J. Fish Pathol., 22(3)：211 ~ 218 (2009)
211
�Corresponding Author :
Birnaviridae에는 infectious pancreatic necrosis virus (IPNV)와 marin birnavirus (MABV)로 대표 되는 Aquabirnavirus와 infectious bursal disease virus (IBDV)이 속하는 Avibirnavirus 및 Drosophila X virus (DVX)를 포함하는 Entomo- birnavirus 그리고 blotched snakehead virus (BSNV)의 Blosnavirus 4종류가 있다 (Becht et al., 1988 ; Duncan et al., 1991 ; Dobos et al., 1995 ; John and Richards, 1999 ; Leong et al., 2000). 이
중 해산어류에서 유래한 aquabirnavirus는 일본 방어에서 분리된 후 Yellowtail ascites virus (YTAV)로 최초 보고되었으며, 최근까지 다양한 해산어류와 연체동물로부터 YTAV-like virus가 확인되었다 (Sorimachi and Hara, 1985; Kusua et al., 1993; Suzuki et al., 1998; Zhang and Suzuki, 2003; Zhao et al., 2008). 주요 감염 증상으로는 복수증, 이상 유영, 척추 만곡, 안구돌출, 신장 퇴 색 등의 증상을 보이나 숙주에 따라 다양한 병
양식 강도다리, Platichthys stellatus 및 넙치, Paralichthys olivaceus에서 분리한
marine birnavirus (MABV)의 phylogenetic 분석
박신후∙박명애�∙조미영�
국립수산과학원 수산동물방역센터, �국립수산과학원 병리연구과
Phylogenetic analysis of marine birnavirus (MABV) isolated from cultured starry flounder Platichthys stellatus and olive flounder
Paralichthys olivaceus in Korea
Shin Hoo Park, Myoung Ae Park�and Mi Young Cho�
Aquatic Animal Disease Control Center, National Fisheries Research and Development Institute, Busan 619-902, Korea
�Pathology Division, National Fisheries Research and Development Institute, 408-1 Shirang Gijang, Busan 619-902, Korea
In this study, we have compared the genome of marine birnavirus (MABV) detected from starry flounder Platichthys stellatus and olive flounder Paralichthys olivaceus. A molecular analysis based on the nucleotide sequence (433 bases) of VP2-NS-VP3 region revealed that MABV (08-KU) from starry flounder showed 98% similarity with MABV Y6 isolated from Yellowtail Seriola quinqueradita in Japan (Accession no: AY283781) and with other aquabirnaviruses identify more than 76%. Comparison with MABV strains (06-KP, 08-KC) from olive flounder and MABV Y6 strain showed 97~98% sequence identities. Phyloge- netic analysis was performed in order to examine the relationship among previously determined aquatic bir- naviruses isolates showed that MABV and IPNV strains were classified into seven clusters. Three isolates from starry flounder and olive flounder in this study, belong to the genogroup Ⅶ including MABV Y6 strain and other aquabirnaviruses isolated from marine fish and molluscan shellfish in Japan. This report is the first description of a MABV from starry flounder in Korea.
Key words : Phylogenetic analysis, Marine birnavirus, PCR, Starry flounder, Olive flounder, Virus
�Corresponding Author : Mi Young Cho, Tel : 051-720-2483 Fax : 051-720-2498, E-mail : [email protected]
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적 증상을 나타내기도 한다. 또한 넙치의 경우 종묘 생산 시기에 감염되어 치어의 대량 폐사를 유발할 뿐만 아니라, 종묘 생산을 위한 친어에 감염 되어 생산 치어에까지 감염증상을 보이는 등 병원체의 수직 감염 가능성도 의심 된다 (Oh et al., 1999 & 2000).
해산어류에서 유래한 aquabirnavirus는 Hosono et al. (1996)에 의해 marine biravirus (MABV)로 통칭하게 되었으며, 최근 광범위한 숙주 특이성 을 나타냄에 따라 지속적인 모니터링을 통한 유 전자 분석의 필요성이 제기되고 있다.
특히 유전자 비교 분석 작업은 바이러스의 숙주 특이성과 병원성에 관계하는 유전적 변화도 함께 나타내기 때문에 바이러스성 질병을 이해하는 중 요한 수단이 되고 있다 (Zhang and Suzuki, 2003).
우리나라에서도 넙치, 조피볼락, 농어 등의 다 양한 해산어로부터 MABV가 보고 되었으며, (Sohn et al., 1995; Oh et al., 1997 & 1999; Seo et
al., 1998), 최근 들어서는 염기서열 분석을 통한
바이러스의 특성도 보고된바 있다 (Joh et al., 2008; Jung et al., 2008).
본 연구에서는 양식 넙치와 양식강도다리에서 분리한 MABV VP2/NS junction 부위 유전자의 염기서열을 분석 한 후, GenBank에 보고된 여 러 다른 aquabirnabirus들과의 비교를 실시하여 그 유전적 특성을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
시험어
2008년 6월 울진지역 양식 강도다리의 폐사원
인을 조사하던 과정에서 MABV가 검출 되었다.
검출된 MABV의 유전자적 특성을 조사하기 위 해 강도다리 MABV (08-KU) 및 2006년 10월 부산지역의 양식 넙치 MABV (06-KP)와 2008 년 3월 충남태안 넙치 자어 MABV (08-KC)에 서 검출한 MABV 유전자를 시험 분석에 사용 하였다 (Table 1).
RNA분리 및 cDNA 합성
RNA 바이러스의 동정을 위하여 어류의 비장 및 신장 조직 적당량 (50~100 mg)을 취하여, 조 직 분쇄용 모터 (Sigma, USA)로 마쇄하고 TRI- ZOL (Invitrogen, USA) 법으로 RNA를 분리 한 후 다음 단계 실험에 이용하기 전까지 -80℃에 보관하였다. cDNA의 역전사 합성 반응은 Super- Script One-Step RT-PCR System kit (Invitrogen, USA)를 사용하여 실시하였고, 이 후 합성된 cDNA를 PCR을 위한 template으로 사용하였다.
PCR및 전기영동
MABV 검출을 위한 PCR법은 Cho et al.
(2007)에 따라 다음과 같이 실시하였다. 우선 Taq DNA polymerase 1 U, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 250 μM, Tris-HCl (pH 9.0) 10 mM, KCl 40 mM, MgCl2 1.5 mM로 구성된 Accupower� PCR PreMix (Bioneer, Korea)에 MABV의 VP2- NS-VP3 부위 유전자 검출용 특이 primer MABV-F (5′-GCACCACGAAGGTACGAAAT- 3′)와 MABV-R (5′-GTACGTTGCCGTTTCCT- GAT-3′)를 각각 1 (10 pmoles/ul) ㎕씩 첨가하고 조직 시료로부터 RNA 분리 후 합성 한 cDNA
Table 1. List of marine fish samples detected MABV and conducted sequence analysis.
Sample Scientific name Date & site Average length(㎝)
Olive flounder Paralichthys olivaceus October 2006/ Busan 11.7-15.6 Olive flounder Paralichthys olivaceus March 2008/ Taean, Chungnam 1-1.5 Starry flounder Platichthys stellatus June 2008/ Uljin, Gyeong-buk 0.5-1
2 ㎕를 PCR template으로 하여 distilled water를 최종 volume이 20 ㎕되게 첨가 하였다. PCR condition은 DNA Engine Dyad�Peltier Thermal cycler (Bio-RAD)를 사용하여 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 94℃에서 denaturation 30초, 55℃ annealing 30초, 72℃에서 extension 30초를 30cycle 반복 반응시킨 후 72℃에서 7분 간 post-extension을 실시하였다. 증폭된 PCR 산 물은 0.5 ㎕/㎖ (10 mg/ml) ethidium bromide (Sigma, USA)이 첨가된 1% agarose gel과 100 bp DNA leader (Bioneer, Korea) 및 Tris-acetate 40 mM, 1 mM EDTA의 1x TAE buffer (Bioneer, Korea) 완충 용액을 사용하여 전기영동 했으며, GB/Gene Genius super 12 bio imaging UV system (SynGene, UK)으로 433 bp 크기의 특이적 PCR product 증폭 유무를 최종 확인하였다.
유전자 Cloning과 염기서열 분석
조사 시료로부터 MABV 양성 확인된 PCR products를 gel-elution system (General bio system, Korea)으로 회수하였다. 이 후 ToPo TA cloning� kit (Invitrogen, USA)로 cloning 하여 염기서열 분석 의뢰 (Solgent, Korea)한 후, 기존 GenBank
에 보고된 다양한 aquabirnavirus 유전자들과 비 교 확인을 실시하였다. 염기서열 상호 비교에는 Bioedit V7.0. 프로그램을 사용했으며, phyloge- netic 분석은 MEGA program version 4.0 (Tamura et al., 2007)을 이용하였다.
결 과
빈사개체의 강도다리 시료를 대상으로 한 RT- PCR 실험 결과 433 bp 크기의 특이적 PCR 증 폭 산물이 관찰되어 MABV 감염이 확인되었다 (Fig. 1). 기타 기생충 및 세균 감염 확인 실험에 서는 기생충, 세균 모두 미검출로 나타났고, 2006년 10월 넙치 시료에서는 어류 iridovirus가 MABV와 함께 검출되었으며 기생충 감염은 확 인되지 않았고 일부 Vibrio sp.가 분리되었다.
2008년 3월 충남 태안 넙치 시료에서는 MABV 이외 다른 바이러스성 질병의 원인바이러스는 검출되지 않았고 약간의 Vibrio sp.와 스쿠치카 충의 복합 감염이 확인되었다. MABV의 세부 확정 진단과 어종 간 나타나는 MABV 유전자 의 상호 비교를 위해 염기서열 분석을 한 결과, 강도다리 자어에서 검출한 MABV (08-KU)는 일 본 방 어 로 부 터 분 리 보 고 된 YTAV (AY283781) 유전자와 98%의 유사성을 보였다.
그리고 MABV (08-KC)는 YTAV와 98%, MABV (06-KP) 및 MABV (08-KC)와도 97~98% 유사 성을 나타냈고, MABV (08-KU) 역시 MABV (06-KP) 및 MABV (08-KC)와 97�98%의 높은 유사성을 보였다 (Table 2 & Fig. 2).
염기서열 비교와 더불어 실시한 아미노산 상 호비교에서도 MABV (06-KU)는 YTAV와 98%
가, MABV (08-KC), MABV (06-KP)과는 각각 99%, 98%의 유사성이 나타났다 (Table 3).
본 연구에서 검출한 MABV strains과 이미 GenBank에 보고된 여러 strain들과의 계통도 분 석을 실시한 결과 (Table 4), MABV (08-KU), MABV (08-KC), MABV (06-KU)는 모두 일본 Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of MABV gene by
PCR. Lane1, PCR products of cloned MABV segment A gene as positive control ; Lane 2-3, PCR detection of MABV genes from starry flounder, Platichthys stellatus ; lane 4, PCR negative control. M: 100bp DNA ladder.
방어에서 분리된 MABV Y6이외에 H1, GC-1 strain들과 동일한 genogroup Ⅶ에 포함됨을 알 수 있었다 (Fig. 3).
고 찰
일본 방어에서 분리된 이래 많은 해산어류에 서 그 존재가 보고된 MABV는 다양한 지역별 숙주에서 분리됨에도 불구하고 strain 간 상호 높은 유사성을 나타내는 것을 확인 할 수 있다.
이는 그만큼 MABV가 VP2/NS junction 부위 염기서열 분석에 따라 다른 birnaviridae 속 genogroup과 특징적으로 구별될 수 있음을 보여 준다 (Kusua et al., 1993; Hosono et al., 1994 &
1996; Reno, 1999; Leong et al., 2000 ; Zhang and Suzuki, 2004). 본 연구에서도 MABV의 VP2/NS junction 부위 염기서열을 이용하여 총 24개 aquabirnavirus의 계통도를 분석한 결과, 강도다 리 자어에서 검출한 MABV (08-KU)와 넙치에
서 분리된 MABV (08-KC), MABV (06-KP)들은 서로 다른 숙주에서 분리되었음에도 불구하고 모두 genogroup Ⅶ속으로 특징적 분류가 가능했 다. 이러한 결과는 최근 우리나라와 일본에서 분 리된 aquabirnavirus의 계통도와 유전자 분석에서 도 동일하게 나타나는데 (Nishizawa et al., 2005;
Jung et al., 2008), 이를 통해 바이러스의 더욱 세 부적이고 지역적 분류와 함께 광범위한 숙주 특 이성에 대한 이해가 가능할 것으로 사료된다.
현재 우리나라에서는 넙치, 조피볼락 및 농어 (Oh et al., 1999) 등에서 MABV의 보고가 있었 으나, 강도다리에서는 본 연구가 최초의 보고로 사려 된다. 또한 어류의 자∙치어기에 피해를 입히는 병원성 인자로 잘 알려진 MABV가 넙 치 및 강도다리 치어에서 동일하게 검출되었을 뿐만 아니라 상호 유전적 상동성도 높은 점을 기초로 넙치에 대한 MABV의 병원성이 강도다 리에서도 비슷하게 나타날 가능성이 있을 것으 로 추정된다. 특히 바이러스는 일반적으로 다른 Table 2. Comparison of the YTAV sequence with MABV detected samples from starry flounder and olive flounder.
MABV(08-KU) MABV(06-KP)1 MABV(08-KC)2
YTAV 98% 97% 98%
(AY283781)
Starry flounder 97% 98%
1, sampled at Busan in 2006; 2, sampled at Taean, Chungnam in 2008; ( ), accession number of GenBank.
Table 3. Comparison of the amino acid of MABV detection samples from starry flounder and flounders.
MABV(08-KU) MABV(06-KP) MABV(08-KC)
YTAV 98% 97% 99%
MABV-KU 98% 99%
Starry flounder 99%
MABV (08-KU), MABV detection sample from starry flounder; MABV (06-KP), MABV detection sample from olive flounder at Busan in 2006; MABV (08-KC), MABV detection sample from olive flounder at Taean Chungnam in 2008.
숙주에 감염 시 그 숙주에 적응하도록 변이가 일어나며 이러한 경향은 in vitro 상에서 감수성 이 다른 배양세포에서 계대를 계속 할 경우에도 발생할 수 있다 (Jung and Oh, 2002). 따라서 바 이러스의 변이로 강도다리 이외 다른 해산어류 로 MABV의 숙주 특이성이 확대 될 가능성도 있기에, 다양한 어류 및 지역 간에 MABV의 지 속적인 모니터링이 앞으로 필요할 것으로 본다.
그리고 본 연구에서는 검출된 바이러스의 병원
성에 대한 분석이 미흡했기에 숙주에 따른 병원 성에 대한 보다 깊은 연구도 차후에 병행되어야 할 것으로 사료된다.
요 약
경북 울진 지역에서 채집된 양식 강도다리와 충남 태안 및 부산 지역 넙치 시료로부터 분리 한 MABV에 대한 유전자 비교를 위해 VP2-NS- Fig. 2. Multiple alignment of nucleotide sequences of the MABV isolated from starry flounder and olive flounder in Korea and YTAV reported from yellowtail in Japan.
Fig. 3. Phylgenetic analysis of VP2-NS-VP3 region of MABV in 27 MABV strains. ＊: MABV strains in this study.
VP3 region (432 bp)을 phylogenetic 분석에 이용 했다. Sequence 확인 결과 MABV (08-KU)는 일 본 방어에서 최초 분리 보고된 YTAV와 98%의 nucleotide 유사성이 나타났으며, 이전 보고된 다 른 여러 strain들과는 76%이상 유사한 것으로 확 인되었다. 그리고 MABV (06-KP)와 MABV (08- KC)도 YTAV와 97�98%의 높은 sequence 유사 성을 보였다. 또한 다양한 MABV strain들과의 비 교를 위해 충남태안 및 부산지역 넙치 시료에서 분리한 MABV (08-KC)와 MABV (06-KP)에 대한
phylogenetic 분석도 실시하였다. 그 결과 분석에 사용된 MABV (08-KU0, MABV (06-KP), MABV (08-KC)는 모두 일본 방어에서 분리된 MABV Y6와 동일한 genogroup Ⅶ에 포함 되었다.
감사의 글
본 연구는 국립수산과학원 (수산동물질병 모 니터링 및 진단연구, RP-2009-AQ-073)의 지원 에 의해 운영되었습니다.
Table 4. Information of aquabirnavirus strains used for comparison in this study
Strain Original host Geographical origin GenBank accession no.
Reno Trout USA AY026345
11 Trout USA AY026347
93 Trout USA AY026346
VR299 Trout USA AF343572
Genogroup Ⅰ
Buhl Trout USA AF343573
137 Trout USA AF343570
Jasper Trout Canada AF342735
West Buxton Trout USA AF078668
PV Perch Taiwan AY026488
ElS Eel Taiwan AY026487
Genogroup Ⅱ
EEV Eel Japan AY026486
CV-HB1 Clam Taiwan AY026489
DPL Snakehead Thailand AY026485
OV2 Oyster England AY026484
Fr21 Trout France AY026483 Genogroup Ⅲ
Bonnamy Trout France AY026482
Spajarup Trout Denmark AF342728
ASV Atlantatic salmon Canada AY026490 Genogroup Ⅳ
Canada 3 Arctic char Canada AF342734
Genogroup Ⅴ
Canada 2 Trout Canada AF342733
He Pike Germany AF342730 Genogroup Ⅵ
Y6 Yellowtail Japan AY283781
H1 Olive flounder Japan AY283783
GC-1 Rockfish Korea AY064396
Genogroup Ⅶ
08-KU Starry flounder Korea In this study
06-KP Olive flounder Korea In this study
08-KC Olive flounder Korea In this study
참 고 문 헌
Becht, H., Muller. H. and Muller, H.K.: Compara- tive studies on structural and antigenic prop- erties of two serotypes of infectious bursal disease virus. J. Gen. Virol., 69(3):631, 1988.
Cho, M.Y., Kim, M.S., Kwon, M.G., Jee, B.Y., Choi, H.S., Choi, D.L., Park, G.H., Lee, C.H., Kim, J.D., Lee, J.S., Oh, Y.K., Lee, D.C., Park, S.H. and Park, M.A.: Epidemio- logical study of bacterial disease of cultured olive flounder, Paralichthys olivaceus, from 2005 to 2006 in Korea. J. Fish Pathol., 20:61-70, 2007.
Dobos, P., Berthiaume, L., Leong, J.A., Kibenge, F.S.B., Muller, H. and Nicholson, B.L.: Bir- naviridae, in "Virus taxonomy-classification and nomenclature of viruses: Sixth report of the international committee on taxonomy of viruses"(R.I.B. Franki, C.M. Faquet, D.L.
Knudson, and F. Brown, Eds.), pp.240-244, Springer-Verlag, Wien/New York, 1995.
Duncan, R., Mason, C.L., Nagy, E., Leong, J.A. and Dobos, P.: Sequence analysis of infectious pancreatic necrosis virus genome segment B and its encoded VP1 protein: a putative RNA-dependent RNA polymerase lacking the Gly-Asp-Asp motif. Virol., 181:541-552, 1991.
Hosono, N., Suzuki, S. and Kusuda, R.: Evidence for relatedness of Japanese isolates of bir- naviruses from marine fish to IPNV. J. Fish Dis., 17:433-437, 1994.
Hosono, H., Suzuki, S. and Kusuda, R.:
Genogrouping of birnaviruses isolated from marine fish: a comparison of VP2/NS junc- tion regions on genome segment A. J. Fish Dis., 19:295-306, 1996.
Joh, S.J., Shon, C.I., Kang, S.W., Kim, B.H., Jeong, B.Y., Lee, K.G., Kwon, J.H. and Heo, G.J.:
Molecular characterization and genogroup- ing of VP1 of aquatic birnavirus GC1 iso- lated from rockfish Sebastes schlegeli in Korea. J. Vet. Sci., 9:85-90, 2008.
John, K.R. and Richards, R.H.: Characteristics of a new birnavirus associated with a warm- water fish cell line. J. Gen. Virol., 80:2061- 2065, 1999.
Jung, S.J. and Oh, M.J.: Persistent infection of marine birnavirus and its status of infection in cell. J. Fish Pathol., 15:9-16, 2002.
Jung, S.J., Kim, S.R., Joung, I.Y., Kitamura, S.I., Ceong, H.T. and Oh, M.J.: Distribution of marine birnavirus in cultured olive flounder Paralichthys olivaceus in Korea. J. Microbi- ol., 46:265-273, 2008.
Kusuda, R., Nishi, Y., Hosono, N. and Suzuki, S.:
Serological comparison of birnavirus isolat- ed from several species of marine fish in south west Japan. Fish Pathol., 28:91-92, 1993.
Leong, J.C., Brown, D., Dobos, P., Kibenge, F.S.B., Ludert, J.E., Muller, H., Mundt, E. and Nicholson, B.: Family birnaviridae in virus taxonomy: Seventh report of the internation- al committee on taxonomy of viruses, pp.
481-490, 2000.
Nishizawa, T., Kinoshita, S. and Yoshimizu, M.: An approach for genogrouping of Japanese iso- lates of aquabirnaviruses in a new genogroup Ⅶ, based on the VP2/NS junc- tion region. J. Gen. Virol., 86:1973-1978, 2005.
Oh, M.J., Choi, T.J., Sim, D.S., Park, M.A., Sohn, S.K., Kim, J.W. and Kim, Y.J.: Effect of environmental seawater on the infectivities of HRV, FBV and RVS. J. Fish Pathol.,
10:165-176, 1997.
Oh, M.J., Jung, S.J. and Kim, H.R.: Biological and serological characteristics of birnavirus iso- lated from cultured Japanese flounder in 1999. J. Fish Pathol., 12:49-55, 1999.
Oh, M.J., Jung, S.J., Kim, Y.J., Kim, H.R., Jung, T.S. and Yeo, I.K.: The screening of marine birnavirus (MABV) infected in Brood stock of flounder, Paralichthys olivaceus. J. Fish Pathol., 13:53-59, 2000.
Reno, P.W.: Infectious pancreatic necrosis and asso- ciated aquatic birnaviruses. In fish disease and disorders (P. T. K. Woo & D. W. Bruno, eds. pp.1-55, CABI publishing, New York, vol.3, 1999.
Seo, J.J., Heo, G.J. and Lee, C.H.: Characterization of aquatic birnavirus isolated from rock fish in cultured in Korea. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 18: 87-92, 1998.
Sohn, S.G., Park, M.A., Do, J.W. and Park, J.W.:
Birnavirus isolated from cultured flounder in Korea. Fish Pathol., 30:279-280, 1995.
Sorimachi, M., Hara, T.: Characteristics and patho- genicity of a virus isolated from yellowtail fingerlings showing ascites. Fish Pathol.,
19:231-238, 1985.
Suzuki, S., Kamamura, M. and Kusuda, R.: Isola- tion of birnavirus from Japanese pearl oys- ter Pinctada fucata. Fish Sci., 64:342-343, 1998.
Tamura, K.J., Dudley, M.N. and Kumar, S.: Molec- ular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol., 24:1596-1599, 2007.
Zhang, C.X. and Suzuki, S.: Comparison of the RNA polymerase genes of marine birnavirus strains and other birnavirus. Arch. Virol., 148:745-758, 2003.
Zhang, C.X. and Suzuki, S.: Aquabirnaviruses iso- lated from marine organisms form a distinct genogroup from other aquabirnavirus. J.
Fish. Dis., 27:633-643, 2004.
Zhao, Z., Ke, F. and Li, Z.: Isolation, characteriza- tion and genome sequence of a birnavirus strain from flounder Paralichthys olivaceus in China. Arch. Virol., 153:1143-1148, 2008.
Manuscript Received : February 5, 2009 Revised : November 9, 2009 Accepted : November 20, 2009
