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책임저자: 최유신, 서울시 동작구 흑석동 224-1
156-755, 중앙대학교병원 외과 Tel: 02-6299-1545, Fax: 02-824-7869 E-mail: [email protected]
접수일：2008년 6월 17일, 게재승인일：2008년 8월 27일 이 논문은 2007년도 중앙대학교 학술연구비 지원에 의한 것임.
갑상샘 소포샘종과 소포암에서 세포주기 관련단백과 세포자멸사 관련단백 발현의 의의
중앙대학교 의과대학 외과학교실
황준영ㆍ최유신ㆍ박성준
Significance of Expression of Cell Cycle Related Proteins and Apoptosis Related Proteins in Follicular Adenoma and Follicular Carcinoma of Thyroid
Jun Young Hwang, M.D., Yoo Shin Choi, M.D., Sung Jun Park, M.D.
Department of Surgery, Chung-Ang University School of Medicine, Seoul, Korea
Purpose: To explore the role of cell cycle regulators and apoptosis regulators in carcinogenesis of thyroid, the
expression of cell cycle related proteins (cyclin D1, Ki-67) and apoptosis related proteins (survivin, caspase 3, bcl-2, p53) were investigated in follicular adenoma and follicular carcinoma of thyroid.Methods: The following formalin-fixed paraffin embedded surgical specimens were immunohistochemically stained
by avidin-biotin complex method for cyclin D1, Ki-67, survivin, caspase 3, bcl-2, p53; 15 cases of follicular adenoma (FA), 31 cases of minimally invasive follicular carcinoma (MIFC) and 12 cases of widely invasive follicular carcinoma (WIFC).Results: The overexpression of six gene products in follicular neoplasms of thyroid was noted in varying frequency.
Among them, increased Ki-67, caspase 3 index and overexpression of bcl-2 were noted in statistically significant, widely invasive follicular carcinoma than that of follicular adenoma and minimally invasive follicular carcinoma.
Conclusion: These results suggest that the overexpression of Ki-67, caspase 3, bcl-2 appear to play an important
role during follicular carcinogenesis of thyroid. In addition, the overexpression of these proteins is related to the differentiation of MIFC and WIFC. However, further molecular genetic studies are required to determine the interrelationships between the expression of cell cycle related proteins and apoptosis related proteins. (J KoreanSurg Soc 2009;76:7-14)
Key Words: Cell cycle related proteins, Apoptosis related proteins, Follicular adenoma (FA), Minimally invasive fol-
licular carcinoma (MIFC), Widely invasive follicular carcinoma (WIFC)중심 단어: 세포주기 관련단백, 세포자멸사 관련단백, 소포샘종, 미소침습성소포암, 광범위침습성소포암
서 론
갑상샘암은 내분비암 중 가장 흔한 암이다. 이 종양의 발
생은 경부 초음파의 기술적 향상에 의한 조기진단뿐 아니 라 환경유해 및 내분비 교란물질에의 노출 등에 의해 증가 되고 있다.(1)
갑상샘에서 발생하는 암은 유두암과 소포암이 대부분을 차지하며, 연령이 가장 중요한 예후인자로 남자는 40세 이 전, 여자는 50세 이전이 좋은 예후를 보이고, 조직의 분화 도, 원격전이, 피막침윤, 종괴의 크기 등이 예후인자에 속한 다. 이 중 유두암은 종양세포 내 핵봉입체, 젖빛유리핵 등 세포학적 특성으로 쉽게 진단이 가능하지만, 소포암은 종
Fig. 1. Hematoxylin and eosin staining. (A) Thyroid follicular adenoma shows microfollicle, prominent nuclei, intact capsule (H&E stain, ×100).
(B) Thyroid minimally invasive follicular carcinoma shows mushroom pattern capsular invasion (H&E stain, ×100). (C) Thyroid widely invasive follicular carcinoma shows destructed capsule, aberrant cellular invasion (H&E stain, ×200).
양을 둘러싸고 있는 피막과 혈관 침윤을 관찰하여야만 소 포샘종(Follicular adenoma, FA)과 구별이 가능하며 종양세 포 자체만으로는 구별할 수 있는 특징적인 소견이 없다. 특 히, 소포암은 피막침윤이 국소적인 경우를 미소침습성소포 암(Minimally invasive follicular carcinoma, MIFC), 피막 전층 이 침윤되어 경계가 없어지고 혈관침윤이 있는 경우를 광범 위침습성소포암(Widely invasive follicular carcinoma, WIFC) 으로 구별하여 WIFC의 경우에는 반드시 수술 후 131I-방사 선 요오드 치료를 시행하지만, MIFC의 경우는 외과의에 따 라 치료에 이견이 있다. 또한, 수술 후 조직검사에서 FA나 MIFC로 진단되었던 환자에서도 수년 후에 뼈, 폐, 간 등에 전이되는 등 WIFC의 양상을 보이는 경우가 있어 양성과 악 성을 구별하고 악성도를 예측할 수 있는 표지인자에 대한 연구가 필요하다고 생각한다.
생물학적으로 양성종양에서 악성종양으로의 형질전환에 는 지속적이고 자율적인 세포증식과 사망회피가 동반되며 (Two-hit theory), 여기에는 종양세포 내 세포주기의 진행과 증식에 관여하는 신호전달체계 및 세포자멸사 조절에 이상 이 있기 때문으로 생각한다.
갑상샘 소포종양에서 생물학적 표지인자로 양성과 악성 을 구별하기 위한 많은 연구들이 이루어져 왔으나 세포주 기 및 세포자멸사 인자에 관한 연구는 부족한 실정이다. 이 에 본 연구에서는 수술적으로 절제한 갑상샘 소포종양에서 대표적 세포주기 관련단백인 cyclin D1, Ki-67과 더불어 세 포자멸사 관련단백인 survivin, caspase 3, bcl-2 그리고 p53에 대한 면역조직화학 염색을 실시하여 이들 단백의 발현이 FA와 MIFC 그리고 WIFC를 구별할 수 있는 인자로서 가치
가 있는지와 소포암의 경우 수술 후 치료방침 결정에 도움 을 줄 수 있는 지표가 되는지를 알아보고자 한다.
방 법
1) 대상 환자
1998년 3월부터 2007년 9월까지 중앙대학교 의료원에서 병리학적으로 진단된 갑상샘 소포종양 중 보관상태가 양호 한 58명의 파라핀 포매 조직을 대상으로 하였다. 이 가운데 FA가 15예, MIFC가 31예 그리고 WIFC가 12예이었다(Fig.
1).
2) 방법
(1) 면역조직화학 염색: 선택된 환자의 파라핀 포매조직을 4∼5μm 두께로 박절하여 코팅슬라이드에 부착시키고 자 일렌으로 탈 파라핀 과정을 거친 후(5분간 3회) 무수 알코 올, 90%, 75% 및 50% 에탄올에 각각 2분씩 처리하여 함수 시켰다. 그 후 내인성 과산화 효소의 활성을 억제하기 위해 0.3% hydrogen peroxide-methanol에 10분간 처리 후 증류수 로 세척한 다음 50 mM Tris 완충용액(TBS, pH 7.5)으로 수 세하였다. 그리고 비특이성 반응을 제거하기 위해 30분간 염소혈청으로 처리하고 여분의 용액을 제거한 다음 일차항 체인 cyclin D1 (mouse monoclonal, 1：100, MS-1203, Neomarker, USA), Ki-67 (mouse monoclonal, 1：100, MIB-1, Zymed, USA), survivin (mouse monoclonal, 1：100, clone ab-6, Lab vision, USA), caspase 3 (rabit polyclonal, 1：100, clone ab-4051, Abcam, USA), bcl-2 (mouse monoclonal, 1：
Fig. 2. Immunohistochemical staining. (A) Cyclin D1 in WIFC (IHC stain, ×200), (B) Ki-67 in WIFC (IHC stain, ×400), (C) Survivin in WIFC (IHC stain, ×200), (D) Caspase 3 in WIFC (IHC stain, ×400), (E) Bcl-2 in normal thyroid (A) and MIFC (B) (IHC stain, ×200), (F) p53 in WIFC (IHC stain, ×200).
100, Zymed, USA), p-53 (mouse monoclonal, 1：100, clone s-95, Lab vision, USA)을 실온에서 2시간 적용시켰다. 일차 항체 반응 후 TBS로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체(labelled streptavidin biotin kit, 1：300, Zymed, USA)에 20분간 적용 후, 통상적인 avidin-biotin complex (ABC)법으로 염색을 시행하였다. 발색제는 3-amino-9-ethyl carbazole (AEC)을 사용하고 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하여 글리세린으로 봉입한 다음 광학현미경(Olympus BX50, Japan)으로 관찰하였다(Fig. 2).
(2) 결과 판정: 연구 대상 모두를 한 명의 병리과 의사가 재검토한 후 맹검법으로 판독하였으며 cyclin D1은 전체 종 양세포 중 핵에, survivin, bcl-2는 세포질에 과립상으로 진하 게 갈색 염색된 세포의 수를 세어, 백분율로 표시한 뒤 10%
이상인 경우를 양성으로 판정하였다.(2) Ki-67과 caspase 3 은 저배율에서 염색이 잘된 부위 세 군데를 선택한 다음 고배율(×400)에서 종양세포 1,000개 이상을 세어 염색된 핵
의 수의 백분율로 표시하였다.(3) p53은 갑상샘 종양에서 발현율이 낮아 전체 종양세포 중 염색된 핵이 5% 이상인 경우를 양성으로 판정하였다.(4)
(3) 통계학적 분석: Cyclin D1, Ki-67, survivin, caspase 3, bcl-2, p53의 발현을 Window용 SPSS (version 12.0) 통계 프 로그램을 이용하여 Chi-square test와 Pearson's correlation test를 실시하고, P값이 0.05 이하일 때를 통계학적으로 유 의성이 있는 것으로 인정하였으며 평균을 구할 수 있는 Ki-67과 caspase 3은 일원배치 분산분석(ANOVA)을 시행하 여 각 군의 연관성을 조사하였다.
결 과
1) Cyclin D1의 발현
FA에서 7예(46.7%), MIFC에서 21예(67.7%) 그리고 WIFC 에서 9예(75.0%)가 양성으로 발현되어 양성종양보다 암에
Fig. 3. Proportion of tumors expressing cyclin D1 according to his- tologic type.
Fig. 4. Proportion of tumors expressing survivin according to histo- logic type.
Fig. 5. Proportion of tumors expressing bcl-2 according to histo- logic type.
Table 1. The expression of Ki-67 and caspase 3
Ki-67 Caspase 3
FA* (mean±SD§) MIFC† (mean±SD) WIFC‡ (mean±SD) P value
1.69±1.884 1.73±1.294 7.90±2.621
＜0.001
0.613±0.488 0.987±0.567 2.608±1.631
＜0.001
*FA = follicular adenoma; †MIFC = minimally invasive follicular carcinoma; ‡WIFC = widely invasive follicular carcinoma; §SD = standard deviation.
Table 2. Difference of expression of Ki-67 and caspase 3
Ki-67 Caspase 3
FA* vs MIFC† FA vs WIFC‡ MIFC vs WIFC
P=0.946 P＜0.001(0.000) P＜0.001(0.000)
P=0.068 P=0.001 P=0.006
*FA = follicular adenoma; †MIFC = minimally invasive follicular carcinoma; ‡WIFC = widely invasive follicular carcinoma.
서 발현율이 증가하는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(P＞0.05)(Fig. 3).
2) Ki-67의 발현
평균적으로 FA에서 1.69, MIFC에서 1.73 그리고 WIFC에 서 7.90으로 발현되었으며, 평균값은 각 질환 간에 통계학 적 유의성이 있었다(P＜0.001)(Table 1). 사후검정을 실시하 였을 때 FA와 MIFC 사이에는 통계학적 의미가 없었으나 (P=0.946), FA와 WIFC, MIFC와 WIFC 사이에는 유의성이 있었다(P＜0.001, P＜0.001)(Table 2).
3) Survivin의 발현
FA에서 4예(26.7%), MIFC에서 14예(45.2%) 그리고 WIFC 에서 7예(58.3%)가 양성으로 발현되어 악성도가 높아질수 록 증가하였으나, 통계학적으로는 FA, MIFC, WIFC 간에 유의성은 없었다(P＞0.05)(Fig. 4).
4) Caspase 3의 발현
FA, MIFC 그리고 WIFC에서 각각 평균 0.613, 0.987 그리 고 2.608로 발현되었다. 평균값은 통계학적으로 각 질환 사 이에 차이가 있었고(P＜0.001)(Table 1), 사후검정을 실시하였 을 때 FA와 MIFC를 제외한(P=0.068) FA와 WIFC, MIFC와
Fig. 6. Proportion of tumors expressing p53 according to histologic type.
WIFC 간에는 유의성이 있었다(P=0.001, P=0.006)(Table 2).
5) Bcl-2의 발현
FA에서 11예(73.3%), MIFC에서 25예(80.6%) 그리고 WIFC에서 2예(16.7%)가 양성으로 발현되었다. FA와 MIFC 사이에 통계학적 의미는 없었으나(P=0.706), FA와 WIFC, MIFC와 WIFC 사이에는 통계학적 유의성이 있었다(P=
0.003, P＜0.001)(Fig. 5).
6) p53의 발현
FA에서 3예(20.0%), MIFC에서 14예(45.2%) 그리고 WIFC 에서 5예(41.7%)가 양성으로 발현되었으며, FA, MIFC, WIFC 간에 유의성은 없었다(P＞0.05)(Fig. 6).
고 찰
종양형성에 관여하는 세포주기 조절인자에는 촉진인자 인 cyclin계열 단백 및 이들과 결합하여 활성을 나타내는 촉 매단위인 cyclin dependent kinase (CDK)와 억제인자인 cy- clin dependent kinase inhibitor (CDKI) 등이 있으며, 다양한 종양의 발생과 진행과정에 이러한 세포주기 조절인자의 이 상이 중요한 역할을 하고,(5) 세포자멸사의 회피를 위한 세 포의 변이 역시 영향을 미친다고 알려져 있다.(6)
이에 본 연구는 갑상샘 소포종양에서 FA, MIFC 그리고 WIFC의 생물학적 성상을 알아보기 위해 각각의 병변에서 세포주기 관련단백 cyclin D1과 Ki-67, 세포자멸사 관련단 백 survivin, caspase 3, bcl-2 그리고 p53의 발현을 관찰하였
다.
관찰 대상인자 중 cyclin D1은 염색체 11q13에 위치한 유 전자로 세포의 성장과정 중 세포증식을 조절하는 감시관문 으로서 가장 중요한 단계인 G1/S기의 이행에 관여한다.
Cyclin D1이 CDK4 또는 CDK6과 복합체를 이루어 활성화 되면 Rb 단백을 인산화시켜 세포를 S기로 이행하게 하고 세포분열을 촉진시키며, 이 유전자가 증폭이나 과발현될 경우 세포증식을 촉진하는 것으로 알려져 있다.(7) Wang 등 (8)은 cyclin D1이 갑상샘암의 진행과 예후에 중요한 역할을 한다고 보고하였고, Goto 등(9)은 고분화암에서 32.0%가 양 성으로, 저분화암에서는 36.8%가 양성으로 발현되어, 3.0%
로 발현된 FA에 비해 통계학적으로 유의한 차이를 보인다 고 하였다. 본 연구에서도 FA (46.7%)에 비해 MIFC (67.7%) 와 WIFC (75.0%)에서 보다 높은 양성률을 보여 기존에 보 고된 연구와 비슷한 결과를 보였으나 통계학적인 차이는 없었다. 이 결과는 cyclin D1이 갑상샘 종양형성 초기에서부 터 관여하나 종양의 악성도와는 연관성이 없을 가능성을 시사하는 것으로 생각한다.
Ki-67 항원은 세포주기 중 G0와 초기 G1기를 제외한 증 식세포의 G1, S, G2기 그리고 M기에 존재하는 비히스톤 핵 단백으로, 암세포의 증식능을 측정하는데 널리 이용되고 있 다.(10) 갑상샘에 있어서 Müller-Höcker(11)와 Augustynowicz 등(12)은 샘종보다 암에서 Ki-67이 더 높게 발현된다고 보 고하였는데, 본 연구에서도 FA의 1.69%와 상대적으로 악성 도가 낮은 MIFC의 1.73%보다 악성도가 높은 WIFC에서 7.90%로 높게 관찰되었으며, 통계학적으로도 FA와 MIFC 는 유의성이 없었으나, FA와 WIFC, MIFC와 WIFC 사이에 는 유의성이 관찰되었다. 이러한 결과에서 Ki-67 표지지수 가 양성과 악성종양을 감별할 수 있는 표지인자는 아니더 라도 종양의 악성도를 반영하는 보조수단으로 유용할 것으 로 생각한다.
최근 caspase 의존성 및 비의존성 작용기전을 통하여 세 포자멸사를 조절하는 새로운 단백들이 발견되고 있으며, 이 중 대표적인 한 가지가 survivin이다.(13) Survivin은 15kb 길이로, 염색체 17q25에 위치하며,(14) 이 단백의 전사는 또 다른 세포자멸사를 조절하는 단백인 p53에 의해 억제되어 세포자멸사를 조절하는데 중요한 역할을 하고, 특히 G2/M 기의 핵에서만 관찰된다.(15) Survivin의 과발현은 발암과정 에서 손상된 세포의 이상증식을 초래하며, 일부에서는 화 학요법으로 유도되는 종양세포의 자멸사를 survivin이 억제 시켜 항암 치료에 대한 저항을 유발한다고 보고하였다.(13)
또한 성인의 여러 장기에서 발생한 종양에 특이적으로 발 현되는 성질을 갖고 있는 점으로 인해 종양의 진단적 표지 자 또는 항암제의 표적물질 후보로 주목받고 있다.(16) 갑 상샘암에 있어서 Haghpanah 등(17)은 FA에서 17.4%가 양성 으로, FC에서 81.8%가 양성으로 발현되어 통계학적 유의성 이 있음을 보고하였다. 본 연구에서의 발현율은 FA에서 26.7%, MIFC에서 45.2% 그리고 WIFC에서 58.3%로 종양이 진행할수록 증가하였으나 통계학적으로 의의는 없었으며 (P=0.242), 이는 Ito 등(18)이 FA보다 FC에서 2배 더 발현되 나 통계학적 유의성은 없었다고 보고한 것과 유사한 결과 이다.
Caspase는 시스테인 단백분해효소의 무리에 속하는 분해 효소로 모두 12가지가 알려져 있으며, 그 가운데 caspase 3 은 인간의 Jurkat T 림프구로부터 분리된 것으로 Fas 매개 세포자멸사에서 가장 중요한 역할을 하고, 정상 세포의 세 포질에 전효소 형태로 존재해 있다가 Fas 자극에 의해 단백 분해되거나 어떤 경우에는 스스로 단백분해과정을 거쳐 활 성화되면서 세포자멸사 과정을 진행시킨다.(19) 전암성 병 변이나 암에서 caspase 3의 발현은 활성형 또는 비활성형에 따라 다양하게 발현되는 것으로 보고되고 있으며,(20) 배양 세포를 이용한 실험뿐만 아니라 췌장암, 전립선암, 백혈병, 위암 그리고 갑상샘암을 비롯한 각종 인체 종양에서도 cas- pase 3에 대한 연구가 이루어지고 있다.(21) 본 연구에서 평 균 발현정도를 비교하였을 때 FA와 MIFC는 각각 0.613%, 0.987%로 서로 간에 유의성이 없었으나, WIFC에서는 2.608%로 발현되어 FA와 WIFC, MIFC와 WIFC 사이에는 통계학적 유의성이 관찰되었다. 이러한 결과는 형태학적으 로 유사한 FA와 MIFC의 관계와 형태학적 차이를 보이는 FA와 WIFC, MIFC와 WIFC의 관계를 반영한 것으로 생각 한다.
Bcl-2 유전자는 미토콘드리아 막 내부의 단백을 코드화 하는 발암 유전자로 분자량 28 kD, 239개의 아미노산 서열 로 구성되어 있고 말단부위에 혐수성 아미노산이 부착되어 있으며,(22) 세포자멸사를 억제하여 세포의 생존기간을 늘 림으로써 암을 유발하는 여러가지 변화에 민감하게 한 다.(23) 이의 과발현은 소포림프종에서 처음 발견되었으며 핵막의 세망이나 사립체외막 또는 형질세망 등에 존재하 고, 최근 갑상샘 소포암에서 예후와의 연관성에 대한 연구 가 보고되고 있다.(24) 갑상샘암의 경우 Saltman 등(25)은 고 분화암, 저분화암 그리고 미분화암에서 각각 68%, 41.8%, 0%의 bcl-2 발현을 보고하였고, Wiseman 등(26)은 분화암에
서 25%, 미분화암에서 0%의 발현을 보고하였다. 본 연구에 서도 FA와 MIFC에서는 73.3%, 80.6%가 발현되었고 WIFC 에서는 16.7%가 발현되는 유사한 결과를 얻었다. 그러므로 bcl-2는 FA와 MIFC의 감별보다 MIFC와 WIFC의 감별에 유 용하게 사용될 수 있는 지표가 될 것으로 생각한다.
p53 유전자는 염색체 17p13에 위치하며 세포주기와 분화 에 작용하여 인체의 여러 종양발생에 관여한다.(27) p53은 야생형 p53과 돌연변이형 p53의 두 형태로 존재하며 세포 주기 중 유전자의 손상유무를 감시하는 기능을 한다.(28) 이 중 야생형 p53은 종양억제유전자로 작용하며, DNA의 이상이 발견될 경우 세포주기 중 G1 또는 G2기를 일시적으 로 정지시켜 손상된 유전자가 자연치유될 수 있는 시간을 갖도록 하거나 치유가 불가능할 경우 caspase 3에 의해 유도 된 엔도뉴클리아제를 활성화시켜 세포자멸로 유도하는 역 할을 한다.(27,29) 그러나 돌연변이형 p53은 이러한 정상기 능을 상실하여 종양형성을 촉진시키는 역할을 하게 되고, 세포 내에 축적되어 세포의 변형을 초래한다.(30) Goto 등 (9)은 갑상샘 종양에서 p53이 FA와 고분화암에 비해 저분 화암과 미분화암에서 통계학적으로 유의하게 높게 발현됨 을 보고하였고, Saltman 등(25)은 고분화암보다 저분화암과 미분화암에서 p53이 높게 발현되나 통계학적으로는 고분 화암과 미분화암 사이에만 유의성이 있음을 보고하였다.
본 연구에서는 FA, MIFC, WIFC에서 각각 20.0%, 45.2% 그 리고 41.7%로 발현되어 Goto 등(9)의 보고와 유사하였으나 통계학적 유의성은 없었다.
결 론
FA, MIFC 그리고 WIFC의 면역조직화학 염색을 통한 분 석에서 세포주기 관련단백 cyclin D1과 세포자멸사 관련단 백 중 survivin과 p53의 발현은 FA, MIFC, WIFC 간에 연관 성이 없었으며, 세포주기 관련단백 Ki-67과 세포자멸사 관 련단백 중 caspase 3 그리고 bcl-2의 발현은 FA와 MIFC 간에 는 통계학적으로 유의하게 차이가 없었으나, FA와 WIFC 그리고 MIFC와 WIFC 간에는 통계학적으로 유의하게 차이 가 있었다.
따라서 이들 단백의 발현이 양성과 악성을 구별하는 지 표로는 다소 무리가 있지만, MIFC와 WIFC의 구별에 있어 조직학적 구분 외에 Ki-67, caspase 3 그리고 bcl-2의 발현을 분석한다면 수술 후 보조적인 131I-방사선 요오드 치료여부 결정과 추적관찰 기간 및 간격 등을 결정하는데 도움이 될
것으로 생각한다.
더불어, 관련단백과 국소재발, 원격전이, 생존율과의 연 관성에 대한 추가 연구와 최근에 이루어지고 있는 수술 전 여러가지 유전자 검사가 진행된다면 임상적으로 보다 더 유용한 갑상샘 소포암의 표지자로서의 역할을 확인할 수 있을 것으로 생각한다.
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