포군에서 BrdU/ PI 염색을 이용한 세포주기의 변화를 보여주고 있는 데 S기 분획의 평균치가 10. 9%에서 16. 2%로 유의하게 상 승한 반면 (P=0. 01) , G0/ G1기는 84. 6%에서 78. 4%로 감 소하여 (P=0. 02) G0/ G1기에서 유래함을 알 수 있었다.
Fig. 4에서 Ki- 67/ PI 염색을 이용한 세포주기의 변화를 보 면 S기 분획의 중앙치가 8. 6%에서 13. 7%로 유의하게 상 승하였는데 (P=0. 05) G0기는 71. 5%에서 58. 1%로 감소한
Fig . 1. Re prese ntative exa mple of flow cytometric a na lys is of ce ll cycle by BrdU/PI.
Aggregates a re excluded for s ubseque nt investigation by pulse s ha pe ana lys is (Top).
Bottom left is is otype negative control for the BrdU (bottom right).
T a b le 3 . C e ll c yc le a na ly s is b y Brd U/ P I in mye - lo id le u ke m ic c e lls w it h a n d w it ho ut c yt o kin e t ic re c r u it me nt
G0/G1% S% G2/M%
No. Case C* GM† C GM C GM
1 2 3 4 5 6 7 8 9
71.7 77.4 80.7 69.6 92.7 88.5 96.5 92.3 92.1
56.6 70.8 72.6 71.3 85.9 71.3 95.7 90.6 90.6
21.4 16.4 16.8 24.9 4.7 8.2 0.8 2.3 2.8
35.0 22.4 24.2 23.8 10.0 20.8 2.2 2.9 4.7
6.9 6.2 2.5 5.5 2.6 3.3 2.6 5.4 5.1
8.4 6.8 3.2 4.9 4.2 7.9 2.1 6.6 4.7 Mean
SD‡
84.6 10.0
78.4 12.9
10.9 9.0
16.2 11.6
4.5 1.7
5.4 2.1
*control,†GM- CSF recruitment,‡standard deviation F ig . 2 . Re pres e ntative exa mple of flow cytometric a na lys is of ce ll cycle by Ki- 67/P I.
Aggregates a re exclude d from s ubs eque nt inve stigation by pulse s ha pe a na lys is (Top left). Bottom left is is otype negative control for the Ki- 67 (bottom).
Ta b le 2 . C e ll c yc le a n a lys is b y Brd U/ P I a nd Ki- 6 7/ P I in mye lo id le u ke m ic c e lls
BrdU/PI Ki- 67/PI
No.
Case G0/
G1% S% G2/
M% G0% G1% G0/
G1%* S% G2/
M%
Ki- 67%
1 2 3 4 5 6 7 8 9
71.7 77.4 80.7 69.6 92.7 88.5 96.5 92.3 92.1
21.4 16.4 16.8 24.9 4.7 8.2 0.8 2.3 2.8
6.9 6.2 2.5 5.5 2.6 3.3 2.6 5.4 5.1
53.6 60.6 79.3 75.4 92.9 89.4 87.8 87.3 16.9
23.1 27.3 4.5 2.7 2.1 1.3 4.1 5.2 76.6
76.6 88.0 83.7 78.1 95.0 90.7 91.9 92.5 93.4
16.2 8.7 11.1 16.0 3.5 5.3 8.0 5.2 3.3
7.2 3.4 5.1 5.9 1.5 4.1 0.1 2.3 3.3
43.6 38.2 14.2 13.4 5.5 3.9 8.4 9.8 82.8 Mean
SD† 84.6 10.0
10.9 9.0
4.5 1.7
71.5 24.5
16.3 24.6
87.8 6.8
8.6 4.9
3.7 2.2
24.4 26.1 Each case was duplicated.
*G0/G1 in Ki-67/PI were calculated from G0 plus G1. †standard deviation
반면 (P=0. 02) , G1기는 16. 3%에서 22. 3%로 증가하여 (P=0. 01) GM- CSF가 leukemic blast의 G0 분획을 동원하 여 S기를 증가시킴을 보여 주었다. 개별 증례로 보면 9례 중 6례에서 S기 분획이 50% 이상 상승하였다. 이때 Ki-67 표지지표 (labeling index)는 24. 4%에서 36. 5%로 유의하 게 상승하였다 (P=0. 01) .
고 찰
세포의 증식에 대한 양적 정보, 즉 세포동력학 (cyto- kinetics)에 대한 이해는 혈액학적 악성종양의 치료에 사용 되는 항암화학요법에 매우 유용하다. 세포주기중 증식기에 있는 대부분의 세포는 항암제에 민감한 반면, 휴지기의 세 포는 약제에 민감하지 못하다. 이런 면에서 세포주기의 G, G1, S, G2, M기의 각 분획과 활발히 증식하는 세포분획, 즉 성장분획 (growth fraction)을 아는 것은 매우 중요하다.
세포동력학의 분석을 위해 여러 가지 방법이 사용되어 왔 다. 방사성 DNA 전구물질인3H-thymidine 혹은 비방사성 전구물질인 BrdU를 이용한 표지지표와 DNA 유세포 분석 을 통한 세포주기 분석이 많이 사용되어 왔다. 전자의 방법 은 세포주기의 S기 분획을 구할 수 있고 역동적 동력학 (dynamic kinetics) 에 대한 정보를 얻을 수 있으며 S기의 DNA 양을 갖지만 증식하지 않은 세포를 구별해낼 수 있는 반면14) S기 이외의 cycling cell (G1, G2, M) 을 검색하지 못하기 때문에 일정 세포군의 성장분획을 낮게 측정하는 경향이 있다. 또한 이들 방법으로는 G0기를 구별해 낼 수 없다. GM- CSF를 이용한 세포동력학적 동원을 통해 급성 골수성백혈병의 치료에 사용되는 S기 특이성 약물의 세포 살상능을 높이기 위해서는 S기의 증가가 G0기의 감소에서 Fig . 4 . Effe ct of GM- CS F on ce ll cycle fra ction dete rmine d
by Ki- 67/PI in mye loid le uke mic ce lls .
G0% G1% G0/G1% S% G2/M% Ki- 67%
No. Case C* GM† C GM C GM C GM C GM C GM
1 2 3 4 5 6 7 8 9
53.6 60.6 79.3 75.4 92.9 89.4 87.8 87.3 16.9
20.3 42.2 58.5 78.3 77.3 67.3 89.6 82.7 6.3
23.1 27.3 4.5 2.7 2.1 1.3 4.1 5.2 76.6
35.5 39.6 14.8 2.2 8.8 6.2 6.4 8.6 79.0
76.6 88.0 83.7 78.1 95.0 90.7 91.9 92.5 93.4
55.7 81.8 73.4 80.4 86.1 73.5 96.0 91.3 85.3
16.2 8.7 11.1 16.0 3.5 5.3 8.0 5.2 3.3
30.9 13.9 19.0 13.6 10.3 18.8 3.7 5.7 7.3
7.2 3.4 5.1 5.9 1.5 4.1 0.1 2.3 3.3
13.3 4.3 7.6 6.0 3.6 7.7 0.3 3.0 7.4
43.6 38.2 14.2 13.4 5.5 3.9 8.4 9.8 82.8
74.0 58.5 36.5 11.8 9.4 22.1 8.7 13.8 93.5 Mean
SD‡
71.5 24.5
58.1 29.2
16.3 24.6
22.3 25.1
87.8 6.8
80.4 11.9
8.6 4.9
13.7 8.4
3.7 2.2
5.9 3.7
24.4 26.1
36.5 31.6
*control,†GM- CSF recruitment,‡standard deviation
Fig . 3 . Effect of GM- CS F on ce ll cycle fration dete rmine d by BrdU/P I in mye loid le uke mic ce lls .
기인하여야 한다. 따라서 G0기의 분획을 아는 것이 중요하 다. G0기를 구하기 위해 가장 흔히 사용되는 방법은 DNA 양과 함께 RNA 양을 측정하는 것인데 이를 위해 acridine orange가 대표적으로 사용되고 있다. 그러나 acridine orange는 적절한 농도의 선택이 어렵고 자료의 표준화가 힘들며 유세포 분석기의 튜브에 부착하는 문제가 있고 돌 연변이원 (mutagen)이기에 취급에 각별한 주의를 요한다.
Ki- 67 단클론항체는 원래 Reed- Sternberg cell에 대해 만 들어진 항체로 휴지기의 G0 세포에는 표현되지 않으면서 증식하는 세포에만 표현되는 핵항원을 인지한다.15) 항원은 분자량이 345, 000과 395, 000인 두개의 폴리펩티드사슬 (polypeptide chain) 로 이루어진 비히스톤 단백질 (non- histone pr otein)이며,18) 10번 염색체에 위치한 유전자에 의해 그 표현이 조절되는 것으로 알려져 있다.19) 따라서 Ki- 67 항체는 조직면역학적으로 혹은 유세포분석을 통해 종양의 성장분획을 구하는 방법으로 그 사용이 증가하고 있다. 본 연구에서는 Ki-67 항체와 DNA 측정을 통해 성장 분획을 구함과 동시에 세포주기의 G0, G1, S, G2/ M기의 분획을 각기 구할 수 있었다. 결과에서 볼 수 있듯이 G0와 G1기의 분획이 증례에 따라 각기 매우 다양한 값을 갖고 있어 G0를 직접 측정하지 않고는 G0/ G1기에서 G0기를 단 순 추정하는 것은 불가능하였다.
본 연구 결과를 보면 2례에서 Ki-67 표지지표가 S기 분 획보다 낮음을 알 수 있다. Ki-67 표지지표와 증식과 관련 된 다른 측정값 사이에 일부 불일치가 있음이 보고되어 있 다. DNA 염색을 이용한 S기 분획,20 , 2 1) 3H-thymidine uptake,2 2) BrdU uptake2 3) 등과 같은 증식 표지자에 비해 Ki- 67 양성 세포의 비율이 낮음이 언급되고 있다. 이러한 불일치에 대해 여러 기전이 제시되고 있는데 영양분 결 핍,20 ) 비 (非) S기 세포에 의한 3H-thymidine 혹은 BrdU uptake,2 4) quiescent S기 세포,2 5) 분석 과정에 죽은 세포 의 포함 가능성 등이다. 그러나 본 실험에서 병행한 BrdU 결과는 상기의 가능성을 배제시킨다. Van Bockstaele 등2 6) 은 정상 골수에서 Ki-67이 낮게 표현되고 있는 것을 관찰 하고 이는 소수의 증식 분획은 Ki-67 양성이지만 골수의 대부분을 구성하는 분화 분획이 Ki-67 음성으로 종양세포 나 배양세포와는 다른 양상을 보고하였다. Ito 등2 7)은 소아 급성백혈병에서 Ki-67 표지지표와 S기 분획사이의 일부 불 일치에 대해 Ki-67 음성인 S, G2, M기 세포의 존재 가능 성을 제시하고 있다. 따라서 환자에서 얻은 백혈병세포에 서도 DNA 양이 2n 이상이면서 Ki-67 음성 세포인 별개의 세포군이 있을 가능성이 있다.
Ki- 67 항체의 유세포 분석을 위해서는 세포의 고정과 여 러 번의 세척을 필요로 하는 방법이 흔히 사용되었다.
DNA와 Ki- 67 항원을 함께 분석하는 방법으로 acetone 고
정,20 , 2 8) ethanol 고정,2 9) 그리고 formaldehyde, deter-
gent, ethanol, citrate로 핵부유액 (nuclear suspension) 을 이용하는 방법30 ) 등이 있었다. 그러나 본 연구에서는 비고 정 핵부유액 (unfixed nuclear suspension)을 세척 없이 염 색하는 새로운 매우 간편한 방법을 사용하여 불과 1시간 내 에 염색을 마칠 수 있었다.3 1) BrdU/ PI 염색 방법이 먼저 BrdU와 배양을 한 후 하룻밤 동안 고정을 하고 anti- BrdU 와의 반응전에 DNA 변성을 필요로 하는 등 복잡한 과정을 거치는 것과 큰 대조가 된다. 따라서 Ki-67/ PI 염색은 민 감하고 간편하게 성장분획을 신속하게 구하는 방법이며 G0 기를 포함한 세포주기 분석에 유용한 방법이라 하겠다.
요 약
배 경 : 유세포분석을 통한 세포주기 분석은 DNA양을 측정하여 G0/ G1, S, G2/ M기를 구별하며, bromode- oxyuridine (BrdU) 표지법으로는 활발히 DNA를 합성하 는 분획과 DNA 합성 속도를 측정할 수 있다. 그러나 이러 한 방법으로는 휴지기의 G0 분획과 G1 분획이 구분되지 못하는 단점이 있다. 활발히 분열하는 세포는 여러 가지 특 이한 단백질을 생성하는데 Ki-67 단클론항체는 이러한 단 백질중 휴지기 세포에는 존재하지 않고 cycling cell에만 존 재하는 증식과 연관된 핵항원을 인지한다. 본 연구에서는 Ki- 67 단클론항체와 DNA에 대한 형광염료인 pr opidium iodide (PI) 를 사용하여 휴지기의 세포 분획과 증식기의 세 포 분획을 구분할 수 있는지를 분석하고 GM- CSF가 급성 골수성 백혈병 세포의 세포주기에 미치는 효과를 관찰함으 로써 세포주기분석에 있어 Ki-67 단클론항체의 유용성을 알아보고자 하였다.
방 법 : 급성골수성백혈병 환자 9명의 말초 혈액 혹은 골 수로부터 모세포를 분리한 후 각각 대조군과 GM- CSF를 10ng/ mL의 농도로 첨가한 군으로 나눠 48시간 동안 배양 하였다. 이후 BrdU/ PI 염색과 Ki-67/ PI 염색을 각기 시행 하고 유세포분석기를 이용해 세포주기를 분석하였다.
결 과 : 대조 세포군에서 BrdU/ PI 염색과 Ki-67/ PI 염 색에 의한 세포주기 분석은 서로 유사한 결과를 보였다.
BrdU/ PI 염색으로 G0/ G1, S, G2/ M기의 평균치는 각각 84. 6%, 10. 9%, 4. 5%를 보였고, Ki- 67/ PI 염색으로는 각각 87. 8%, 8. 6%, 3. 7%를 보였다. Ki-67/ PI 염색에 의해서는 G0/ G1기를 G0와 G1기로 나눌 수 있었고 평균치 는 각각 71. 5%와 16. 3%였다. GM-CSF로 48시간 동안 배양한 세포군에서 BrdU/ PI 염색으로 S기 분획의 평균치 가 10. 9%에서 16. 2%로 유의하게 상승한 반면 (P=0. 01) ,
G1기에서 유래함을 알 수 있었다. Ki- 67/ PI 염색으로는 S 기 분획의 평균치가 8. 6%에서 13. 7%로 유의하게 상승하 였는데 (P=0. 05) G0기는 71. 5%에서 58. 1%로 감소한 반 면 (P=0. 02) , G1기는 16. 3%에서 22. 3%로 증가하여 (P=
0. 01) GM- CSF가 백혈병세포의 G0 분획을 동원하여 S기 를 증가시킴을 보여 주었다. 이때 Ki-67 표지지표는 24. 4
%에서 36. 5%로 유의하게 상승하였다 (P=0. 01) .
결 론 : 급성골수성백혈병 세포에서 Ki- 67 단클론항체와 PI를 이용한 세포주기 분석 방법은 신속하고 간편한 방법으 로 BrdU/ PI 염색법과 비교해 성장분획을 구하는데 있어서 간편하고, 휴지기의 G0 분획을 구하는데 특히 유용하였다.
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