Volume 15, Number 1, June, 2012
※ 통신저자: 박 대 현
부산시 부산진구 개금동 633-165 인제대학교 의과대학 부산백병원 정형외과
TEL: 051) 890-6129 FAX: 051) 892-6619 E-mail: [email protected] 접수일: 2012년 4월 4일, 게재확정일: 2012년 6월 10일
골조직 재생을 위한 지지체 제작과 중간엽 줄기세포의 분화에 관한 연구
인제대학교 의과대학 부산백병원 정형외과학교실, 인제대학교 의용공학과1
안기찬∙신정욱1∙김윤준∙정대원∙박대현∙김동민
= Abstract =
Fabrication of a Scaffold for Bone Regeneration and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells
Ki-Chan An, M.D., Jung-Wook Shin, M.D.1, Yoon-Jun Kim, M.D., Dae-Won Jung, M.D., Dae-Hyun Park, M.D., Dong-Min Kim, M.D.
Department of Orthopedic Surgery, College of Medicine, University of Inje, Busan Paik Hospital, Busan, Korea Department of BioMedical Engineering, College of Biomedical, University of Inje, ,Kimhae, Korea1
Purpose: This in-vitro study aimed to confirm the clinical potential of a newly suggested bone substitute fabricated by a bio-plotting system.
Materials and Methods: A 3-dimensional, PCL (polycaprolactone)-based bone substitute was fabricated by a bio-plotting system, which enables us to control the shape and porosity. Mesenchymal stem cells(MSCs) from a New Zealand white rabbits were seeded to the bone substitute. Through 2-week experiment, morpholog- ical and various biological responses were assessed depending on the use of osteogenic media and/or mechani- cal stimuli.
Results: The viability of cells was confirmed. Other findings in relation to proliferation and differentiation were also confirmed to be biocompatible. Specifically, the activity of ALP was increased in the groups using osteogenic media along the time. And the expressions collagen type I was more affected by intermittent hydro- static pressure rather than by osteogenic media. But those of Cbfa-1 was affected by osteogenic media and mechanical stimuli, as well.
Conclusion: The potential of a newly fabricated and suggested material was confirmed. However, further long term and animal study are recommanded for the clinical application.
Key Words : Mesenchymal stem cells, Intermittent hydrostatic pressure, Microenvironment, Physical stim- uli, Osteogenesis, Bone regeneration
서 론
조직공학 연구에서 의미 있는 결과를 얻기 위해 서는 세포, 지지체, 그리고 다양한 생물학, 생화 학적 인자의 조화를 필요로 한다. 특히, 골 관련 조직공학에서는 성체줄기세포, 생물학적 안정성이 인정된 폴리머 기반의 지지체, 그리고 다양한 생 화학적 인자에 대한 연구가 주류를 이루고 있다.
그 중 생화학적 인자에 대한 연구의 목적은 모사 된 생체환경 제공에 있으며, 최근에는 이와 더불 어 다양한 물리적, 기계적 자극에 대한 연구가 주 요 변수로 인식되고 있다1-3).
일반적으로 성체줄기세포의 경우에는 중간엽 줄 기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)가 주 로 사용되고 있다. 중간엽 줄기세포는 자가 재생 능을 가지며 특별한 모양 및 기능을 보유한 고유 세포로 분화할 수 있는 다분화능을 지닌 성체줄기 세포 중의 하나이다4). 또한 배아줄기세포와 달리 성숙한 개체로부터 세포를 얻음으로써 윤리적 문 제가 없으며, 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 T 세포의 활동을 억제시켜 면역 반응을 거의 유 발하지 않아 다른 줄기세포에 비해 세포치료제로 서의 이용가능성이 확대되고 있다5). 최근 다양한 인자조절을 통해 중간엽 줄기세포의 분화를 조절 하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 비 슷한 방법에도 견해 차이가 보이고 있어 아직 많 은 연구가 필요한 실정이다. 이러한 견해의 차이 는 세포를 체외 배양을 위해 체내에서 분리할 때 세포는 가지고 있던 많은 정보들을 잃게 되며, 어 떠한 정보를 잃었는지 알지 못하고 체외 배양을 하게 되기 때문인 것으로 생각되고 있으며, 임상 적용을 위한 체외 배양의 의미를 살리기 위해서 실제 체내와 유사한 미세 환경 재현은 필수적이 며, 최근 여러 논문에서 그 중요성이 언급되고 있 다1-3). 일찍이 미세 환경 중의 하나인 기계적인 자 극에 의해 세포의 형태학적 변화가 나타나며, 세 포 내 생화학적 신호로 변환되어 세포의 성장과 분화, 세포의 특성 유지에 영향을 미칠 수 있음이 보고된 바 있다6). 특히 인체 내 골조직의 경우, 일상생활을 통하여 유발되는 지속적인 압축자극을 받고 있는 것으로 알려져 있다. 골 내 물리적 환 경을 효과적으로 재현하기 위하여 장비구성이 간
단하고 자극이 균일하며, 자극의 크기 및 빈도 조 절이 비교적 쉬운 것으로 알려져 있는 정수압 (hydrostatic pressure)을 세포에 부가하는 방 식을 사용하였다. 본 연구에서는 정수압을 가하는 방법 중 자극의 빈도를 조절하여 부가하는 간헐적 정수압(intermittent hydrostatic pressure)법 을 적용하였다. 간헐적 정수압의 경우, 많은 연구 에서 다양한 빈도에 대한 연구가 수행되어 왔는데 세포의 휴지기 길이와 간헐적 정수압의 주기에 대 해 연구한 Donahue 등7)와 Hansen 등8)의 자극 지속시간 조건을 참고하여 2분으로 결정하였으며, 휴지기 시간은 칼슘 이온 응답을 통해 자극의 전 달이 가장 효과적이라고 판단되는 15분으로 정하 였다7,9).
이와 같은 세포 주변의 미세 환경이 효과적으로 전달가능한 지지체 제작을 위한 생물학적 안정성 이 수반된 폴리머로는 PLGA, PCL 등이 소개되 고 있다. 이러한 3차원 지지체를 제작하기 위한 상용화된 방법에는 전기방사, 염침출법, 가스발포 법, 동결건조법 등 여러 가지 방법이 있다10). 그 러나 기존의 방법들은 pore의 크기가 작고, 조절 어려우며 상호연결성(interconnectivitiy)이 낮 아 다공성의 조절이 어렵다는 단점이 있다. 성공 적인 임상적 결과를 위해서는 지지체 내부로 혈관 및 조직 등이 침투할 수 있도록 충분한 다공성 및 기공의 상호 연결성 확보가 중요한데 이러한 지지 체 제작법의 단점은 상용화 제품 생산을 위한 규 격화가 어려워 임상 적용을 위한 생산성에 한계점 으로 작용할 수 있으며, 이를 극복하기 위한 방법 으로서 최근에는 쾌속조형기술법이 사용되고 있 다. 쾌속조형기술법은 폴리머의 종류에 따라 사용 제약이 따르기는 하지만 폴리머 가열온도, 이동속 도, 주사기 바늘의 굵기 등에 의해 폴리머 가닥 (strand)의 굵기가 조절가능하며, pore의 size 조절이 가능하여 일정하게 크기의 pore 및 가닥, 상호 연결성을 조절할 수 있으며, 폴리머를 녹이 기 위해 열을 사용함으로써 인체에 유해할 수 있 는 유기용매의 사용을 배제한다는 장점이 있다.
따라서 본 연구에서는 임상 적용을 위한 지지체의 생산성, 그리고 품질의 규격화에 초점을 맞추어 공학에서 사용되는 조형기술을 응용하여 새로운 형태의 골 수복용 지지체를 제작하였다. 또한 기
존의 생화학적 인자와 더불어 기계적 자극에 대한 반응을 체외 실험을 통해 분석하여 본 연구에서 제시되는 지지체의 가능성을 임상 적용에의 가능 성을 검토하고자 하였다.
연구 대상 및 방법 PCL 지지체의 제작
지지체 제작을 위하여 준비된 재료를 자체 주문 제작된 Bioplotting system을 이용하였다(Fig.
1). 지지체 제작에 사용된 polycaprolactone (PCL, MW. 50,000, Ployscience, Inc., Warrington, PA 18976, USA)은 상용소재를 구입하여 사용하였다. Bioplotting system의 heating cylinder에 PCL chip을 넣고 105℃로 가열하여 액상으로 만든 뒤 압력 펌프를 이용하여 압출하는 형식으로 지지체를 제작하였다. 지지체 의 전체 크기는 30×30×5 mm3, 지지체의 섬유 가닥의 굵기는 약 350 μm로 제작하였으며 섬유 가닥과 가닥 사이(기공의 크기)는 0.5 mm로 제 작되었다. 제작된 지지체는 멸균을 위하여 70%
EtOH에 담그고 12시간 동안 4℃에 보관하였다.
그 후, EtOH을 제거하고 완전 건조 후 UV light에 4시간 동안 노출시켜 멸균하였다. 멸균된 지지체는 pre-wetting을 위하여 배양 배지를 넣 고 37℃ 인큐베이터에서 3일 동안 보관하였다.
지지체에 세포를 파종하기 한 시간 전, 세포의 부 착력을 향상시키기 위하여 fibronectin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 10 ul/ml의 농도로 코팅하여 사용하였다.
중간엽 줄기세포의 배양 및 파종
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) 를 이용하여 CD105+, CD166+, CD29+, CD44+, CD14-, CD34-, CD45-로 확인된 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells) (Lonza, Walkersville, MD, USA)를 구입하여 사용하였다. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-low glucose (DMEM-LG, Hyclone, USA), 10% FBS (fetal bovine serum)와 항생제(1% penicillin/strepto- mycin)를 첨가한 기본배지로 배양하고 passage
#5를 실험에 사용하였다. 배양 기간 동안 배지 교 환은 3일에 1번씩 실시하였다.
파종될 세포의 소실을 줄이기 위해 바닥면이 코 팅되지 않은 6-well plate에 지지체를 배열하였 으며, 중간엽 줄기세포는 1×105 cells/ml의 농도 로 지지체에 파종하였다. 파종 4시간 후, 세포가 파종된 지지체를 새로운 well-plate에 옮겨 담고 DMEM-LG, 10% FBS가 포함된 성장 배지를 첨가하였다. 파종 1일 후부터 자극의 유무와 성장 인자가 포함된 배지 사용의 유무에 따라 실험 군을
Fig. 1. Bioplotting system showing (A) auto CAD control panel. (B) compressor. (C) temperature controller. (D) pressure controller.
A
C D
B
나누어 Table 1과 같이 분류하였다. 분화배지를 사용하지 않는 GX-- 그룹은 기본 성장 배지에서 세포를 배양하였으며, 분화배지를 사용하는 GO-- 그룹은 DMEM-LG, 10% FBS에 50 μg/mL ascorbate-2-phosphate, 10 nmol/L dexam- ethasone과 10 mmol/L �-glycerolphos- phate가 포함된 분화배지에서 배양하였다.
압축 자극을 위한 바이오리액터 시스템
지지체에 부착된 세포에 간헐적 정수압을 가하 기 위해 상용화된 bioreactor system (TS-MBI
100, Taesan Co. Ltd., Korea)을 이용하였다 (Fig. 2). PCL 지지체 위에 MSCs를 분주하여 이틀 동안 안정화 시킨 후, 자극이 가해지도록 하 였다. 자극 가할 시에, well plate를 자체 제작한 압력 체임버에 넣은 후 37℃, 5% CO2 인큐베이 터 내에서 간헐적 정수압을 가하였다. 간헐적 정 수압은 0.2 MPa로 2분간 압력을 가하고 15분간 휴식기를 가지는 형태로 하루에 4시간, 7일 동안 자극을 가하였다(Fig. 3).
전자주사현미경을 이용한 관찰
Bioplotting system을 이용하여 제작된 지지 체의 표면과 지지체에 안착한 MSCs의 형상 및 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM) 형 성 정도를 확인하기 위하여 전계방출주사전자현미 경(Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM, Hitachi Ltd,.
Tokyo, Japan)을 이용하였다. 중간엽 줄기세포 Fig. 2. Bioreactor system was used for cell stimulation (A)
Gross view showing frontal view of bioreactor. (B) Inner part of bioreactor system showing control box, (C) Inner part of bioreactor system showing pressure chamber.
B
A
C
Fig. 3. Time-table for mechanical stimuli and harvesting.
Table 1. Group classification.
Stimuli (S)
무 (X) 유 (O) 분화배지 (G) 무 (X) GXSX GXSO 유 (O) GOSX GOSO
가 부착된 지지체에서 배지를 제거하고 Dulbec- co’s phosphate buffered saline (D-PBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이 용하여 2회 세척하고, 4% formalin solution (Junsei, Tokyo, Japan)을 이용하여 30분간 고정을 하였다. D-PBS를 이용하여 5분간 2회 세 척 과정을 거친 뒤 수분 제거를 위하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%의 에탄올에 순차 적으로 각각 2분씩 처리하였다. 처리된 시편은 desiccator에서 건조과정을 거쳐 백금 코팅 후 FE-SEM 촬영을 실시하였다.
세포 생존률 분석
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 이용하여 지지체에 파종된 중간엽 줄기세포에 staining을 실시하였다. 중간엽 줄기세포가 부착 된 지지체에서 배지를 제거한 후 D-PBS를 이용 하여 3회 세척 후, 암실에서 live/dead reagent (2 uM calcein AM and 4 uM EthD-1 in D- PBS) 200 ㎕를 시편에 첨가하고 30분간 반응시 켰다. 염색된 시편은 공초점 형광현미경(Laser confocal microscopy 510 META, Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 영상을 획 득하였다. 이 때, calcein, EthD-1의 excita- tion/emission은 각각 494/517 nm와 528/617 nm로 설정하고 촬영하였다.
세포의 증식 평가
세포의 증식을 관찰하기 위해 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits (Mol- ecular Probes, USA)를 사용하여 세포 내 DNA 양을 관찰하였다. 0.1% Triton X-100을 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시켜 세포를 lysis 시킨 후, sample 100 ㎕에 PicoGreen reagent 를 100 ㎕를 첨가하여 96-well plate에서 빛을 차단한 채 상온에서 5분간 반응시켰다. 각 sam- ple은 Multi-Detection Microplate Reader (SynergyTM HT; Bio-Tek, Winooski, USA)를 이용하여 480/520 nm에서 형광도를 측 정하였다.
Alkaline phosphate의 활성도 측정
Alkaline phosphate (ALP) 활성도는 골아세 포로의 분화를 평가하는 지표로서, ALP 정량 키 트(104-LL, Sigma, MO, USA)를 사용하여 측 정하였다. 방법은 DNA 측정 시 세포를 반응시키 는 방법과 동일하게 0.1% Triton X-100을 첨가 하여 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 세포 추출 액과 alkaline buffer solution과 phosphatase substrate solution을 교반하여 37℃에서 30분 간 반응시켰다. 이를 1 N의 수산화나트륨으로 반 응을 중단시킨 다음 405 nm에서 흡광도를 측정 하여 유출액 내의 ALP 활성도를 계산하였다. 측 정된 값은 DNA 값으로 나누어 정량화 하였다.
Table 2. Primers for real-time PCR.
Target Name Accession Number Primer Sequence (5-3)
Beta-actin NM001101.3 left : cccaaagttcacaatgtggc
right : gatggcaagggacttcctgt
Collagen type I NM 000088.3 left : ctggcgagagaggtgaacaa
right : aggtctccaggaacaccctg Core binding factor alpha 1 (Cbfa-1) AH 005498.1 left : acccacgaatgcactatcca
right : ctggtctggaagggtccact
Osteonectin BC 008011.1 left : ttcaaacttttgggagcacg
right : cagtccctagagcccctgag
Real-time polymerase chain reaction (RT- PCR)
모든 실험군의 RNA는 상용화된 RNeasy Mini Kit (Quigen, Hilden, Germany)를 사용 하였다. 역전사 반응은 상품화된 키트인 High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 제조사의 지시대 로 cDNA를 합성하였다. Real-time PCR은 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, 모든 PCR 결과는 beta-actin으로 정량화하였다.
모든 PCR 반응은 StepOneTM (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였으며, 분석하고자 하는 유전자들은 beta-actin과 osteogenic marker인 collagen type I, core binding factor alpha 1(Cbfa-1), osteonectin
으로 primer의 서열은 Table 2와 같다.
통계적 분석
모든 통계분석은 범용 통계 프로그램인 SPSS (version 12.0K, SPSS Inc. USA)를 이용하여 one-way ANOVA test를 실시하였으며 다중분 산 비교는 least significant difference (LSD) 방식을 선택하였다. 모든 데이터는 평균±표준편 차로 표시하였으며, 유의수준은 p＜0.05를 기준 으로 통계적 유의수준을 판단하였다.
결 과 PCL 지지체의 형태
Bio-plotting 시스템을 이용하여 제작된 지지 체의 모습은 Fig. 4와 같다. 균일한 모양의 strand와 pore 제작이 가능하였다. Fig. 5는 세 포가 지지체에 부착된 양상을 관찰하기 위해 SEM으로 촬영한 결과이다. 파종된 세포들이 지 지체 표면에 세포가 잘 안착되어 있으며, 시간이 지날수록 표면을 벗어나 기공을 채우려고 하는 것 이 관찰되었다.
Live/Dead cell의 염색
세 포 의 viability를 관 찰 하 기 위 하 여 Live/Dead cell staining을 실시하였다(Fig.
6). 세포 파종 후 초기에는 60% 정도의 cell viability를 보이지만 시간이 지날수록 주변의 환 Fig. 4. Plotted scaffolds was seen made by bio-plotter system. (A) Plotted scaffolds showing side
view. (B) Plotted scaffolds showing top view.
A B
Fig. 5. SEM images along the cultivation time (fluores- cent staning x50).
경에 적응하여 7일 이후부터는 대체적으로 80- 90% 의 cell viability를 유지하였다.
파종된 cell의 증식
파종된 세포는 시간이 지남에 따라 증식이 증가 하는 것으로 보였으나 배양 7일까지는 모든 그룹 에서 유의한 차이를 가지는 증식은 보이지 않았다 (Fig. 7). 그러나 배양 10일과 14일 후에는 분화 배지와 자극이 모두 가해진 그룹(GOSO)에서 분 화배지와 자극 모두 가해지지 않은 그룹 (GXSX)에 비해 통계적으로 유의한 증식 차이를 보였다.
ALP 활성도
중간엽 줄기세포를 배양한 모든 실험군에서 ALP 활성이 측정되었다(Fig. 8). 배양기간 동안 분화배지를 사용하지 않은 그룹에서는 자극의 유 무에 관계없이 ALP 활성도가 1일째에 비해 감소 하여 배양기간 동안 거의 그 값을 유지하는 경향 을 보였으나, 분화배지를 사용하여 배양한 경우에 는 자극의 유무에 관계없이 시간이 지날수록 증가 하는 경향을 보였다. 특히, 배양 10일째(자극이 끝난 후 1일째)에 비해 배양 14일째(자극이 끝난 후 5일째)에 유의하게 증가하는 것이 관찰되었다 (p＜0.05).
Fig. 6. Live & Dead staining showing cell viability. (A) Cell viability showing at low magnification.
(fluorescent staning, ×100) (B) Cell viability showing at high magnification. (fluorescent staning, ×200).
A B
Fig. 7. DNA assay showing no significant differences of
proliferation of seeded cell. Fig. 8. ALP activity were measured at all MSCs groups.
전체적으로, 배양배지 사용 유/무에 따른 ALP 결과를 비교해보면 배양 7일째를 포함한 10일, 14일 모두 배양배지를 사용한 그룹(GOSX, GOSO)이 사용하지 않은 그룹(GXSX, GXSO) 에 비해 유의하게 증가함을 보였다(p＜0.05). 그 러나 자극이 없는 그룹(GOSX)과 분화배지와 자 극이 모두 가해진 그룹(GOSO)을 비교한 결과 자 극에 대한 ALP activity에는 유의한 차이가 없 음을 확인하였다.
골 분화 marker의 유전자 발현
Real-time PCR을 통하여 각 그룹별로 시간이 지남에 따라 골 분화 marker들의 발현량을 살펴 보았다(Fig. 9). Collagen type I의 경우 배양 7일째와 10일째에 분화배지 없이 자극이 가해진 그룹에서 그렇지 않은 그룹들에 비해 발현량이 높 게 유지되었다. 그러나 비교적 자극의 효과가 감 소된 14일째에는 그 발현이 감소되는 것으로 보 아 자극이 collagen type I의 발현에 영향을 미 치는 것으로 보인다. 그러나 Cbfa-1의 경우 자극 의 효과가 비교적 지속되는 기간에는 그 발현이 비교적 억제되어 있다가 자극의 효과가 감소했을 14일째에는 분화 배지 없이 자극을 가해준 그룹 (GXSO)과 자극은 가해주지 않고 분화배지만을 가해준 그룹(GOSX)에서 다소 증가하는 것으로
나타났다. 그러나 자극과 분화배지 모두를 가해주 지 않거나 가해준 그룹에서는 발현 정도가 감소하 거나 미미한 변화를 나타내었다.
Osteonectin의 경우에는 분화배지를 사용하지 않은 그룹에서 소량의 증감 변화가 관찰되었으나 분화배지를 사용한 그룹에서는 분화배지를 사용하 지 않은 그룹에 비해 비교적 적은 발현을 나타내 었다.
고 찰
생체내의 세포는 인간의 일상적인 움직임 및 자 가 운동 등으로 다양한 물리적 환경에 노출되어 있다. 본 연구에서는 최근 세포 및 조직관련 연구 에서 생화학적 인자와 더불어 물리적 인자도 중요 한 인자로 간주되고 있는 것에 기인하여 두 가지 인자 모두를 사용하여 골세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 먼저 물리적 환경 중 형태학적 환경의 조성을 위하여 생체적합성 및 기 계적 강도가 뛰어난 생분해성 고분자인 PCL을 사 용하여 지지체를 제작하였으며, 이때 기공의 크기 는 세포의 증식 및 ECM형성이 가장 활발하게 이 루어지는 크기인 500 μm가 되도록 제작하였다11). 그 다음, 생화학적 환경 인자인 분화 배지와 물리 적 환경 인자인 간헐적 정수압을 가하여 그 두 가 지 복합적인 요인이 골아세포로의 분화에 미치는
Fig. 9. Gene expressions were seen individual osteogenic markers. (A) Collagen type I was increased by intermittent hydrostat- ic pressure than osteogenic media. (B) Cbfa-1 was affected by osteogenic media and mechanical stimuli. (C) Osteonectin was expressed lower level at osteogenic media group.
A
C
B
영향을 살펴보고자 하였다. 그 결과, 분화 배지와 물리적 자극의 사용 유무에 의해 세포응답의 차이 가 나타났는데, ALP의 경우에는 물리적 자극보 다는 분화배지의 영향을 크게 받고 있는 것으로 나타났다. 본 연구와 유사한 분화배지를 사용한 Liu 등12)의 연구와 비슷한 결과로서 ALP의 값이 증가하는 시점도 유사하게 나타났다. 다만, 250 kPa 이상의 높은 압력에서 ALP의 활성 다소 감 소할 수 있다는 Hu 등13)의 견해와는 조금 다른 결과로서 자극의 유무가 ALP의 활성에 유의한 영향을 주지는 못하였다. 이는 자극 GOSO 그룹 의 경우 자극을 주기 전 2일 동안 세포 상태를 안 정화하는 단계에서 분화배지에서 배양하여 전처리 와 비슷한 단계를 거침으로써 그 효과가 유지는 것으로 보인다. Collagen type I의 경우에는 물 리적 자극만을 가해주었을 때(GXSO) 발현이 크 게 증가하는 것이 관찰되었다. Kearney 등14)은 골아세포의 분화를 위해 인장자극으로 collagen type I의 발현을 유도하였으나 본 연구 결과에서 처럼 압축 자극에도 영향을 받는 것으로 나타났 다. Cbfa-1의 경우에는 물리적 자극이나 분화배 지를 단독으로 사용한 그룹(GXSO, GOSX)에서 만 그 발현이 증가하는 것으로 나타났다. Cbfa-1 는 다른 종류의 물리적 자극인 인장과 전단응력에 도 영향을 받는 것으로 보고된 바 있는데, 정수압 의 자극에도 그 발현이 영향을 받는 것으로 생각
된다15-19). 본 연구에서는 생화학적 자극과 물리적
자극을 함께 사용하여 줄기세포의 골 아세포로의 분화에 상승작용을 기대하였으나 두 가지 자극을 모두 가해주었을 때 증식을 제외한 분화에는 긍정 적인 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 그 러나 간헐적 정수압과 분화 배지만을 각각 사용한 그룹에서는 줄기세포의 분화에 영향을 주는 것으 로 보인다. 각각의 미세 환경 조건이 골 아세포로 의 분화에 효과가 있는 것으로 나타났으나 자극의 상승효과가 나타나기 위해서는 배양환경과 물리적 자극의 크기, 주기, 자극 기간 등 다양한 조건에 서의 자극들이 적용된 연구가 진행되어야 할 것으 로 사료된다.
결 론
본 연구에서는 간헐적 정수압 및 골 분화 배지 를 사용하여 중간엽 줄기세포의 골 분화를 유도하 였으며, 이 두 인자 간의 유전자 발현을 비교 분 석한 결과 분화 초기에는 분화 배지를 사용한 그 룹 중 자극을 사용한 그룹과 사용하지 않은 그룹 이 차이가 없었으나 시간이 지날수록 자극과 골 분화 배지를 함께 사용한 그룹에서 골 분화 성능 이 증가함이 관찰되었다. 이것으로 보아 물리적 자극이 골 분화능을 증가시켜 주며 세포가 존재하 는 인체 내 환경의 복합적인 재현이 세포의 분화 에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.
이상에서 본 실험 연구를 통해 새로이 제작된 골 수복재의 가능성을 확인할 수 있었으며, 임상 적용을 위해는 장기간의 동물실험을 통한 검증이 필요할 것으로 사료된다.
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