The Efficacy and Safety on Combination Vaccines : Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae and S. parauberis, in Olive flounder, Paralichthys olivaceus

JFMSE, 26(6), pp. 1193 1200, 2014. www.ksfme.or.kr 수산해양교육연구 제 권 제 호 통권 호, 26 6 , 72 , 2014. http://dx.doi.org/10.13000/JFMSE.2014.26.6.1193

.

Ⅰ

국내 양식 생산량은 해마다 지속적으로 증가하 고 있으나 장기간 연작은 양식장 환경의 악화를 초래하고 양식장 환경의 악화는 질병 발생으로 이어지고 있다.

수산동물의 질병발생을 예방하기 위해서는 양 식장 환경 개선 등의 외부적 요인도 중요하겠지 만 근본적으로는 수산용 백신의 사용으로 어류

면역력을 증가시켜 질병을 예방하는 것이 질병에 의한 피해도 줄이고 항생제 사용량도 감소시키는 것이 필요하다(Jeong et al., 2006).

해산 양식어류에 피해를 주는 세균성 질병으로 는 어종에 따라 약간의 차이는 있으나 연쇄구균 증 비브리오병 에드워드병 활주세균증 등이 보, , , 고되고 있다 이러한 양식생물의 질병 문제는 단. 순히 폐사에 의한 생산성 감소와 치료 약제사용 에 의한 생산 비용 증가 등으로 인한 직접적인 Corresponding author : 051-720-2491, [email protected]

(2014 ) .

넙치, Paralichthys olivaceus에서 Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae와 S. parauberis 혼합백신의 효능 및 안전성 연구

권문경 황지연 정승희 국립수산과학원

( )

The Efficacy and Safety on Combination Vaccines : Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae and S. parauberis, in Olive flounder, Paralichthys

olivaceus

Mun-Gyeong KWONㆍJee Youn HWANG Sung Hee JUNGㆍ (National Fisheries Research & Development Institute)

Abstract

Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae and S. parauberis are main bacterial pathogens in aquaculture farms of olive flounder, Paralichthys olivaceus. We have discussed the efficacy and safety of 3 type-combined vaccines (A: S. iniae 1mg + S. parauberis 1mg + E. tarda 1mg, B: S. iniae 1mg + S.

parauberis 1mg + E. tarda 0.5mg, C: S. iniae 1.5mg + S. parauberis 1.5mg + E. tarda 1mg) through intraperitoneal injections in olive flounder. None of the vaccines gave rise to any signigicant side effects on histopathology and blood chemistry. The antibody titers and lysozyme activities of A type were higher than those of B, C and control. Four weeks after vaccination, RPS (relative percent survival rates) was 62.5~75% (A type), 50~66.7% (B type) and 55.6~62.5% (C type) respectively. As the results, the combined vaccines are possible to prevent edwardsiellosis and streptococcosis, and A type : S. iniae 1mg + S. parauberis 1mg + E. tarda 1mg, is the most effective out of them.

Key words : Olive flounder, Bacterial infection, Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Pathogenicity

피해뿐만 아니라 치료 약물의 어체 내 잔류 우려 로 양식 산업의 존립기반을 위협하는 근본 요인 으로 작용하고 있다.

넙치는 우리나라 양식어류 생산량의 50% 이상 을 차지하는 품종이지만 질병에 의한 피해는 지속 되고 있다. 2006년도에서 2008년도까지 양식넙치 의 세균 검출률은 Streptococcus균과 Edwardsiella균 이 각각 19%와 18%의 검출률로 높은 감염율을 나타내었다 월별 세균 검출률 비교 결과. , Edwardsiella 균과 Streptococcus균은 고수온기에 검출률이 높은 것으로 나타나 고수온기 넙치의 면역력 저하와 , 함께 질병 발현의 가능성을 높이고 있는 것으로 사료된다(Cho et al., 2008).

질병으로 인한 폐사를 막기 위해 다양한 종류 의 수산용 약제가 사용되고 있으나 약제들이 정, 확한 진단 없이 사용되어 치료효능이 감소되고 있다 또한 수산동물은 질병 발생 시 육상동물과 . 달리 물을 통하여 병원균이 빠르게 확산되어 양 식 산업에 치명적인 영향을 줄 수 있다.

우리나라에서는 2005년도부터 에드워드병 예방 백신이 사용되기 시작한 이후 세균 혼합백신이 상용화되어 사용되고 있다 혼합백신의 경우 항. 원의 혼합농도 및 종류에 따라 부작용을 유발할 수 있고 안전성과 같은 기초적인 자료 또한 부, 족한 실정이다.

본 연구에서는 넙치의 주요 세균성 질병인 연 쇄구균증과 에드워드병을 예방하기 위하여 연쇄 구균증의 원인균인 S. iniae와 S. parauberis, 에드 워드병 원인균인 E. tarda의 혼합농도별 효능 및 안전성을 조사하였다.

재료 및 방법

.

Ⅱ

시험어 및 사육환경 1.

포항 소재 넙치 양어장에서 구입한 넙치 체중 (

전장 를 용량

16.02±2.18 g, 14.20±2.02 cm) 1 ton 의 유수식 사육조에 주간 순치시킨 후 2 300L 수

조에서 수행하였으며 수온은 , 24.2±0.9℃를 유지 하였다.

백신 대상 균주 2.

넙치 병어에서 분리되어 병리연구과 균주은행 에서 보관중인 E. tarda FP2018, S. iniae FP5024 와 S. parauberis FPA 4164를 사용하였다.

백신의 제조 및 접종 3.

에 접종하여 에서 BHI broth(Difco, USA) 30℃ 48 시간 배양한 후 37% 중성포르말린(Merck, Germany) 을 배양액의 0.3%가 되도록 첨가하여 shaking

에서 으로 회전시

incubator (Vision, Korea) 150rpm

키면서 30℃에서 24시간동안 불활화하였다 배양. 균의 불활화를 BHIA 배지에서 최종확인한 후

으로 원심분리하여 균체를 수거하고 혼 12,000rpm

합농도별 효능을 조사하였다.

시험어는 S. iniae 및 S. parauberis에 대한 항체 가가 나타나지 않는 건강한 넙치(41.8±3.7g)를 선 정하여 시험구당 25마리씩 수용하여 실험에 사용 하였다 시험용 수조는 . 300L FRP 수조를 사용하 였으며 실험 종료 시까지 유수식으로 관리하였, 다.

종 혼합백신 적정 혼합농도를 조사하기 위하 3

여 <Table 1>과 같은 농도로 혼합한 후 어체 당 씩 복강주사하였다

0.1mL (<Table 1>).

Group Composition of the vaccines A 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish B 1mg(Si)+1mg(Sp)+0.5mg(Et)/fish C 1.5mg(Si)+1.5mg(Sp)+1mg(Et)/fish

D Control(PBS)

Si: S. iniae, Sp: S. parauberis, Et: E. trada

<Table 1> Experimental design

백신의 혼합농도별 효능 조사 4.

응집항체가 조사 1)

백신 접종 후 1, 2, 3, 4주째 시험어의 미부정 맥에서 채혈하여 혈청을 분리하였으며 응집 항, 체가는 마이크로타이터(microtiter)법으로 조사하였 다 즉. , 96 well microplate well (Corning, USA)에 서 넙치로부터 분리한 혈청을 멸균생리식염수로 단계 희석한 후 시험 백신을 항원으로 사용하여 동량씩 반응시킨 후 24시간 후 응집괴 형성 유무 를 관찰하였다.

방어력 조사 2)

백신 접종 주째 예비실험에서 조사된 4 LD50 농 도로 복강주사 후 상대생존율을 조사하였다 즉 . S. iniae는 1.49 × 10⁴ cfu/fish, S. parauberis는 1.20

× 10⁶ cfu/fish, E. tarda는 3.9 × 10⁵ cfu/fish가 되 도록 복강주사법으로 인위 감염 후 매일 육안으 로 관찰한 후 폐사어에 대해서는 세균 배양하여 원인균을 동정하였다.

상대생존율(%)={1-(시험구의 누적폐사율 대조구/ 의 누적폐사율)} × 100

라이소자임 활성 3)

라이소자임 활성은 turbidimetric method를 이용 하여 측정하였다 즉. , Micrococcus lysodeikticus 0.2mg/mL 현탁액(pH 6.2) 950㎕와 혈청 50μL 를 혼합하여 25 , 30℃ 초 및 분 4 30초간 반응시킨 후 530nm에서 흡광도를 측정하였다 라이소자임 . 활성은 units/mL 로 나타내었으며, 1unit는 흡광 도 값이 0.001/min 감소한 양을 나타낸다.

4) SOD (SuperOxide dismutase) 활성

백신처리 후 주부터 주째까지 백신처리구 및 1 4 대조구의 혈구를 대상으로 SOD Assay kit-WST

을 이용하여 활성을 측정하

(Dojindo, Japan) SOD 여 상법에 따라 units/mL로 나타내었다.

백신의 혼합농도별 안전성 조사 5.

혈액생화학적 성상 조사 1)

백신접종이 시험어의 혈액성상에 미치는 영향 을 조사하기 위하여 Glucose, AST (aspatate aminotransferase), Total protein 및 Total cholesterol 의 농도는 자동혈액분석기(Fuji DriChem 3500i,

를 이용하여 측정하였다 Fuji Film, Japan) .

병리조직학적 검사 2)

백신 처리에 따른 병리조직학적 검사를 위하여 백신 처리 1, 2, 3 및 4 주째에 각 장기에 대한 육안 검사를 실시하고 병리조직학적 검사에 필요 한 장기를 적출하였다. Bouin's solution에 전고정 하고 24 시간 후 각 장기를 세절한 다음 동일 고 정액에 후고정하였다 고정이 완료된 후. , 70 %에 서 100 %까지 순차 농도의 에탄올 수용액에서 탈수하고 xylene으로 투명화하여 파라핀을 침투 시켜 포매하였다. Rotary형 microtome (Richert-Jung

으로 두께의 박편을 제작하여

820, Leica) 4 5 ∼ ㎛

염색하여 광학현미 Harris' hematoxyline-eosin(HE)

경(BX50F4, Olympus)하에서 관찰하였다.

통계처리 6.

결과의 통계 처리는 ANOVA-test를 실시하여 Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 평 균간의 유의성을 SPSS Version 10 (SPSS, Michigan

을 사용 Avenue, Chicago, IL, USA, 1997) program 하여 95 수준에서 검정하였다% .

결과 및 고찰

.

Ⅲ

백신의 혼합농도별 효능 조사 1.

응집항체가 조사 1)

백신 처리 후 S. iniae에 대한 응집항체가는 A 시험구에서 백신 처리 주째부터 응집항체가의 2 증가가 나타났으나 그 외의 시험구는 백신 처리 주째부터 증가가 나타났다 백신 처리 주째에

3 . 4

는 시험구중에서 A 시험구가 가장 높은 항체가 를 나타내어 1mg(Si)+1mg(Sp)+1mg(Et)/fish의 농도

구가 가장 효과적인 것으로 판단되었다([Fig. 1]).

[Fig. 1] Change in agglutination titers against Streptococcus iniae FKC of serum collected from olive flounder vaccinated with combination vaccine

S. parauberis에 대한 응집항체가는 S. iniae와 유사한 경향으로 백신 처리 주째에는 시험구중2 에서 A 시험구에서만 약간의 항체가가 나타났으 며 백신 처리 주째 , 4 A 시험구에서 가장 높은 항 체가를 나타내어 A 시험구가 가장 효과적인 것 으로 판단되었다([Fig. 2]).

[Fig. 2] Change in agglutination titers against Streptococcus parauberis FKC of serum collected from olive flounder vaccinated with combination vaccine

E. tarda에 대한 응집항체가는 모든 백신처리구 에서 백신처리 주째부터 응집항체가의 증가가 2

나타나 조사 주째까지 증가가 지속되었다 백신4 . 농도구 간에 큰 차이는 보이지 않았으나 백신 처 리 주째 4 A 시험구와 C 시험구가 다소 높게 나 타났으나 투여되는 백신량을 고려해볼 때 A 시 험구가 가장 효과적인 것으로 판단되었다([Fig.

3]).

[Fig. 3] Change in agglutination titers against Edwardsiella tarda FKC of serum collected from olive flounder vaccinated with combination vaccine

방어력 조사 2)

S. iniae에 대한 백신접종구의 상대생존율은 A 시험구가 75%로 가장 높게 나타났으며, S. parauberis 에 대해서는 모든 백신시험구의 상대생존율이

로 동일하게 나타났다

62.5% . E. tarda에 대한 백 신접종구의 상대생존율은 A 시험구가 77.8%로 가 장 높게 나타났다 따라서 . S. iniae, S. parauberis 및 E. tarda 모두에 대한 방어능은 A 시험구가 가장 효과적인 것으로 나타났다(<Table 2>).

라이소자임 활성 3)

어류 혈청 중의 라이소자임은 세균의 세포벽 구성성분의 하나인 peptidoglycan에 작용하여 세 포벽의 삼투압 작용에 손상을 주어 용균시키지 만 존재 부위와 활성은 어종에 따라 다른 것으, 로 알려져 있다 라이소자임은 많은 어류에서 정. 균 효과가 있는 것으로 보고되었는데(Grinde,

Group

A B C D

S. iniae 75 50 62.5 0

S. parauberis 62.5 62.5 62.5 0

E. tarda 77.8 66.7 55.6 0

<Table 2> Relative percentage survival (RPS) of Streptococcus iniae, S. parauberis and Edwardsiella tarda vaccinated and non-vaccinated olive flounder Paralichthys olivaceus, intraperitoneally (IP) Challenged with S. iniae, S. parauberis or E. tarda

은 넙치의 라이소자임은 1989), Kim et al.(1992)

Micrococcus luteuse, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens 및 Streptococcus epidermis에 대하여 높 은 정균 효과를 나타내었다고 보고하였다.

본 연구에서는 백신 처리 주째 1 A 시험구가 다른 실험구에 비하여 비교적 높은 활성을 나타 내었다 백신구와 대조구를 비교하였을 때 모든 . 백신구는 대조구에 비하여 유의적인 차이는 보이 지 않았으나(p>0.05) 높은 경향을 나타내어 백신 처리는 넙치의 라이소자임 활성을 높이는 것으로 판단되었다(<Table 3>).

Group Times(Weeks)

1 2 3 4

A 632.2±125.3 632.1±101.2 675±62.3 616.2±37.4 B 499.4±112.2 392.7±57.2 608.8±126.2 627.7±110.4 C 552.5±136.1 588.3±153.2 662.2±112.2 566.5±93.4 D 312.2±64.4 377.7±112.1 422.7±55.2 424.4±73.2

<Table 3> Blood lysozyme activities (units/ml) of olive flounder Paralichthys olivaceus, vaccinated with combination vaccine

4) SOD (SuperOxide dismutase) 활성

활성은 시험구와 대조구간에 큰 차이는 SOD

보이지 않았지만, 모든 백신처리구가 대조구에 비하여 높은 활성을 나타내었다([Fig 4]).

0 20,000 40,000 60,000 80,000

1 2 3 4

Weeks

SOD activity(units/ml)

A B C D

[Fig 4] SOD activities (units/ml) of olive flounder Paralichthys olivaceus, vaccinated with combination vaccine.

혼합 불활성화 백신 투여에 따른 안전성 2.

조사

혈액생화학적 성상 조사 1)

혈액 생화학적 검사는 육상동물뿐만 아니라 해 양동물에서도 중요한 요소에 해당하며, 동물의 생리적인 상태를 판단할 수 있는 것으로 알려져 있다(Chen et al., 2004).

어류가 스트레스에 노출 시 차1 , 2 , 3차 차 반응 으로 구분할 수 있으며(Wedemeyer and McLeay,

혈액 중의 는 차 반응의 내분비계 1981), glucose 1

활성의 증가로 분비된 catecholamine과 glucocorticoid 에 의해 나타나는 스트레스 차 반응의 가장 대2 표적인 지표(Wedemeyer et al., 1990)로서 증가 시

차 스트레스 반응인 면역능 저하를 유도한다

3 .

본 연구에서 glucose 농도가 백신 처리구와 대조 구간에 유의적인 차이를 보이지 않아 백신 처리 가 넙치에 스트레스로 작용하지 않는 것으로 판 단되었다(p>0.05, <Table 4>).

는 간장 건강 상태를 진단하는 지표로서 AST

간장 손상 시 혈액 중으로 유리되므로 동물의 간

Group Times(Weeks)

1 2 3 4

Gluc*

(mg/dL)

A 12.5±4.5 19.7±9.0 16.6±2.5 11.3±5.8

B 11.8±5.6 26.6±6.4 29±11.9 13.3±6.4

C 10.3±3.5 17±5.3 18.3±10.1 13.3±5.6

D 12±6.2 10±4.2 19.3±11.1 23±8.1

AST (U/L)

A 13.6±3.7 9±5 11±7.9 15±2.6

B 10.7±3.0 12±2.0 6.3±2.1 6.3±1.5

C 8±1.0 9±1.4 11.0±2.6 15.3±2.3

D 5.7±3.6 8.3±2 5.3±1.2 27.3±7.8

TP (g/dL)

A 4.5±0.9 5.9±0.9 3.7±0.8 2.3±0.2

B 3.7±1.1 5.5±1.1 2.7±0.9 2.4±0.5

C 4.1±0.8 3.6±1.2 3.2±1.1 2.9±0.1

D 2.8±0.6 2.8±0.5 1.8±0.4 2.6±0.4

TC (g/dL)

A 122±35 168±47.6 105.3±26 73.7±19.6

B 99±25.1 150.7±22.2 80.7±13.9 80±12.5

C 107.7±44.9 96±11.3 80.7±39.6 114±16.5

D 102±46.4 139.7±39.2 62±16.1 123±67.8

*Gluc, Glucose; AST, Aspartate aminotransferase; TP, Total protein; TC, Total cholesterol

<Table 4> Blood chemical values in the sera of the olive flounder, Paralichthys olivaceus vaccinated with combination vaccine

질환 진단에 자주 사용된다(Lee & Chong, 2000).

본 연구에서 백신처리 후 AST 농도에서 유의적 인 차이가 보이지 않아 본 연구에서 사용된 3 종 류의 백신은 넙치의 간장에 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다(p>0.05, <Table 4>).

어류 혈액 중의 total protein은 성장단계 수질, 환경 및 스트레스 등 여러 가지 요인에서 변화될 수 있다(Yanagisawa and Hashimoto, 1984). 본 연 구에서 실험구 사이에 유의적인 차이가 보이지 않아 백신에 의해 total protein 농도는 영향을 받 지 않는 것으로 나타났다(p>0.05, <Table 4>).

은 어류의 질병 저항성을 나타 Total cholesterol

내는 인자로 방어 사료에 어분을 첨가하지 않은 실험구에서 세균감염에 대한 방어능이 낮았으며, 이때 total cholesterol 수치가 낮았다고 보고 하였 다(Maita et al., 1998a, 1988b).

본 연구에서는 실험구간에 total cholesterol의 차이는 나타나지 않았다(<Table 4>).

병리조직학적 검사 2)

백신 처리의 안전성 조사를 위하여 백신처리, 구 및 대조구의 병리조직학적 검사를 실시하였 다 백신 처리 주일째부터 주째까지 매주 시험. 1 4 구의 간장 신장 심장 및 아가미 조직을 , , 10% 중 성 포르말린에 고정 후 상법에 따라 H&E염색을 실시 후 검경하였다 그 결과 백신 처리구의 모. , 든 장기에서 정상적인 조직 소견이 관찰되어 백 신의 독성이 없음을 확인하였다([Fig. 5]).

우리나라 넙치 양식은 대규모의 고밀도 양식형 태로 이루어지고 있어 백신 접종도 다량의 어류 에 접종되고 있다 최근 양식현장에서는 다양한 . 질병이 혼합감염되어 대량 폐사를 유발하고 있어 회 접종으로 다양한 질병을 예방할 수 있는 혼 1

합백신을 선호하고 있다 그러나 혼합백신의 경. 우 항원의 종류 및 혼합농도에 따라 효능에서 큰 차이가 있을 뿐만 아니라 무엇보다 부작용을 유 발할 수 있어 안전성 확보가 가장 중요하다 현.

A B C D

Liver

Heart

Kidney

[Fig. 5] Histopathological section showing the olive flounder, Paralichthys olivaceus vaccinated with combination vaccine

재 양식현장에서 에드워드병과 연쇄구균증 예방 용 혼합백신이 상용화되어 사용되고 있으나 안전 성 및 효능에 대하여 보고되어 있지 않아 여러 가지 의문점이 제기되고 있다.

본 연구에서 넙치의 주요 세균성 질병인 에드 워드병과 연쇄구균증의 원인균인 E. tarda, S. iniae 및 S. parauberis의 혼합백신을 1mg 씩 혼합하였 을 때 혈액생화학적 성상 및 조직병리학적으로 넙치에서 안전성이 확인되었으며, 높은 면역능 및 방어능을 나타내어 양식현장에서 질병예방에 크게 기여할 것으로 기대된다.

References

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논문접수일 : 2014년 07월 28일 심사완료일 : 1차 - 2014년 08월 18일

차 년 월 일

2 - 2014 10 07 게재확정일 : 2014년 10월 10일