22(3)-327-334-2009] 넙치, Paralichthys olivaceus에 투여된 Edwardsiella tarda와 Streptococcus iniae에 대한 혼합백신의 예방효과와 성장에 미치는 영향

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J. Fish Pathol., 22(3)

：

327 ~ 334 (2009)

327 327

�Corresponding Author :

성공적인 어류 양식을 위해서는 환경, 영양, 질병 관리가 조화를 이루어야 하지만 생산량을 증가시키기 위한 과정에서 질병이 발생하고 있 고 질병 치료를 위해 항균제 등을 사용하고 있 다. 그러나 내성균의 출현 (Karunasagar et al., 1994)으로 세균성 질병의 치료가 어려워지고 있 고 넙치에서 분리된 Edwardsiella tarda에 적어 도 두 종류 이상의 thansferable R plasmid가 분 포한다는 것이 알려졌으며 (김, 1999) E. tarda의 transferrable R plasmid 를 분석하여 일본의 뱀장 어 양식장에 R plasmid가 광범위하게 분포하고

있다고 알려져 있어 (Aoki et al., 1986) 항균제에 의한 치료보다 질병의 예방을 위한 백신의 개발 이 필요하다고 생각된다.

최근 국내 양식 산업에 있어서 어류의 생물학 적 원인체, 즉 바이러스, 세균 및 기생충 등에 의한 질병은 하나의 미생물에 의한 감염 보다는 두 가지 이상의 미생물에 의한 복합감염의 경우 가 증가하고 있다 (김 등, 2006). E. tarda의 감염 에 의한 넙치의 에드와드병은 복부팽만, 탈장 등의 증상을 나타내고 (Kanai, 1993) 국내에서 하절기 양식어류에서 분리되었으며 (김 등,

넙치, Paralichthys olivaceus에 투여된 Edwardsiella tarda와 Streptococcus iniae에 대한 혼합백신의 예방효과와 성장에 미치는 영향

김명석

^�

∙김경덕

^�

∙김강웅

^�

∙박명애∙김진우

^��

국립수산과학원 병리연구과,

^�

국립수산과학원 양식관리과,

^��

국립수산과학원 수산동물방역센타

The efficacy and influence on growth of olive flounder Paralichthys olivaceus vaccinated against Edwardsiella tarda and Streptococcus iniae

Myoung Sug Kim^�, Kyoung-Duck Kim^�, Kang-Woong Kim^�, Myoung Ae Park and Jin Woo Kim^��

Pathology Division, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-902, Korea

�Aquaculture Management Division, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-902, Korea

��Aquatic Animal Disease Control Center, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-902, Korea

This study was performed to verify the efficacy and safety of vaccine mixed formalin killed Edwardsiella tarda and formalin killed Streptococcus iniae in olive flounder Paralichthys olivaceus. Sera were obtained from each group at 2, 4, 6 and 8 weeks after vaccination and agglutination titers to E. tarda and S. iniae were determined using the microtiter method. Three weeks after vaccination, the fish challenged by intraperitoneal injection of E. tarda or S. iniae and immunization resulted in a relative percentage survival (RPS) of above 81.0~92.8%. Neither the groups vaccinated nor control groups resulted in significantly reduced weight gain 140 days post-vaccination, but differences between the groups vaccinated and control groups were found at the early days post-vaccination. This results suggest that it is possible to prevent edwardsiellosis and streptococosis after a vaccination without affecting growth of olive flounder.

Key words: Vaccination, Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Paralichthys olivaceus

�Corresponding Author : Myoung Sug Kim, Tel : 051-720-2482 Fax : 051-720-2498, E-mail : [email protected]

14...

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2006) 그람양성 구균인 Streptococcus iniae는 다 양한 어종에서 분리되는 것으로 보고되어 있고 (김 등, 2005) 우리나라에서는 넙치에 감염되어 β-용혈성 연쇄구균증을 일으켜 폐사를 일으키는 (우 등, 2006) 주요 어류 병원체로 알려져 있다.

국외에서는 여러 질병을 동시에 예방하기 위한 혼합백신에 관한 연구가 보고되고 있는데 (Sakai et al., 1993; Sakai et al., 1995) 에드와드병 과 β-용혈성 연쇄구균증은 국내 양식 생산량의 가장 큰 비율을 차지하는 넙치에 발생하는 대표 적인 질병이며 발병시기가 하절기라는 공통점 이 있어 혼합백신의 대상이 될 수 있다.

백신을 사용하는 가장 큰 목적은 질병에 걸리 지 않고 건강한 어류를 길러내는 것이라 할 수 있지만 백신을 접종한 후 성장이 저하되는 경우 (Midtlyng et al., 1996), 주사부위에 상처가 생기 는 경우 (Midtlyng et al., 1996; Sorum and Dams- gard, 2004)와 같이 백신 투여에 의한 부작용이 발생하게 되면 양식장에서 백신의 사용을 기피 하는 현상이 발생하게 될 것이다. 그러므로 백 신의 안전성 확보는 백신의 효능 향상보다 더 중요한 의미를 갖는다고 할 수 있다. 이번 연구 에서 E. tarda와 S. iniae에 대한 혼합백신을 투여 한 넙치에서 항병력과 성장의 변화를 조사하고 자 하였다.

재료 및 방법

실험어 및 사육환경

실험어는 국립수산과학원에서 경제형질의 유 전적 향상을 위해 육종 프로그램에 의해 생산된 건강한 육종 넙치 (평균체중 75 g)와 민간 양식 장에서 생산된 일반 넙치 (평균체중 64 g)를 사 용하였고 지름 3.5 m, 10톤 원형수조에 동일한 사육밀도가 되도록 400마리씩 수용을 하였다.

사료는 배합사료 (EP)를 사용하였으며 사료공급 량은 어체중의 0.1~3.5%를 1일 2~3회 공급하였 으며 급이 횟수, 수온, 환수량 등 모든 양식 조 건을 동일하게 사육하였다. 실험은 수온 하강기

부터 저수온기 (2007. 9. 26~2008. 2. 19)에 실시 되어 실험기간 중의 수온은 23.1℃에서 10.3℃

로 낮아졌다 (Fig. 1).

백신 제작

E. tarda와 S. iniae를 1% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion broth (BHIB)에 각각 접종하여 25

℃에서 24시간 동안 배양하였으며 세균 배양액 에 포르말린 (37% formaldehyde)을 최종적으로 0.3% 농도가 되도록 처리하여 실온에서 1시간 정치한 후 4℃에서 24시간 동안 두어 불활화 시 켰다. 불활화된 각각의 세균 배양액은 6,520 rcf 에서 20분 동안 원심분리하여 수확하였고 0.02% NaN³가 첨가된 멸균 생리식염수에 습중 량 100 mg/mL의 농도로 희석하여 4℃에 보관 하였다.

백신 투여

포르말린으로 불활화시킨 E. tarda와 S. iniae를 멸균 생리식염수로 희석하여 혼합한 후 MS-222 로 마취된 넙치의 복강 내에 0.1 mL를 주사하였 고 최종 투여량은 어체중 1 kg에 각각 10 mg이 되도록 투여하였다.

항체가 측정

백신 투여 후 2주, 4주, 6주, 8주째에 각각의 Fig. 1. Fluctuations of seawater temperatures during this experiment. (→ : vaccination ; 2007.9.26~2008.2.19)

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실험구에서 10마리를 채혈하였다. 혈액은 4℃에 서 overnight 동안 보관한 후 8,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고 E. tarda 와 S. iniae에 대한 항체가의 변화를 microtiter 법으로 조사하였다.

상대생존율 조사

백신주사 후 3주째 E. tarda와 S. iniae를 인위 감염시켜 2주간의 백신구와 대조구의 폐사율과 상대생존율을 조사하였다. 멸균 생리식염수에 현탁한 E. tarda와 S. iniae를 넙치에 0.1 mL 복강 주사하여 균수가 7.5 × 10⁴cfu/fish (E. tarda)과 2.8 × 10⁸cfu/fish (S. iniae)가 되도록 하였고 수 온은 22 ± 1℃로 조절하였다. 인위감염에 사용 된 실험어의 수는 각각의 실험구별로 16 마리이 었다. 상대생존율 (Relative percent survival, RPS) 은 RPS=(1-백신 접종군 누적 폐사율/대조군 누적 폐사율)×100 의 산출식으로 구하였다.

성장률 및 생존율 조사

백신 주사 6일 전, 백신 주사 후 20일, 48일, 76일, 104일, 140일 경과 후에 실험구별로 50 마리씩 무게를 측정하여 평균체중을 조사하였 고 매일 폐사어 수를 확인하여 생존율의 변화를 조사하였다.

통계 분석

결과의 통계적 처리는 SigmaPlot을 이용하여 student's t-test로 실시하였으며, P<0.05 일 때 유 의한 차이가 있는 것으로 간주하였다.

결 과

혼합백신 투여 후 항체가의 변화

혼합백신을 주사한 넙치에서 2주 간격으로 채 혈하여 E. tarda와 S. iniae에 대한 항체가의 변 화를 조사하였으며 E. tarda에 대한 항체가는 모 든 실험구에서 백신 접종 2주 후부터 2¹¹ 이상 으로 높게 나타났고 8주 후에도 2⁸ 이상으로 높 게 형성되었다 (Fig. 2). S. iniae에 대한 항체가는 2주 후부터 측정되었으나 실험기간 중 최고 2⁴ 이하로 에드와드균에 대한 항체가 보다 낮게 형성되었다 (Fig. 3). 대조구에서는 실험기간 중 에 E. tarda와 S. iniae에 대한 항체가가 측정되 지 않았고 백신을 투여한 육종어와 일반어의 항 체가 변화는 E. tarda에 대한 6주째의 항체가를 제외하고 유의적인 차이가 없었다.

상대생존율

백신 투여 후 3주째에 E. tarda를 인위감염 시

Fig. 2. Change in agglutination titers against Edwardsiella tarda FKC of serum collected from olive flounder vaccinat- ed with mixed vaccine. (-●-, breeding flounder; -□-, normal flounder)

Fig. 3. Change in agglutination titers against Streptococcus iniae FKC of serum collected from olive flounder vaccinat- ed with mixed vaccine. (-●-, breeding flounder; -□-, normal flounder)

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켰을 때 대조구의 누적폐사율은 81.3~87.5%이고 백신구의 누적폐사율은 6.3%이었다. S. iniae를 인 위감염 시켰을 때 대조구의 누적폐사율은 87.5~100% 이었으며 백신구의 누적폐사율은 12.5~18.8% 이었다. 상대생존률은 E. tarda에 대 하여 92.3~92.8%, S. iniae에 대하여 81.0~85.2%로 백신구에서 높은 상대생존율을 보여 혼합백신에 의한 항병력의 증가가 확인되었다 (Table 1).

체중의 변화

백신 주사 후 초기에 백신구가 대조구에 비해 체중이 가벼웠으나 사육기간이 길어지면서 체 중이 회복되어 대조구와 차이를 보이지 않았다 (Table 2). 육종어 실험구는 백신 접종 후 48일째 에 백신구의 평균체중은 231.2 g, 대조구의 평균 체중은 243.1 g이었으며 76일째에 백신구의 평 균체중은 286 g, 대조구의 평균체중은 291 g으로 백신구의 체중이 가벼웠으나 104일 이후에는 차이가 없고 140일째에는 백신구의 체중이 대 조구보다 무거웠다. 일반어 실험구는 백신 접종 후 48일, 76일, 104일째에 백신구의 평균체중은 220.2 g, 273.0 g, 311.8 g이었고 대조구의 평균체 중은 231.8 g, 291.2 g, 325.8 g, 355.4 g으로 백신 구의 체중이 가벼웠으나 140일째에는 차이가 없었다.

생존율의 변화

백신 접종 후 140일째의 육종 백신구의 생존 율은 98.8%, 육종 대조구는 98.2%, 일반 백신구 는 88.9%, 일반 대조구는 89.1%로 육종어의 생 존율이 일반어의 생존율 보다 높았고 백신구와 대조구 사이의 차이는 없었다 (Table 3).

고 찰

국내에서는 에드와드병과 베타 용혈성 연쇄구 균증의 예방을 위해 단독백신이 상품화 되어 있 거나 혼합백신 개발에 관한 연구가 진행되는 과 정에 있어 앞으로는 항균제에 의한 세균성 질병

의 치료보다 백신 접종에 의한 질병의 예방이 보편화 될 것으로 기대되고 있다.

이번 연구에서 혼합백신을 투여한 후 에드와 드병과 베타 용혈성 연쇄구균증에 대한 항병력 이 확인되어 대조군의 누적폐사율이 최소 60%

의 폐사율을 보일 때 접종구의 상대생존율을 산 출하여 접종군의 상대생존율이 60% 이상이어야 하며 이 때, 폐사어체는 전형적인 질병의 증상을 보이거나 공격 접종균이 분리되어야 하는 우리 나라의 수산용 백신의 검정 기준 (문 등, 2007) 을 충족하였다. 즉, 혼합백신을 투여한 후 E. tar- da와 S. iniae를 인위감염 시켜 상대생존율을 조 사하였을 때 E. tarda를 인위감염 시켰을 때의 상대생존율은 92.3~92.8%이고 S. iniae에 대하여 81.0~85.2%로 모두 국가 검정기준을 충족하여 백신으로서의 효능이 확인되었다.

넙치에서 S. iniae에 대한 항체가가 E. tarda에 대한 항체가 보다 낮고 일부 실험어에서 응집항 체가가 확인되지 않았지만 S. iniae를 인위감염 시켰을 때에는 항병력을 나타내었다. 차넬메기 에서 Edwardsiella ictaruri에 대한 항체가는 방어 력과 관련이 있어 차넬메기의 항체가가 256 이 상인 경우에 E. ictaruri의 감염실험에 방어력을 나타낸다고 하였으나 (Vinitinantharat and Plumb, 1993) 무지개송어에 경구투여와 침지로 Vibrio anguillarum에 대한 백신을 투여한 경우에 2차 접종을 하기 전에는 ELISA로 검출하기에 특이 적 항체가가 낮았지만 인위감염에 대해 88.2~100%의 상대생존율을 나타내어 (Palm Jr.

et al., 1998) 항체가의 수준이 방어력과 항상 연 관성이 있다고 볼 수는 없다고 생각된다. Thu- vander 등 (1987)은 낮은 항체가의 의의는 명확 하지 않지만 백신을 투여한 군집에서 특이 항체 가 존재하는 어류가 확인 되는 것은 전체 군집 이 방어력을 갖는 것을 의미한다고 하여 이번 연구에서 혼합백신을 투여한 넙치에서 S. iniae 에 대한 항체가가 낮은 이유와 관련이 있을 것 이라 생각된다. Paterson 등 (1981)은 formalin- killed Renibacterium salmoninarum를 Freund's

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Table 3. Survival rate (%) for flounders from 6 days before vaccination to 140 days after vaccination with mixed vaccine

Experimental times

Breeding flounder Normal flounder

vaccine control vaccine control

6 days before vaccination 100 100 100 100

20 days after vaccination 99.3 99.7 98.1 96.5

Table 1. Cumulative mortality (%) and relative percentage survival (RPS) of Edwardsiella tarda and Streptococcus iniae intraperitoneally (IP) vaccinated and non-vaccinated olive flounder Paralichthys olivaceus, IP challenged with Edwardsiella tarda or Streptococcus iniae

Table 2. Body weight (g) of olive flounders vaccinated with mixed vaccine in the breeding and normal groups during 146 days

Experimental times

Breeding flounder Normal flounder

vaccine control vaccine control

6 days before vaccination 75 75 64 65

20 days after vaccination 151 152 132 150

Group

Edwardsiella tarda Streptococcus iniae

Cumulative mortality (%) RPS (%) Cumulative mortality (%) RPS (%)

Breeding flounder

vaccine 6.3 92.3 12.5 85.7

control 81.3 - 87.5 -

Normal flounder

vaccine 6.3 92.8 18.8 81.0

control 87.5 - 100.0 -

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complet adjuvant (FCA)와 혼합하여 투여하였을 때 높은 항체가를 나타내지만 adjuvant 없이 대 서양 연어에 투여하였을 때에는 응집항체가가 측정되지 않았다고 하였고 Sakai 등 (1993)은 R.

salmoninarum가 다른 병원체에 비해 항체 유도 능이 낮을 것이라고 하였다. S. iniae는 E. tarda에 비해 항체 유도능이 낮을 것이라고 생각되며 2 차 접종을 하거나 adjuvant를 사용하면 항체가가 높아질 수 있을 것이라 생각되나 추가적인 조사 가 필요하다.

어류의 면역반응은 성장수온 범위 내에서 저 수온에서는 늦고 고수온에서는 빠르다고 하였고 (Ellis, 1988), 하절기에 면역 처리된 넙치는 면역 3주째에 항체가가 최고치를 나타내었고 동절기 에 떨어지며 이후 수온상승과 함께 다시 증가하 였으며 수온을 인위적으로 조절하여 수온 20℃

에서 면역시킨 넙치는 항체 형성이 최고로 된 후 수온을 13℃로 변경시키면 상승하였던 항체 가가 서서히 떨어진다고 하였다 (방과 박, 1994). 이러한 보고와 비교하여 이번 연구가 수 온 하강기에 실시되었으나 백신접종 후 3주 동 안 19.5℃ 이상의 수온이 유지되었기 때문에 넙 치에 면역유도가 적절히 이루어져 백신접종 후 2주째에 E. tarda에 대한 항체가가 평균 2¹¹이상 이었고 8주째에 2⁸이상 유지되었다고 생각된다.

백신 주사 후 백신구의 평균체중은 대조구에 비해 감소하였으나 백신 주사 후 육종어는 104 일째에 백신구와 대조구의 평균체중의 차이가 없어졌고 일반어는 140일째에 체중이 같아졌는 데 이렇게 체중의 차이가 생긴 원인은 초기에 백신주사를 위해 1~2일 동안 사료를 주지 않는 절식, 백신 주사를 위한 핸들링과 마취, 주사에 의한 스트레스 등이라고 생각이 된다. 실험기간 동안에 폐사한 모든 실험어의 병원체 감염검사 를 실시하지 못하였으나 일부 실험어에서 Vibrio sp.와 Streptococcus sp.가 분리되었는데 (data not shown) 이러한 병원체의 감염도 실험구의 성장 과 생존에 영향을 미쳤을 것으로 생각된다. 백신 투여 후의 성장률 변화에 관한 조사는 많이 이

루어져 있지 않지만 핀란드에서 Pylkko 등 (2000)은 쿤자 연어, Salvelinus alpinus에 oil- based vaccine을 투여한 후 10℃에서 20일간 기 르고 그 후 10.3℃, 14.1℃, 18.1℃에서 7주 동안 길러 성장률의 변화를 백신이 투여되지 않은 대 조구와 비교하였다. 백신 투여 후 처음 20일은 대조구의 성장률이 높았으나 그 후 10.3℃와 14.1℃에서는 백신구의 성장률이 높아 7주 후에 는 백신구와 대조구의 체중 차이가 없었고 18.1

℃에서는 7주 동안의 백신구와 대조구의 성장률 차이가 없었으나 초기 20일 동안의 성장률 저하 의 영향 때문에 체중 차이가 생겼다고 보고하여 백신의 투여가 10.3~14.1℃ 사이에서 성장저하 와 같은 부정적인 영향이 없다고 하여 이번 연 구와 동일한 결과를 보여주고 있다. 그리고 Mikkelsen 등 (2004)도 대서양 대구, Gadus morhua에 oil-adjuvanted vaccine을 투여 하였을 때 백신 접종 후 12주 동안 체중 증가율이 감소 하지 않았다고 보고하였다. 이번 연구의 전체 기 간을 통해서 백신구와 대조구의 성장에 차이가 없었으나 어류의 성장은 수온의 영향을 많이 받 기 때문에 (Britz et al., 1997; Azevedo et al., 1998;

이 등, 2004) 수온이 높은 시기에 백신 접종을 하였을 때 성장의 차이를 조사할 필요가 있을 것으로 생각된다.

이번 연구에서 넙치에 혼합백신을 복강주사로 투여하였을 때 체중 감소의 부작용 없이 E. tarda와 S. iniae에 대한 항병력 증가 효과가 확인 되었다.

요 약

본 연구는 넙치, Paralichthys olivaceus에서 Edwardsiella tarda와 Streptococcus iniae에 대한 혼합백신의 효능과 안전성에 대해 조사하고자 하였다. 혼합백신을 주사한 넙치에서 2, 4, 6, 8주 째에 채혈하여 E. tarda와 S. iniae에 대한 항체가 를 microtitre 법으로 조사하였다. 백신 주사 후 3 주째에 E. tarda와 S. iniae를 각각 인위감염 시켰 을 때 백신구에서 81.0~92.8%의 높은 상대생존

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율을 보여 혼합백신에 의한 항병력의 증가가 확 인되었다. 백신 주사 후 초기에 백신구가 대조 구에 비해 체중 증가가 느렸으나 사육기간이 길 어지면서 회복되어 대조구와 백신구 체중의 차 이를 보이지 않았다. 이 결과는 백신 주사가 넙 치의 성장에 영향을 주지 않고 에드와드병과 연 쇄구균증을 예방할 수 있음을 보여준다.

감사의 글

이 연구는 국립수산과학원 (양식생물 백신연 구, RP-2009-AQ-077)의 지원에 의해 운영되었 습니다.

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Manuscript Received : July 17, 2009 Revised : November 25, 2009 Accepted : December 7, 2009