마우스 안구건조증 모델에서 포도껍질 추출물인 안토시아닌 올리고머의 효과에 관한 연구
강규동1․정재균1․Ramsha Afzal1․양현필2․황형빈1
1가톨릭대학교 의과대학 인천성모병원 안과
2(주)키토라이프 기술연구소
Effects of Grape Skin Extract, Anthocyanin Oligomer, on a Murine Dry Eye Model
Kuidong Kang1, Jae Gyun Jeung1, Ramsha Afzal1, Hyunpil Yang2, and Hyung Bin Hwang1
1Department of Ophthalmology, Incheon St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea
2Technical R&D Center, Kittolife Co., Ltd.
ABSTRACT This study was conducted to investigate the effects of anthocyanin oligomers on dry eye disease through animal experiments. To accomplish this, 80 eyes of 40 mice were used, and dry eyes were induced by administration of 0.02% benzalkonium chloride (BAC). Anthocyanin oligomers of two doses (10 mg/kg and 50 mg/kg) were ad- ministered once a day for 2 weeks, while the control group received 0.1% cyclosporine A (CA) eye drops twice a day. Under a slit lamp microscope, the degree of corneal erosion (NEI grading system), tear break up time (TBUT) and phenol red test were observed. Moreover, histopathologic analysis of the lacrimal gland and corneal tissue was also performed. In the anthocyanin oligomer group (50 mg/kg), NEI score was significantly lower than that of the BAC treated group, while the TBUT and the wet length of phenol red thread were significantly higher than in the BAC group (P<0.01). Analysis of corneal tissue by hematoxylin and eosin (H&E) staining showed that keratinization and thickening of the cornea epithelial layer was not more prominent than those of eyes treated with anthocyanin oligomer (50 mg/kg) and CA eye drops. Overall, our results demonstrated that this natural compound has potential positive effects on the clinical index of dry eyes in the murine dry eye model.
Key words: anthocyanin oligomer, anti-inflammatory effects, benzalkonium chloride, dry eye, tear film
Received 1 February 2019; Accepted 4 March 2019
Correspondence: Hyung Bin Hwang, Department of Ophthalmol- ogy, Incheon St. Mary’s Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Incheon 21431, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-32-280-5110 Author information: Kuidong Kang (Researcher), Jae Gyun Jeung (Researcher), Ramsha Afzal (Student), Hyunpil Yang (Instructor), Hyung Bin Hwang (Professor)
서 론
만성질환인 안구건조증은 눈물의 부족, 눈물의 구성성분 의 불균형화, 눈물의 삼투압의 변화 등으로 인하여 안구 표 면에 염증성 변화가 나타나는 질환이다(Geerling 등, 2007).
안구건조증의 원인으로는 호르몬의 변화, 건조한 환경의 노 출, 노화, 자가면역질환, 굴절수술 등이 알려져 있으며 최근 에는 컴퓨터나 스마트폰과 같은 전자기기의 사용 증가로 그 유병률이 증가하고 있다. 한 조사에 따르면 한국인에서 고령 층(65세 이상)의 안구건조증 유병률은 약 33% 정도라고 보 고되고 있으며(Han 등, 2011), 이러한 높은 유병률의 안구
건조증을 치료하기 위한 건강보험의 지출도 꾸준히 증가하 고 있다. 즉 안구건조증은 일상생활에 많은 불편함을 초래할 뿐만 아니라 그 치료에 경제적으로도 많은 비용이 발생하는 심각한 질환이다. 이러한 난치성 안구표면질환인 안구건조 증의 현재의 치료방법은 안구표면의 눈물을 보충해주는 인 공눈물제제를 점안하거나 디쿠아포솔(diquafosol)과 같은 뮤신 분비제(mucin secretagogue), 사이클로스포린(cyclo- sporine)과 같은 면역억제제를 점안하여 안구표면의 염증 을 줄이는 방법 등이다(Park 등, 2016). 하지만 이러한 점안 약제는 약제 자체의 안과적 부작용이 있을 수 있고, 약제에 첨가된 방부제(benzalkonium chloride)로 인한 2차성 안구 표면의 손상이 나타날 수 있다. 또한 점안약제의 특징상 환 자가 직접 점안하여야 하므로 고령 환자에서 약제의 순응도 가 떨어지는 경우가 높다. 이에 따라 복용이 간편한 경구용 천연물 유래 소재를 안구건조증에 적용하기 위한 다양한 연 구들이 진행되었고 최근에는 안토시아닌, 오메가-3 지방산 등이 안구건조증에 효과가 있다는 연구가 발표되었다(Bhar- gava 등, 2013; Riva 등, 2017).
을 띠는 천연색소로 300여 종이 알려져 있고, 가장 대표적인 생리 기능성은 활성산소를 소거시키는 항산화 활성, 항염증 활성 및 항암 활성 등으로 알려져 있다(Prior 등, 2005; Kong 등, 2003; Yang 등, 2001). 하지만 이러한 다양한 생리 기능 성에도 불구하고 포도 및 블루베리 등에서 추출되는 안토시 아닌의 대부분은 단량체(monomer) 형태이고 생리활성의 발현이 우수한 중합체(oligomer)의 형태는 단지 5% 미만으 로 알려져 있다. 단량체의 안토시아닌은 중성 및 알칼리성 용매에서 불안정하고 빛에 노출되면 구조적으로 불안정화 되어 파괴되는 단점을 가진 반면, 안토시아닌의 중합체 형태 인 안토시아닌 올리고머는 빛과 중성 용매에 보다 안정적이 어서 생리활성이 뛰어나다고 알려져 있다(Prior 등, 2005;
Kong 등, 2003; Yang 등, 2001).
본 연구에서는 마우스에서 염화벤잘코늄으로 안구건조증 을 유발시킨 후 안토시아닌 올리고머를 경구 투여하여 안토 시아닌 올리고머가 안구건조증의 다양한 지표에 어떠한 영 향을 주는지를 알아보고자 하였다. 특히 본 연구에서는 임상 적으로 안구건조증을 진단하고 치료 효과를 판단하는 각막 미란의 정도, 눈물막 파괴시간, 눈물의 분비량, 각막상피세 포의 조직학적인 변화 등을 관찰하여 본 약제의 약리 효과를 객관적으로 판단하고자 하였다.
재료 및 방법
염화벤잘코늄을 이용한 안구건조증 유도 동물실험 모델 본 연구에서는 총 40마리의 수컷 6주령의 BALB/c 마우 스를 사용하였으며, 가톨릭대학교 인천성모병원 동물실험 윤리위원의 승인을 득한 후 시행하였다(승인번호 CIMH- 2018-005). 모든 마우스들은 1주일간의 적응기간을 가졌 고 방의 온도(23±1°C), 습도(60±5%)를 유지하였으며, 그 룹별로 나누어 케이지에서 넣어주었고 물과 음식은 자율 급 이 하였다. 적응기간을 마친 마우스들은 무작위로 군당 8마 리(총 5군)로 분리하였다. 실험은 2주간 진행하였으며 이상 의 기간에 대조군에서는 매일 2차례(오전 9시, 오후 9시) 생리식염수를 점안하였고, 염화벤잘코늄 점안군(안구건조 증 유발군)은 0.02%의 염화벤잘코늄을 매일 2차례 마우스 의 우안에 점적하였다. 안토시아닌 올리고머 투여군에서는 염화벤잘코늄을 점안하기 시작한 후 3일째부터 각기 다른 농도의 안토시아닌 올리고머 용액을 경구로 투여하였다. 안 토시아닌 올리고머 약제의 투여량은 두 가지 농도(10 mg/
kg, 50 mg/kg)로 하였으며 개체별 투여량은 최근의 측정체 중을 기준으로 산출하였다. 오전 10시에 경구투여용 주사용 기를 이용하여 1일 1회 위내에 투여하였다. 양성대조군에서
안토시아닌 올리고머의 제조
안토시아닌 올리고머는 (주)키토라이프(Pyeongtaek-si, Korea)에서 공급받았으며 그 제조방법은 간략히 다음과 같 다. 세척, 살균한 1톤의 발효탱크에 기질 농도가 10% 되게 포도과피 추출물(포도과피를 물과 에탄올 혼합용매에서 추 출한 원료) 40 kg을 3차 이온수 400 L에 붓고 교반한다.
용해 후 최적화된 기질대 효소비 비율(50:1)로 효소(visco- zyme L)를 넣고 25°C, 120 rpm에서 1주일 동안 발효시킨 다. 반응종료 후 미반응물질을 원심분리(12,000 rpm)로 제 거한 후 여과액을 진공감압농축기를 사용하여 농축한다.
100 L까지 농축한 후 300 L의 95% 주정에탄올을 첨가하여 일정시간 교반한 다음 80 L로 재농축시킨다. 이 농축액을 동결 건조시켜 분쇄하여 안토시아닌 올리고머를 얻었다.
각막 형광염색(fluorescein staining)
먼저 각막을 세극등 현미경(Haag-Streit, Koeniz, Switz- erland)으로 관찰하였으며, 이후 형광염색을 하여 BQ900 세극등에 부착된 코발트블루 조명(Haag-Streit)하에서 관 찰하였다. 각막미란은 NEI grading system에 따라서 정량 화하였다.
눈물막 파괴시간(tear film break-up time, TBUT) 및 눈물 분비량 측정(phenol red test)
눈물막 파괴시간은 0.4 M 플루오레신 검사지(Haag- Streit)를 결막낭에 점적하고 수회 눈을 깜박이게 한 후 세극 등 현미경의 코발트블루 조명하에서 염색된 눈물막 층에서 최초로 건조점(dry spot)이 나타나기까지의 시간을 측정하 여 기록하였다. 눈물 분비량 측정은 실험동물들에게 Ket- amine(60 mg/kg)과 Xylazin(6 mg/kg)을 복강 투여하여 마 취시키고 눈물의 양을 측정하기 위하여 페놀레드 시험지를 마우스의 아래 결막에 위치시킨 후 3분 동안 시험지가 젖는 길이를 측정하였다.
조직검사(hematoxylin and eosin staining, H&E) 10% 포르말린 용액으로 고정된 안구에서 각막을 절제하 여 수세한 다음 탈수 과정을 거쳐 파라핀 포매하였다. 파라 핀 블록을 만든 후 4 µm 크기로 절편하였다. 조직은 0.1%
hematoxylin buffer(Sigma-Aldrich Co., Munich, Ger- many)로 염색한 이후 수세과정을 거친 후 1% Eosin Y(Sig- ma-Aldrich Co.)로 재차 염색을 하였다. 조직 분석은 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
Control BAC AO 10 mg/kg AO 50 mg/kg CA 0.1%
Fig. 1. Microscopic view of the cornea. Epithelial defect (upper arrow) and corneal neovascularization (lower arrow) is observed in the benzalkonium chloride group (B). The corneas of the mouse treated with 10 mg/kg (C) and 50 mg/kg (D) of anthocyanin oligomer were less affected the benzalkonium chloride treatment. Installation of cyclosporine (E) one hour after the insult effectively nullified the effect of benzalkonium chloride. BAC: benzalkonium chloride, AO: anthocyanin oligomer, CA: cyclosporine.
통계처리
본 실험에 대한 모든 실험의 결과는 mean±standard er- ror of means(SEM)으로 표시하였고, 통계적 유의성 검정 은 SAS 9.4 version 프로그램(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 실시하였다. 집단 간의 차이를 알아 보기 위해 일원변량분석(one-way ANOVA)을 이용하여 분 석하였고, 사후검증은 Duncan’s multiple range test에 의 해 P<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
결 과
세극등 현미경하 각막의 관찰
각막을 세극등 현미경으로 관찰하였을 때 대조군(Fig.
1A)과 염화벤잘코늄군(Fig. 1B) 간에 명확한 차이가 나타났 으며, 염화벤잘코늄만을 점안한 군에서는 각막의 신생혈관, 각막상피의 결손, 각막혼탁 등이 관찰되었다. 안토시아닌 올 리고머를 투여한 군(Fig. 1C, 1D)과 사이클로스포린 0.1%
를 점안한 군(Fig. 1E)에서는 이러한 변화의 정도가 염화벤 잘코늄만을 점안한 군에 비해서 저명하지 않았다.
안토시아닌 올리고머의 제조 및 중합체(올리고머) 확인 안토시아닌 올리고머의 제조수율은 60%이고, 안토시안 올리고머의 중합 여부를 정확히 판단하기 위해서 중합되지 않은 단량체를 셀룰로오스막을 이용하여 정제하여 분자량 을 측정하였으며(Mw: 788 Da), 중합체 역시 같은 방법으로 분자량을 측정하여 2,255 Da의 분자량으로 측정되었다(Fig.
2). 또한 다분산지수(polydispersity) 측정값은 1.28로서 균 일한 분자량 분포를 갖는 것을 확인하였다. 안토시아닌 단량 체와 중합체의 합성 여부를 알기 위하여 레오미터(Rhe- ometer, Malvern Panalyical Ltd., Malvern, UK)를 이용 하여 점도를 측정하였다. 각각의 물질을 0.1% acetic acid 를 이용하여 두 가지 농도(10 mg/mL, 2.5 mg/mL)로 제조 한 후 각각을 레오미터 장비를 이용하여 shear rate(0.1
~100 s-1)에 따른 점도를 측정한 결과를 Fig. 2의 C와 D에 각각 나타냈다. Fig. 2C는 10 mg/mL 농도로 제조된 안토시 아닌 단량체와 안토시아닌 중합체의 점도 결과이며, 그 결과 안토시아닌 단량체와 용매 0.1% acetic acid의 점도는 거의
유사한 것을 볼 수 있지만 안토시아닌 중합체와 비교해봤을 때 단량체의 초기값 0.12 Pas보다 3배 정도 높은 값(0.32 Pas)으로 나타났다. Fig. 2D는 2.5 mg/mL 농도로 제조된 안토시아닌 단량체와 안토시아닌 중합체의 점도 결과이며 Fig. 2C의 결과와 유사한 경향성이 확인된다. 이는 용액 중 에 중합체를 많이 함유할수록 비점도(specific viscosity)가 커지는 현상으로 진한 농도에서는 분자 상호 간의 엉킴이나 접촉이 있을 것이 고려되므로 환원점도(reduced viscosity) 가 커지고 묽은 농도가 되면서 그 현상이 점점 적어져서 환 원점도(viscosity number)가 적어지기 때문이다. 즉 시간적 변화와 용액 내에서 두 가지 농도로 두 파라미터 간의 각도 의 시간적 변화로 표시된 전단속도(0.1~100 s-1)에서 안토 시아닌 단당류가 중합체로 변화되어 단당류보다 점도와 분 자량 분포가 모두 높아진 것이다.
각막손상의 정량화
각막을 형광염색(fluorescein staining)한 후 세극 등 현 미경하에서 관찰하였을 때 염화벤잘코늄을 처치한 군(Fig.
3B)에서는 각막의 상피결손에 형광염색들이 관찰되었으며, 각막의 미란 정도가 전반적으로 나타났다. 50 mg/kg의 안 토시아닌 올리고머를 투여한 군(Fig. 3D)과 사이클로스포린 0.1%를 점안한 군(Fig. 3E)에서는 각막미란의 정도가 심하 지 않았으며 각막의 결손이 관찰되지 않았다. 각막미란의 정 도를 NEI grading system에 따라 정량화한 결과 50 mg/kg 의 안토시아닌 올리고머를 투여한 군과 사이클로스포린 0.1%를 점안한 군에서 염화벤잘코늄을 점안한 군과 각막미 란 점수를 비교하였을 때 통계학적인 차이가 관찰되었다 (P<0.001)(Fig. 4). 10 mg/kg의 안토시아닌 올리고머 군은 각막미란 점수가 염화벤잘코늄을 점안한 군에 비하여 낮은 경향을 보이기는 하였으나 통계학적으로 유의하지 않았다.
눈물막 파괴시간 측정 및 눈물분비기능검사
2주 동안 염화벤잘코늄을 점안한 군에서는 대조군과 비 교하여 눈물막 파괴시간의 감소가 현저하게 나타났다(Fig.
5A). 10 mg/kg의 안토시아닌 올리고머를 투여한 군에서는 눈물막의 파괴시간의 변화가 염화벤잘코늄을 점안한 군과 유의한 차이가 없었으나 50 mg/kg의 안토시아닌 올리고머
C D
Fig. 2. Molecular-weight analysis of anthocyanin oligomer. The average molecular weights and its distribution of anthocyanin oligomer and monomer were measured by gel permeation chromatography (GPC, Tosoh, Wertheinm, Germany) using an sodium nitrate (0.02 N, pH 7, 30°C) as elution solvent. Flow rate was set to 0.8 mL/min. The molecular weight of anthocyanin monomer and anthocyanin oligomer were 788 Da and 2,255 Da respectively. (C, D) Rheological analysis of anthocyanin oligomer and anthocyanin monomer according to diverse concentration using a rheometer. (A) 10 mg/mL and (B) 2.5 mg/mL.
Control BAC AO 10 mg/kg AO 50 mg/kg CA 0.1%
Fig. 3. Fluorescein staining of cornea. Staining of the epithelial defect (gray arrow) is seen in the benzalkonium chloride treated group (B). Diffuse superficial punctate erosions (white arrow) were seen in the 10 mg/kg (C). Anthocyanin oligomer treated group whereas the corneas of 50 mg/kg anthocyanin oligomer (D) and cyclosporine treated group (E) are relatively clear. BAC: benzalkonium chloride, AO: anthocyanin oligomer, CA: cyclosporine.
를 투여한 군과 0.1% 사이클로스포린을 점안한 군에서는 눈물막 파괴시간의 증가가 나타났고 통계학적으로 유의하였 다(P<0.01). 시험 시작 2주 후 페놀레드(phenol red) 시험지 로 측정한 눈물분비량의 측정에서는 Fig. 5B와 같이 50 mg/kg의 안토시아닌 올리고머를 투여한 군과 사이클로스 포린 0.1%를 점안한 군이 염화벤잘코늄만을 점안한 군과 비교하여 눈물분비량의 측정값이 유의하게 증가하였다(P<
0.01).
조직검사
H&E 조직염색을 시행한 결과 14일 동안 염화벤잘코늄을 점안한 군(Fig. 6B)에서는 대조군(Fig. 6A)과 비교하였을 때 각막상피층의 각질화 및 두께의 증가가 저명하게 나타났 다. 이에 비하여 안토시아닌 올리고머를 투여한 군과 사이클 로스포린을 점안한 군에서는 각막상피층의 두께 증가 정도 가 대조군과 비교하였을 때 명확하지 않았으며 각막상피층 의 각질화도 저명하게 관찰되지 않았다.
Fig. 4. Measurement of corneal fluorescein staining score. The scores were evaluated according to NEI grading system and there was a significance difference between the benzalkonium chlor- ide treated group and 50 mg/kg anthocyanin oligomer treated group (P<0.001). Cyclosporine eye drop was also effective in reducing the fluorescein staining scores (P<0.001). BAC: ben- zalkonium chloride.
A
B
Fig. 5. Evaluation of the tear film break-up time (TBUT) and the phenol red thread test. (A) As shown here, TBUT was sig- nificantly prolonged in the 50 mg/kg anthocyanin oligomer treat- ed group and cyclosporine treated group (P<0.01). However, this effect was not observed in the 10 mg/kg anthocyanin oligom- er treated group. (B) In the phenol red thread test, the measure- ments were significantly higher in the 50 mg/kg anthocyanin oligomer treated group and cyclosporine treated group (P<0.01).
BAC: benzalkonium chloride.
A B
C D E
Fig. 6. Hematoxylin and eosin staining of the cornea. In the benzalkonium chloride treated cornea, the epithelial layer has been thickened (B, double side arrow) compared to the control (A, double side arrow). In the drug treated group, the thickening of the epithelial layers was not observed. BAC: benzalkonium chloride, AO: anthocyanin oligomer, CA: cyclosporine.
고 찰
안구건조증은 눈물막의 증가한 삼투압과 안구 표면의 염 증이 동반된 눈의 불쾌감, 시각장애, 눈물막의 불안정성을 유발하는 눈물과 안구 표면의 다인적 질환으로 정의되고 있 다. 고삼투압성 눈물이 안구 표면에서의 염증반응을 활성화 시키며 염증 관련 매개체들이 눈물로 분비되어 안구 표면 상 피를 손상시키게 되고 눈물막의 불안정성이 유발되어 결국 눈물의 삼투압 증가로 다시 이어지는 악순환이 주요 기전으 로 생각되고 있으며, 그 외 눈물샘의 눈물 분비 감소, 눈꺼풀 질환으로 인한 눈물 증발의 증가 등 여러 요인이 관련된 질
환이다(Lemp, 2007). 따라서 지금까지 대증요법으로 사용 했던 인공누액의 점안이나 눈물점 마개를 통한 눈물량의 증
으로 사용되고 있다(Her 등, 2006; Pflugfelder, 2004;
Tatlipinar와 Akpek, 2005; Mrukwa-Kominek 등, 2007;
Creuzot 등, 2006). 또한 최근에는 산화적 스트레스에 관심 이 많아지면서 관련된 연구들이 활발하게 이루어지고 있는 데 산화적 스트레스가 안구건조증에 있어서 각막 상피손상 과 관련이 있고, 염증반응에 활성산소가 관여되어 있어 산화 적 스트레스를 억제함으로써 안구건조증을 치료하고자 하 는 시도가 활발하게 이루어지고 있다(Nakamura 등, 2007;
Dogru 등, 2018).
안토시아닌은 항산화 효과에 대해 현재 활발하게 연구되 고 있는 물질로 본 연구는 이런 항산화 효과가 안구건조증 예방 및 치료에 효과가 있을 것이라는 가설을 바탕으로 진행 되었고, 염화벤잘코늄으로 유도된 안구건조증 모델에서 안 토시아닌 올리고머가 안구건조증의 다양한 지표 개선에 효 과가 있음을 실험적인 방법으로 보여주었다. 특히 본 연구에 서는 현재 사용되고 있는 사이클로스포린 0.1% 점안액을 양성대조군으로 사용하여 비교함으로써 본 연구에 사용된 관심물질이 기존의 점안제재와 비교하여 어떠한 효과가 있 는지를 알아보고자 하였다. 본 연구에서 염화벤잘코늄을 14 일간 점안한 군에서는 대조군과 비교하여 각막의 각질화 및 각막미란의 증가, 형광염색 정도의 증가, 눈물분비량의 감소 가 유의하게 나타났다. 양성대조군인 0.1% 사이클로스포린 점안군에서는 각막의 각질화 감소, 각막미란의 유의한 감소, 형광염색 정도의 유의한 감소, 눈물분비량의 증가가 나타났 으며, 고농도의 안토시아닌 올리고머(50 mg/kg)를 투약한 군에서도 사이클로스포린 점안군과 유사하게 안구건조증의 지표가 개선됨이 관찰되었다.
싸이클로스포린 점안제는 각결막 상피의 면역 활성 마커 (예, human leukocyte antigen-antigen D), 세포자멸사 마 커(예, Fas) 및 염증성 사이토카인(예, interleukin-1α, in- terleukin-1β, TNF- α) 등을 감소시키는 등의 다양한 기전 으로 안구표면의 염증반응을 감소시켜, 안구건조증의 증상 개선은 물론 눈물막 파괴시간의 증가 및 눈물 분비량 증가 등 임상적으로 측정하는 객관적 안구건조증의 지표 개선에 효과가 있음이 알려져 있다. 또한 다른 연구에서는 싸이클로 스포린의 점안 치료가 눈물층의 점액 분비를 담당하는 결막 술잔 세포의 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라 마이봄샘 기능부 전 치료에도 효과가 있어 안구건조증의 다양한 병인을 해결 해줄 약물로 주목받고 있다(Kunert 등, 2002; Prabhasa- wat 등, 2012). 본 연구에서 고용량의 안토시아닌 올리고머 를 복용한 군에서 사이클로스포린을 점안한 군과 유사한 지 표의 변화를 보였다는 점은 고무적이다. 현재 안구건조증의 치료에서 경구 약제의 역할은 제한되어 있으며 임상적으로
향상시켜 안구건조증의 증상을 호전시킨다고 알려진 오메 가-3 정도가 있을 뿐이다(Zhu 등, 2014; James 등, 2000;
Endres 등, 1989).
염화벤잘코늄은 점안제에 가장 많이 쓰이는 보존제이지만 장기간 사용할 시에는 독성 문제를 나타낼 수 있다. 특히 염 화벤잘코늄으로 유발되는 안구건조증은 염증 유발, 눈물막 파괴, 각막 세포 손상 등 사람의 안구건조증 병리와 유사한 형태로 나타나기 때문에 유발 모델로써 안구건조증 치료 연 구에 많이 사용된다(Rolando 등, 2001; Yee 등, 2006; Lin 등, 2011; Kim 등, 2016). 염화벤잘코늄은 다양한 기전으로 세포독성을 나타내는데 대표적인 기전이 산화스트레스(ox- idative stress)와 과산화손상(peroxidative damage)이다 (Antunes 등, 2016). 또한 상기 연구에서 장기간 염화벤잘 코늄에 노출될 경우 아세틸콜린에스테라제(acetylcholin- esterase)의 농도가 증가하여 다양한 형태의 신경독성이 나 타날 수 있음이 알려졌다. 본 연구에서는 이러한 산화스트레 스를 유발하는 염화벤잘코늄을 이용하여 각막세포의 산화스 트레스를 유발한 후 항산화 작용이 있는 안토시아닌 올리고 머를 경구 투여함으로써 그 효과를 관찰하고자 하였다. 최근 에는 본 실험에서 사용한 안토시아닌 올리고머를 안구의 망 막세포의 산화스트레스 모델에 적용하여 항산화 효과를 관 찰한 연구가 발표되었다(Hwang 등, 2012). 흥미로운 것은 안토시아닌 올리고머의 항산화 효과가 기존에 알려진 다양 한 항산화제만큼 우수하였다는 점이다. 관심물질의 생리활 성은 흡수율이나 대사율 등 또한 고려되어야 하므로 결론을 낼 수는 없지만, 안토시아닌은 중합체가 기존의 단량체보다 는 생리활성이 우수할 것으로 생각되기 때문에 기존의 단량 체와 비교하였을 때 생리효과 면에서 우수할 수 있다는 것을 가정해 볼 수 있다. 또한 현재 안구건조증에 명확하게 그 효 과가 입증된 경구투여 제재가 없는 상황에서 본 연구는 현재 안구건조증 치료에 있어서 천연물 소재를 적용함으로써 안 구건조증 치료에 있어서 또 다른 한 방법을 제시했다는 점에 의의가 있다. 본 연구 결과로 점안제가 아닌 경구 약제로서 항산화제인 안토시아닌 올리고머의 안구건조증에 대한 긍 정적인 임상효과를 예상해 볼 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구 결과에서 제시하지는 않았지만 연구진은 마우스 의 눈물샘에 대한 조직 분석도 같이 시행하였다. 비록 통계 학적으로 유의성을 찾을 수는 없었지만 벤잘코늄 클로라이 드만을 점안한 군의 눈물샘에서는 다양한 정도의 형질세포 (plasma cell)의 침윤이 관찰되었으며, 안토시아닌 올리고 머와 사이클로스포린을 투약한 군에서는 이러한 염증세포 의 침윤의 정도가 덜하였다. 조직학적으로 눈물샘의 염증 정도에 대한 정량화 방법은 어려운 점이 많기에 정확한 정량
화는 어려웠지만 적어도 본 연구에서 사용된 안구건조증 모 델에서 안토시아닌 올리고머가 효과가 있었던 것은 관심물 질이 지니고 있는 강력한 항산화 작용에 의한 염증 억제 효 과와 이에 따른 고삼투압을 완화시킴으로써 눈물막의 안정 화에 작용했기 때문으로 추정된다.
요 약
본 연구에서는 안토시아닌 올리고머(50 mg/kg)가 염화벤 잘코늄으로 유발된 안구건조증에서 다양한 안구건조증 지 표의 개선에 효과가 있음을 보여주었다. 본 연구에서 염화벤 잘코늄을 안구에 점안하였을 때 안구표면에 다양한 반응이 나타났다. 염화벤잘코늄이 각막상피세포에 직접적인 손상 을 주어서 각막상피세포의 편평상피화생(squamous meta- plasia)이 나타났고 다양한 염증세포의 각막침윤이 관찰되 었다. 이상의 결과로 보아 염화벤잘코늄을 이용한 안구건조 증 유발 모델에서 안토시아닌 올리고머는 염화벤잘코늄의 점안 이후에 나타나는 다양한 염증성 사이토카인의 증가 및 이로 인한 세포 사멸을 억제함으로써 각막표면상피세포의 편평상피화생을 막아 안구건조증에 나타나는 다양한 변화 를 개선시키는 것으로 추정해볼 수 있다. 이러한 안구건조증 에서 안토시아닌 올리고머의 효과는 항염 작용과 더불어 안 토시아닌이 본래 가지고 있는 강력한 항산화 작용에 의한 것으로 생각된다. 특히 본 연구에 사용된 안토시아닌은 단량 체가 아닌 중합체로써 기존의 단량체보다 생리활성이 높을 것으로 생각되는데, 향후 추가적인 연구를 통하여 중합체의 우수한 생리활성이 추가로 규명된다면 다양한 안과영역에 서 관심을 받을 것으로 생각된다. 안구건조증은 치료가 쉽지 않고 환자의 삶의 질까지 영향을 미치는 질환이다. 치료가 잘 되지 않는 이유 중에 하루에도 수차례씩 치료 약제를 점 안하여야 하므로 환자의 순응도가 떨어지는 점이 있는데 경 구 약제가 이러한 점을 보완해줄 수 있을 것이라 생각된다.
향후 좀 더 장기적인 연구, 염증 관련 단백질 분석 등과 점안 제와 동시에 복용했을 경우의 효과 등에 대한 추가적인 연구 가 필요할 것으로 생각된다.
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