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책임저자: 김해성, 강원도 춘천시 교동 153번지
200-704, 한림대학교 춘천성심병원 외과 Tel: 033-240-5179, Fax: 033-243-6413 E-mail: [email protected]
접수일：2010년 1월 5일, 게재승인일：2010년 3월 23일
피부화상치유에서 줄기세포 표지자의 면역조직화학적 발현에 관한 연구
한림대학교 의과대학 병리학교실, 1생화학교실, 2외과학교실
최영희ㆍ김민규ㆍ안동현ㆍ조성진ㆍ홍수희
1ㆍ이재용
1ㆍ이진원
2ㆍ김해성
2Immunohistochemical Expression of Stem Cell Markers during the Wound Healing Process of Cutaneous Burn
Young Hee Choi, M.D., Min Gyu Kim, M.D., Dong-Hyun Ahn, M.D., Seong Jin Cho, M.D., Soo Hee Hong1, Jae-Yong Lee, Ph.D.1, Jin Won Lee, M.D.2, Hae Sung Kim, M.D.2 Departments of Pathology, 1Biochemistry and 2Surgery, College of Medicine, Hallym University, Chuncheon, Korea
Purpose: A cutaneous wound healing requires a well-orchestrated integration of the complex biological and molecular events of cell migration and proliferation, extracellular matrix deposition, angiogenesis and remodeling.
Finally, skin regeneration is the main goal. Stem cells are self-renewing multipotent progenitors with the broadest developmental potential in a given tissue at a given time. The aim of this study was to examine the role of stem cells during the wound healing process of cutaneous burn in hairless mice by using immunohistochemical stainings (nestin, cytokeratin 15 and CD31).
Methods: Each mouse received 2 burns at the dorsal area by applying a metal stick heated in boiling water. Burn wound sites were dressed with duoderm. The mice were sacrificed at 0, 2, 7, 14 and 21 days after burn. Histological findings and immunohistochemical expression for stem cell markers were observed.
Results: Nestin was expressed in the stromal cells beneath the epidermis, hair follices, dermal cysts and endothelial cells. Cytokeratin 15 was expressed in the epidermis except in basal cells. On 7 and 14 days after burn, the regenerated epidermis didn't express cytokeratin 15. CD31 was expressed in the endothelial cells on 7 and 14 days after burn. The amount of nestin expression was the highest.
Conclusion: Our results showed that nestin may have various effects on burn wound healing. Cytokeratin 15 was expressed before burn and after burn. It is likely that other cytokeratin may stimulate epithelial regeneration.
CD31 may act in vascular regeneration during burn healing. (J Korean Surg Soc 2010;79:1-7) Key Words: Hairless mouse, Burn, Wound healing, Stem cell
중심 단어: 무모쥐, 화상, 상처치유, 줄기세포
서 론
창상치유의 궁극적인 목표는 반흔을 최소화하면서 조기 에 창상이 닫히도록 하는 것이다. 임상적으로 창상치유란 창상이 닫히는 과정을 의미하며 이는 상피화, 세포외 기질 의 침착, 창상 수축 등으로 설명된다. 조직학적으로는 지혈 단계, 염증 단계, 증식 단계, 성숙 단계를 거치면서 다양한
Fig. 1. Structures of normal and burned skin in hairless mice. (A) Normal skin showed the epidermis and dermis. (B) After burn, epidermis and most dermis were damaged. However, the lower part of dermal cyst was still intact as second-degree burn wound demonstrated (H&E, ×40).
세포들과 성장인자들이 작용한다. 부가적으로 줄기세포의 발현으로 피부 재생 과정이 진행된다. 화상을 입게 되면 화 상으로 조직에 변성이 오면서 치유과정과 같이 병행된다.
줄기세포 발현이 피부 재생에 관여한다고 생각하지만 화 상치유과정에서 줄기세포의 발현에 관한 보고가 없다. 이 에 저자들은 무모쥐에서 심부 2도 화상을 유발한 후 화상치 유과정을 조직학적으로 관찰하고, 줄기세포의 표지자에 대 한 면역조직화학염색(immunohistochemical stain)을 시행하 여 줄기세포들이 어디서 발현하는지 관찰하여 화상의 치유 과정을 이해하고자 하였다.
방 법
1) 동물
동물윤리위원회 규정과 동물실험관련 법규(Hallym 2008∼
2009)에 따라 동물을 보호하고 실험하였다. 25∼30 g 무게 의 수컷 무모쥐를 각 군별로 5마리를 사용하였고, 실험 기 간 중 사육실 환경은 23±2oC, 상대습도 55±10%를 유지하였 다. 12시간 인공 조명 하에서 마우스용 케이지에 4마리씩 넣어 사육하였으며, 실험동물용 사료 및 식수는 자유로이 공급하였다.
2) 심부 2도 화상 유도 및 드레싱
70% 아산화질소와 30% 산소가 섞여 있는 기체에 2% 이 소플루란(isoflurane)을 무모쥐에 흡입시켜 마취를 유도한
후 1% 이소플루란 농도로 마취를 유지시키면서 화상을 유 도하였다. 지름 1 cm의 둥글 납작한 쇠막대기를 끓는 물에 넣어서 가열한 후 무모쥐의 등 양쪽에 10초간 두어서 화상 을 입혔다. 조직학적으로 심부 2도 화상을 확인하였다(Fig. 1).
화상을 입힌 2시간 후, 2일, 7일, 14일, 21일 후에 각각 5 마리씩 희생하였다. 동물들은 모두 경추 탈골한 후 화상 부 위의 피부 조직을 채취하였다. 채취한 피부 조직은 가운데 를 잘라서 hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 면역조직화학 염색을 위하여 10% 중성 포르말린 용액에 10시간 고정하였 다.
3) 조직학적 검사
파라핀 블록을 만들어서 5μm 두께로 연속절편을 제작 하였고 일부는 통상적인 H&E 염색을 실시하여 광학현미경 으로 관찰하였다. 그리고 일부는 면역조직화학염색을 하였 다. 광학현미경으로는 아래의 목록들을 관찰하였다.
(1) 염증세포침윤도(cellularity): 화상 부위에 상피와 나란하 게 침윤된 염증세포를 관찰하였는데, 화상 장경을 기준으 로 화상 장경의 ⅓ 이하는 1, ⅓∼½ 이하는 2, ½∼⅔ 이하는 3, ⅔∼1이면 4로 하였다.
(2) 근육층의 위치(location of muscle layer): 화상 부위의 근육층이 주위 정상부위의 근육층 보다 위에 있으면 2, 그 대로이면 0, 내려가 있으면 −2로 하였다.
(3) 이물질 반응 및 염증세포 군집의 수(number of inflam- matory foci): 200배 시야에서 이물질 반응 숫자와 염증세포
Table 1. Histologic changes in dressed wounds at 2, 7, 14 and 21 days after burn
Dressing (day)
Histologic criteria
Cellularity Letter* Location of
muscle layer Letter*
No. of inflammatory
foci
Letter*
Amount of granulation
tissue
Letter*
Length of regenerated
epithelium
Letter*
0 0 f 0 a 5.75±2.53 c 0 d 0.50±1.73 c
2 2.25±1.36 a, b, c 0 a 8.83±6.31 b 0 d 1.25±0.45 b, c
7 1.67±1.75 b, c 2 b 15.56±1.97 a 4.33±0.49 b 4 a
14 0.5±0.55 d, e 2 b 15.17±7.46 a 6.00±1.48 a 5 a
21 − − − − 8.27±3.92 b 2.93±1.49 c − −
*Duncan's multiple range test: Means with the same letter are not significantly different. Means with the different letter are significantly different (P＜0.05).
군집의 수를 세었다.
(4) 육아조직의 양(amount of granulation tissue): 100배로 관찰하였을 때, 모세혈관이 흩어져 있으면 1, 100배 시야 면 적의 ⅓ 이하이면 2, ⅓∼½ 이하면 3, ½∼⅔ 이하면 4, 100배 시야 전체이면 5, 1∼1⅓ 이하이면 6, 1⅓∼1½ 이하이면 7, 1½∼2배이면 8로 하였다. 이와 같은 방법으로 점수를 준다.
(5) 재생상피의 길이 측정(length of regenerated epithe- lium): 재생상피는 정상 상피보다 4층 이상으로 두꺼워진 상 피로 하였다.(1) 재생상피의 길이가 100배 시야의 장경의
⅓ 이하면 1, ⅓∼½이면 2, ½∼⅔이면 3, ⅔∼1이면 4, 1⅓∼½ 이면 5, 1½∼⅔이면 3, 1⅔∼2이면 8로 측정하였다.
4) 면역조직화학염색(immunohistochemical stain)
파라핀 블록 절편으로 면역조직화학염색을 실시하였다.
일차 항체로 rabbit Nestin (1：4,000, ab 5968, abCAM, Cam- bridge, UK), rabbit keratin 15 (1：200, NB 100-91841, Novus Biologicals, Litteleton, CO, USA), rabbit anti-CD31 (ab59251, abCAM, Cambridge, UK)을 사용하였고, 면역조직화학염색 은 Polink-2 plus Rabbit DAB kit를 사용하였다.
CD31은 세포막, nestin은 세포질, keratin 15는 세포질에서 발현한 것을 양성으로 하였고, 화상부위와 주위 정상부위 의 진피낭(dermal cyst)에서의 발현을 관찰하였다.
5) 통계분석
모든 자료의 분석은 SAS (version No. 9.1) 통계 프로그램 을 이용하였고, 지표간의 상관관계는 Pearson χ2 test, Duncan's multiple range test로 검정하였으며, 유의수준은 0.05 이하로 하였다.
결 과
1) 염증세포침윤도
염증세포들은 주로 화상부위에 두꺼운 띠모양으로 침윤 하였는데 상피와 평행하게 침윤하였다. 염증세포의 침윤은 화상 후 2일에 가장 많이 침윤하였다(2.25±1.36). 0일에는 전혀 없어서, 0일과 비교하여, 2일, 7일, 14일의 발현은 통계 학적으로 유의하게 증가하였고, 2일과 7일에 비교하여, 14 일(0.5±0.55)에는 유의하게 감소하였다(Table 1). 주위 정상 부위에서는 관찰되지 않았다.
2) 근육층의 위치
화상 후 7일부터 화상부위의 근육층이 주위의 정상 근육 층 보다 올라가서 14일에도 유지되었다. 21일에는 육아조 직 및 진피조직이 생겼으나 근육층은 올라가 있어서 흉터 수축이 관찰되었다.
3) 염증세포 군집의 수
화상부위에서 염증세포의 군집은 2일째 생기기 시작하 여 7일(15.56±1.97)과 14일(15.17±7.46)에 가장 많이 관찰되 었고, 통계적으로 유의하였다. 21일(8.27±3.92)에는 유의하 게 감소하였다(Table 1).
4) 육아조직의 양
화상 후 7일부터 화상부위에서 육아조직을 관찰할 수 있 었다. 육아 조직은 14일에 가장 많이 생성되었으며, 7일 (4.33±0.49), 14일(6.00±1.48), 21일(2.93±1.49)의 육아조직의 양은 통계학적으로 상호간에 유의한 차이를 보였다(Table 1).
Fig. 2. Immunohistochemistry for nestin. Expression of nestin pro- tein is present in the cells below the epidermis (A), the out- er cells of epidermal cyst (B) and endothelial cells of the granulation tissue (C).
5) 재생상피의 길이 측정
재생상피는 화상 후 2일(1.25±0.45)부터 관찰되었고, 14일 (5.00)에는 가장 길었다(Table 1). 그러나, 21일에는 화상부 위가 완전히 재생상피로 덮여서 길이를 잴 수가 없었다.
6) Nestin 발현(Fig. 2)
정상 피부에서는 모낭과 진피낭주위 상피세포의 세포질 에 발현하였으며 상피 바로 아래 기질 세포에서도 발현하 였다. 표피 피지샘 혹은 모낭 바닥, 표피낭, 진피 내의 털줄 기(hair shaft) 바닥 등에서도 발현하였다. 화상부위의 모낭 주위에서는 화상 당일과 2일 후의 nestin 발현이 비슷하였지 만 7일에는 현저하게 감소하였다. 21일에 35%로 증가하였 으나 통계적인 유의성은 없었다. 화상부위의 진피낭에서는 화상 당일보다 2일, 7일에 nestin의 발현이 감소하였으나, 21 일에는 95%에서 관찰되었다. 통계적으로 유의하게 증가하
였다. 화상 주변 조직의 모낭주위에서 14일에 nestin의 발현 이 약간 증가하였으나, 전체적으로는 감소하는 추세였고, 진피낭 주변에서 발현하는 nestin은 통계학적으로 유의하게 감소하였다. 화상부위의 육아조직의 내피세포에서도 발현 하였는데, 7일과 14일에 가장 많이 발현하였다.
7) Cytokeratin 15 (CK15)의 발현(Fig. 3)
세포질에 발현하였다. 정상 표피세포의 기저세포에는 염 색되지 않았고, 기저세포 위의 각질형성세포에서 발현하였 다. 정상 부위의 표피낭과 털줄기, 모낭과 진피낭에서 발현 하였는데, 기저세포에는 발현하지 않았다. 화상 부위의 모 낭과 진피낭에서는 화상 후 2일에 발현이 감소하였다가, 7 일에 증가하였으며 14일에 다시 감소하였다. 재생표피세포 는 화상 후 7일에 선명하게 보였는데 CK15의 발현은 감소 되어있었고, 14일에도 발현되지 않았다. 21일에는 재생표피 가 완전히 서로 붙었는데 이 때 다시 CK15가 발현하였다.
Fig. 4. Immunohistochemistry for CD31. Expression of CD31 is present in endothelial cells in 7 days after burn.
Fig. 3. Immunohistochemistry for cytokeratin 15. Expression of cytokeratin 15 is present in suptrabasal area of epidermis (A). At 7 days after burn, the expression of cytokeratin 15 was not present in regenerated epidermis (arrow).
8) CD31의 발현(Fig. 4)
세포막에 발현하였고, 화상부위 및 화상 주변 정상부위 의 혈관내피세포에서 발현하였는데, 화상 0일, 2일과 21일 에는 발현을 관찰할 수 없었고, 화상 7일 및 14일에 발현이 관찰되었다.
고 찰
무모쥐는 조직학적으로 모낭이 첫 번째 순환의 퇴행기에 서 비정상으로 발육하였는데, 퇴행하는 과정이 잘못되어서 털이 발육하지 못하는 것으로 생각된다. 특징적인 구조는
두 가지로 타원낭(utriculus)와 진피낭이다. 타원낭은 과다각 화가 있는 상피를 가진 팽대모양(ampuliform)의 구조물로 피부와 연결이 있으며, 털줄기의 깔때기(infundibulum)에서 기원한 것으로 보인다. 진피낭은 깊은 진피에 있으며 표피 와 연결이 없다. 이 낭은 각화된 상피로 내층을 형성하며 피지세포가 벽에 있을 수도 있다. 이 낭은 털망울 조상세포 에서 기원한 것으로 보고되었다.(2)
무모쥐는 창상치유에 대한 연구에 유용한 동물이다. 털 을 깎을 필요도 없고, 털을 깎으면서 생기는 염증도 없으며, 털이 없기 때문에 창상치유과정을 관찰하는데 용이하다.
털이 있는 쥐와 같이 창상치유과정 중에 생기는 염증(응혈 및 백혈구의 침윤), 세포의 생성과 증식(상피 재생, 섬유 증 식, 신생혈관생성), 조직 재형성(흉터 형성)의 전 과정을 무 모쥐에서도 관찰할 수 있다고 한다.(2) Nestin은 신경기원세 포-모낭 돌출부에 있는 세포-의 표지자로 알려져 있는데 Li 등(3)은 모낭돌출부 세포, 부리집 외층(outer root sheath) 세 포, 피지샘의 기저세포에서 nestin과 함께 CK5/8 및 CK15가 동시에 발현하였다고 보고하였다. 이는 모낭세포와 신경줄 기세포 사이에 어떤 연관성이 있을 것으로 보이며 nestin을 발현하는 세포가 신경줄기세포로서뿐만 아니라 모낭줄기 세포의 역할도 하는 것으로 제안하였다.
본 실험에서 nestin은 상피 바로 아래 기질에서 발현하였 고, 모낭주위와 진피낭 주위에서 발현하였다. 육아 조직의 내피세포뿐만 아니라 표피피지샘 혹은 모낭 바닥에서도 발 현하였다. Nestin 발현하는 모낭줄기세포는 모줄기(hair shaft) 주위에서 발현하면서 짧은 수상돌기(dendrite)로 서로
연결되어 있었다고 하고, nestin을 발현하는 세포는 부리집 외층을 형성하였다.(4) Nestin을 발현하는 모낭의 줄기세포 는 신생혈관을 성장 혈관의 숫자도 증가시켰으며, 내피세 포 특이적인 표지인 CD31과 von Willebrand factor도 발현하 였다.(5) 또한 신경조직, 신경 교세포, 평활근, 멜라닌 세포 로 분화할 수 있었다고 한다.(6)
본 실험에서 CK15의 발현은 무모쥐의 표피세포에서는 기저세포에는 염색되지 않았고, 기저세포상부의 각질형성 세포에서 발현하였다. 각질세포는 keratin intermediate fila- ments를 발현하고 있는데 기저세포층은 CK5와 CK14가 발 현하고, CK1과 CK10은 초기저세포층에서 발현한다. 모낭 줄기세포는 이미 언급한 CK5와 CK6, CK16, CK17이 발현 한다. 최근에는 CK15가 모낭의 팽대부위에서 발현하여 CK15를 줄기세포의 표지자로 인정하였다. CK15의 촉진자 (promoter)는 쥐의 모낭의 팽대부에서 활성화되었으며, CK15의 면역염색은 신생아의 포피에서 기저세포에서 고르 게 염색되었다고 한다.(7) 식도에서 그리고 신생쥐의 식도 에서 CK15가 기저세포상부에서 발현한다고 하여서, 무모 쥐의 표피에서의 CK15의 발현양상은 식도나 신생쥐의 식 도 표피에서 같았다.(8)
본 실험에서는, CK15의 단백질 발현이 화상 주변 정상 부위의 표피낭과 털줄기, 모낭과 진피낭의 편평상피세포에 서 발현하였다. 그러나 기저세포에는 발현하지 않았다. 화 상 부위의 모낭과 진피낭에서는 화상 후 2일에, CK15의 단 백질 발현이 감소하였다가, 7일에 증가하였으며 14일에 다 시 감소하였다. 재생표피세포는 화상 후 7일에 선명하게 보 였는데 CK15의 발현은 감소되어있었고, 화상 후 14일에도 발현되지 않았다. 21일에는 재생표피가 완전히 서로 붙었 는데 이때 다시 CK15가 발현하였다.
Werner와 Munz(9)에 따르면, 일반 mice에서 표피 전층제 거 손상 후 치유과정 중에서 CK15 mRNA 발현이 손상 후 첫 3일간 의미 있게 감소하였고, 7일 후에도 계속 감소된 상태였다고 하는데, 이는 CK15 단백질의 합성이 감소되었 음을 의미한다. 또한, 손상부위에 표피가 재생되어 회복이 되었을 때 CK15 mRNA가 정상적으로 발현하였다고 하고, 육아조직 바로 위의 두꺼워진 활성화된 표피세포에서 CK15의 발현이 상당히 감소하였다. 그러나, 손상부위 주위 의 정상표피에서는 계속 발현하였다.(8) 우리 실험에서도, 재생표피세포에서는 CK15의 발현이 감소되었는데, 이는 Werner와 Munz(9)에 의하면 TNF-alpha, EGF, KGF가 손상부 위에 많이 증가하여 CK15의 발현을 억제시켰다고 하였다.
또한 CK14의 발현은 손상이 치유되는 과정 중에 증가하였 다고 한다. 손상부위의 치유 중에 손상주위의 각질세포는 모양도 변하고 이주하며, keratin의 발현도 변하였다고 하 며, 각질세포의 세포배양에서도 CK14는 계속 발현하였지 만, CK15은 세포들이 중층화가 될 때까지 발현하지 않았다 고 한다. CK14는 모든 각질세포들의 기본적인 물질인 반면, CK15는 성숙한 기저세포와 밀접한 연관이 있는 것으로 생 각된다. 그러나 성숙한 쥐가 되면 기저세포에 국한해서 발 현한다고 하였다. Porter 등(8)에 의하면 빠르게 분열하는 편 평상피세포나, 손상부위의 편평상피세포 혹은 편평상피세 포암에서 CK15은 발현하지 않았고, 기저세포에서도 성숙 하고 안정되어 있는 세포에서만 발현함으로 보아, CK15은 기저세포를 안정화하고, 조직 구조를 유지하는 기능을 하 는 것으로 생각된다.
즉 CK15은 줄기세포 표지자이지만, 성숙한 표피세포에 서는 기저세포에만 발현되는 것으로 보인다. 본 실험에서 는 무모쥐의 기저세포상부에서 발현하였다. 피부손상이 생 기면 CK15가 감소하지는 않지만, 재생된 표피세포에는 발 현하지 않고 있다가 완전히 표피가 생기게 되면 발현하였 다.
CD31은 혈소판내피세포 접착 분자-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule-1)로서 130 kDa의 당단백질로로 면역 글로불린 상과(immunoglobulin superfamily)의 한 종류이며 많은 혈액조성세포와 내피세포에서 발현한다 CD31은 다양 한 혈액조성세포의 표면에 발현하며 골수전구세포들을 혈 관에서 골수로 이주하도록 도와준다고 한다.(10)
Nogami 등(11)은 Sprague-Dawley rat에 절개손상을 냈을 때, CD31의 발현이 혈관이 손상 후 1일과 3일에는 보이지 않았고, 5과 7일에 손상부위에서 관찰되었다고 하였다. 신 생혈관은 표피에 수직으로 놓여 있었으며, 손상 후 14일에 는 CD31 양성인 혈관들이 수직방향을 보이지 않고 흩어져 있었고 28일 후에는 대조군과 비슷한 양상이 되어 있었다 고 한다. Shimamura 등(12)은 mice의 피부를 전층으로 절제 한 후 상처부위의 치유과정을 관찰하였을 때, 육아조직은 5일부터 관찰되었고, CD31 양성인 신생혈관도 관찰할 수 있었다고 한다. 또한 9일째 혈관 숫자가 가장 높았고, 11일 째 재생된 표피가 완전히 덮었으며 15일째는 감소하였다고 한다. 본 실험에서는 CD31은 화상 후 7일, 14일에 혈관의 내피세포에서 발현하였다.
결 론
무모쥐의 화상 치유과정을, 화상을 입힌 후 2, 7, 14 및 21일에 희생하여 조직학적으로 관찰하였고, 줄기세포의 표 지자인 nestin, CK15, CD31의 단백질 발현을 면역조직 염색 을 통하여 관찰하였다.
염증세포침윤은 화상 후 2일에 가장 많이 침윤하였으며, 육아조직은 14일에 가장 많이 생성되었다. 재생상피는 화 상 후 2일부터 관찰되었고, 21일에는 양측에서 재생된 상피 가 서로 융합되어서 화상부위가 덮여 있었다. Nestin은 진피 에서 다양한 구조물에서 발현하여 다양한 방향으로 분화하 면서 치유과정을 돕는 것으로 생각되며, cytokeratin 15은 표 피의 재생시기에는 발현되지 않고, 재생이 된 후 안정화 시 기부터 발현되는 것으로 보아, 표피의 재생을 돕는 다른 cy- tokeratin을 찾는 연구가 추가되어야 하리라 생각된다. 그리 고 CD31은 화상의 치유과정 중에 육아조직이 생기는 7일과 14일에 혈관내피세포에서 발현하므로 혈관의 재생을 돕는 것으로 생각된다.
REFERENCES
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