[신진연구자 컬럼] 신진연구자 컬럼 미세 유체 공정을 이용한 미세구조화된

신진연구자 컬럼

서론

조직공학(tissue engineering) 및 재생의학(regenerative medicine)은 세포 생물학, 생명공학, 의학 및 공정공학의 기술을 융합하여, 사고나 질병에 의해서 결손 되었거나 제 기능을 하지 못하는 조직을 대체하거나 이식함으로써 치료하는 것을 목표로 하는 융합 학문이다. 이러한 목적 을 위해서 가장 중요한 요소 중의 하나이며, 기반이 되는 생체재료는 생체적합성, 기계적 및 물리적 성질, 성형가 공성이 우수해야 하며, 적용부위에 따라서 생분해성이 요 구되기도 한다. 이외에도 세포가 부착하여 자랄 수 있는 표면을 제공하는 세포지지체(스캐폴드)의 기공구조 및 표면 특성은 세포의 성장뿐만 아니라 세포의 분화에도 큰 영향을 미치기 때문에 응용분야에 따라서 최적화되어 야 한다. 스캐폴드는 주로 알지네이트, 콜라겐, 키토산 등 의 천연고분자나 PLGA, PCL 등의 합성 고분자를 이용 하여 제조된다. 천연고분자는 세포외기질과 비슷한 성질 을 가지고 있으며, 우수한 생체적합성을 지니고 있다. 합 성고분자는 분자구조와 분자량을 쉽게 조절할 수 있어서 기계적 및 물리적 특성과 생분해속도를 조절하기 용이하 다. 또한 천연 및 합성 고분자를 조합한 형태의 생체재료 개발도 가능하며, 스캐폴드 내에 약물을 봉입함으로써 약 물 치료나 세포의 거동을 조절할 수도 있다. 본 칼럼에서 는 간단한 미세 유체 공정(fluidic device)을 이용하여 제 조된 균일 입자, 균일 기공을 갖는 스캐폴드, 내부 빈 공 간과 다공성 벽을 갖는 세포 캡슐, 및 다공성 균일 크기의 세포 전달체에 대하여 소개하고자 한다. 이러한 생채 재 료는 약물 전달, 조직공학, 재생의학, 세포 캡슐, 세포 전 달 등에 활용될 수 있는 생체 소재들로써 그 활용범위는 의공학(biomedical engineering) 전체에 해당한다.

미세 유체 공정을 이용한 균일 입자 제조

미세 유체 채널(microfluidic device)은 주로 PDMS를 이용하여 복잡하며 여러 단계의 공정을 이용하여 제조되 었으나, 본 연구에서는 주사기 바늘, 유리 캐필러리관 및 PVC 튜브를 이용하여 간단히 두 개의 채널을 갖는 미세 유체 채널을 제조하였으며, 이를 이용하여 매우 균일한

미세 유체 공정을

이용한 미세구조화된 생체재료 개발

2004 연세대학교 화학공학과 공학사·석사·박사 2006 LG전선 연구소 선임연구원

2007 연세대학교 화학공학과 연구교수

2008 Washington University in St. Louis, Post-doc.

현 재 가톨릭대학교 환경생명공학부 생명공학전공 전임강사

최 성 욱

가톨릭대학교 환경생명공학부 생명공학 전공

[email protected]

신진연구자 컬럼

크기를 갖는 다양한 입자를 제조하였다. PCL입자 제조를 예로 들면, 주사기바늘을 통해서는 유기용매 에 녹인 PCL 용액이 분산질(discontinuous phase) 로써 도입되고, PVC 튜브를 통해서는 유화제를 함 유한 수용액이 분산매(continuous phase)로 도입된 다. 두 유체는 시린지 펌프를 이용하여 일정한 속도 로 미세 유체 채널로 도입된다. [그림 1(A)]에서 보 듯이 도입된 PCL 용액은 주사기 끝에서 수용액을 만나게 되며, 균일한 크기의 오일 에멀젼(oil-in- water emulsion)이 연속적으로 형성된다. 형성된 에 멀젼은 유리 캐필러리관을 통하여 다량의 분산매를 포함한 비이커에 도달하게되며, 용매 증발에 의해서 고체화된 균일 크기의 PCL 입자를 얻을 수 있다.

[그림 1(B)]는 미세 유체 채널을 이용하여 제조된 PCL, gelatin, 및 PECA 입자의 이미지를 보여주고 있다. Gelatin은 천연 고분자로써 물에 녹는 물질이 므로, 이를 입자화하기위해서는 gelatin 수용액을 분 산질로 사용하고 유화제가 포함된 유기 용매(예, toluene)를 분산매로 사용하여, 수상 에멀젼(water- in-oil emulsion)의 형태로 입자를 제조한다. 또한 단

량체를 도입하여 중합반응을 통하여 입자를 제조할 수도 있다. Ethyl-2-cyanoacrylate는 음이온 중합에 의하여 고분자화되는데, 이러한 단량체를 분산질로 써 미세 유체 채널에 도입하면 중합 및 용매 증발에 의해 PECA 고분자 입자를 제조할 수 있다. 본 공 정은 PCL, gelatin 및 PECA 입자뿐만 아니라, 수 상이나 오일상에 녹을 수 있는 거의 모든 천연/합성 고분자 및 단량체에 적용 가능하다는 장점이 있다.

입자의 크기는 각 유체의 속도, 주사기와 캐필러리 의 지름, 및 고분자 용액의 농도를 변화시킴으로써 쉽게 조절 가능하며, 약 10~600 µm 범위 내에서 균일하게 제어할 수 있다. 제조된 균일 크기의 입자 는 입자 내부에 약물을 함유함으로써 약물 전달 시 스템 분야에 활용할 수 있다.

온도 감응형 균일 크기 약물 전달체

본 연구에서는 미세 유체 채널을 이용하여 온도에 따라서 상(phase)이 변하는 상변화물질(phase change material)로 균일 입자를 제조하였다. 상변 화물질은 상이 변할 때 발생하는 잠열을 이용하여 그림 1. (A) 미세 유체 채널 개념도 및 (B) 이를 이용한 PCL, gelatin, poly(ethyl-2-cyanoacrylate) (PECA) 균일 마이크로 입자

(스케일바 200 µm)[Small 2009, 5, 454].

최성욱

난방용이나 방한용으로 주로 사용되는 물질이다. 상 변화물질 중에 생체적합성이 뛰어나며, 인체의 온도 와 비슷한 녹는점(melting point)을 갖는 지방산 (fatty acid) 및 지방알코올(fatty alcohol)을 약물 전달 시스템에 적용하였다. 약물을 함유한 나노입자 를 지방산 및 지방알코올 상에 분산시키고, 이 상을 분산질로 하여 미세 유체 채널에 도입하여 균일 크 기 입자를 제조하였다. [그림 2(A)]는 FITC를 함 유한 gelatin 나노입자를 포함한 상변화물질 균일 입 자를 물에 분산한 후에 외부 온도를 높여서 FITC가 방출되는 거동을 보여주고 있다. 사용된 상변화물질 은 38~39도의 녹는점을 갖으며, 그 이하의 온도에 서는 고체 상태 및 그 이상의 온도에서는 액체로 상 변화 한다. 따라서 39도 이상의 온도에서는 액체 상 태로 변화하며, 포함된 gelatin 나노입자가 외부 수 상과 만나게 되어 FITC가 방출된다. [그림 2(B)]

는 gelatin입자 외에 chitosan과 PLGA를 상변화물 질 입자에 포함시킨 후, 이에 따른 FITC 방출 거동 을 살펴본 것으로, 물과의 용해도에 따라서 FITC의 방출 속도를 조절할 수 있다. 즉 약물 방출 시작 온 도는 사용된 상변화물질의 녹는점에 의해서 제어 가 능하고, 약물 방출 거동은 약물을 함유한 물질의 용

해도에 따라서 조절되는 스마트한 시스템이다. 상변 화물질은 약물 전달 외에도, 온도 상승에 의해서 자 동으로 시작되는 시스템이 필요한 다양한 분야에 활 용될 수 있을 것으로 기대된다.

균일 기공을 갖는 세포 지지체

본 연구는 조직공학에 쓰일 수 있는 다공성 스캐 폴드의 제조에 대한 것으로, 기공의 크기가 매우 균 일한 것을 특징으로 한다. 스캐폴드를 만드는 다양 한 방법들이 존재하지만, 기존의 스캐폴드는 기공의 크기가 균일하지 않다는 단점을 가지고 있다. 기공 의 크기가 균일하지 않을 경우에는, 세포를 스캐폴 드 내에 균일하게 분포 시킬 수 없으며, 또한 세포의 생존에 필요한 산소와 영양분 공급에도 어려움이 있 게 된다. 즉 세포의 사멸을 유발할 수도 있으며, 최 종적으로는 스캐폴드 내에 균일한 조직 형성을 방해 한다. 이러한 단점을 해결하기위하여, 미세 유체 채 널을 이용하여 만들어진 균일 크기 입자를 템플레이 트(template)로 활용하여 균일한 기공를 갖는 스캐 폴드를 제조하였다.

[그림 3(A)]는 그 과정을 개념적으로 보여주고 있다. 제조된 균일 크기 입자를 결정화과정(colloid

그림 2. (A) FITC를 함유하고 있는 PCM 마이크로 입자의 약물 방출 이미지 및 (B) 다양한 균일 입자를 포함한 PCM

블록의 온도에 따른 약물 방출 거동[Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 7904].

신진연구자 컬럼

crystallization)을 통하여 균일하게 배열하고, 그 배 열체 외부에 스캐폴드로 사용될 고분자 용액을 도입 한 후 동결건조를 통하여 고체화한다. 그 후에 균일 입자를 선택적으로 제거하게 되면 최종적으로 균일 기공을 갖는 스캐폴드를 제조할 수 있다. 결정화과 정을 통해서 제조된 균일 배열체를 opal 구조라 하 며, 제조된 균일 기공 구조는 그 반대되는 형상을 가 지고 있으므로 inverse opal 구조라 한다. 따라서 제 조된 균일 기공 스캐폴드는 통상 inverse opal scaffold라 부른다. [그림 3(B)]는 각각 chitosan과 PLGA로 만든 inverse opal scaffold의 이미지를 보 여주고 있다. 두 스캐폴드 모두 기공이 균일하게 배 열되어 있으며, 기공의 크기는 매우 일정함을 확인 할 수 있다. 또한 기공의 크기는 균일 입자의 크기를

변화시킴으로써 쉽게 제어 가능하다. 이러한 스캐폴 드는 균일 기공뿐만 아니라, 기공과 기공 사이에 균 일한 통로를 갖기 때문에 세포를 균일하게 배치할 수 있으며, 또한 영양분이나 산소의 공급에 효과적 이다. 그 외에도, 기존 스캐폴드는 샘플마다 조금씩 다른 기공 특성(예, 기공도)을 갖는데 비해, 균일 기 공 스캐폴드는 샘플간의 차이가 없이 거의 동일한 특성을 갖는다는 특징을 가지고 있다.

기공 크기는 세포의 성장이나 분화에 영향을 미치 는데, 세포마다 다른 최적의 기공 크기를 갖는 것이 보통이다. 따라서 균일 기공 스캐폴드는 세포의 거 동을 관찰하는데 모델 스캐폴드로 활용될 수 있을 뿐 아니라, 생체적합성 및 생분해 특징을 가지고 있 기 때문에 임상적으로도 적용 가능하다.

그림 3. (A) 균일 마이크로 입자를 이용한 균일 기공을 갖는 스케폴드의 제조 개념도 및 (B) Chitosan과 PLGA를 이용

한 균일 기공 스캐폴드의 SEM 이미지[Advanced Materials 2009, 21, 2997, Langmuir 2010, 26, 12126, Langmuir 2010,

26, 19001].

최성욱

내부에 빈 공간과 다공성 벽을 갖는 세포 전달체

본 연구는 세포를 캡슐화하기 위한 기반 기술로 써 연구되었다. 두 개의 채널을 갖는 미세 유체 채 널에 하나의 채널을 더 추가하여 세 개의 채널을 갖 는 미세 유체 채널을 만들었으며, 이중 에멀젼 (double emulsion) 공정을 이용하여 내부에는 빈 공간과 다공성 벽을 갖는 구조체를 제조하였다. 구 조체의 크기는 매우 균일하며[그림 4(A)], 큰 분자 량의 FITC-dextran이 다공성 벽을 통하여 쉽게 방 출되는 것을 확인하였다[그림 4(B)]. 이는 세포 성 장을 위한 영양분이나 산소가 다공성 벽을 통하여 쉽게 내부 빈 공간까지 전달될 수 있다는 것을 의미 한다. 최종적인 목표는 내부 빈 공간에 세포를 안정 하게 함유할 수 있는 세포 캡슐 제조에 있다. 예를 들면, 인슐린 분비를 관장하는 췌장 세포를 안정하 게 캡슐화한다면 당뇨병 치료에 활용될 수 있을 것 이다.

세포 전달 및 치료용 다공성 입자

본 연구는 미세 유체 채널을 이용하여 세포 전달 용 다공성 입자 제조에 관한 것이다. [그림 5(A)]

의 개념도에서 보듯이 불안정한 형태의 수상 오일 에멀젼(water-in-oil emulsion)을 미세 유체 채널에 도입함으로써 다공성 입자를 제조하였다. 입자 크기 는 약 300 µm로 매우 균일하며, 기공의 크기는 불 안정안 에멀젼의 상층부나 하층부를 미세 유체 채 널에 도입함으로써 제어될 수 있다. 상층부에 큰 수 상 방울들이 많기 때문에 제조된 입자의 기공은 커 지게 된다. [그림 5(B)]는 작은 기공(위)과 큰 기 공(아래)을 갖는 각각의 다공성 입자에 세포를 키 운 후, live/dead 염색법을 통하여 사멸 세포와 생존 세포를 이미지화한 결과이다. 기공이 클 경우에 거 의 모든 세포들이 오랜 시간동안 생존할 수 있다는 것을 관찰하였으며, 이러한 결과는 기공의 크기가 세포의 생존율에 큰 영향을 미친다는 것을 확인하 였다.

그림 4. (A) 세 개의 미세 유체 채널 공정 개념도 및 이를 이용한 이중 (W-O-W) 에멀젼 이미지, (B) 내부 빈공

간과 다공성 벽을 갖는 균일 마이크로 입자의 제조 및 시간에 따른 FITC-dextran의 방출 거동

[Advanced Functional Materials 2009, 19, 2943].

신진연구자 컬럼

비교적 부피가 큰 스캐폴드를 인체 내에 도입할 경우에는 대부분 외과적인 수술이 필요하다. 하지만 손상 부위의 크기가 작을 경우에는, 다공성 입자를 주사기로 투입함으로써 쉽게 치료 효과를 기대할 수 있다. 예를 들면 뼈의 손상 부위에 세포를 함유한 다 공성 입자를 주사기를 통하여 주입하여, 결손 부위 를 메워주는 치료에 적용될 수 있다. 또한 치료용 줄 기세포를 전달하는 캐리어로서도 활용가능하다.

결론

이상으로 미세 유체 채널을 이용하여 제조된 다양 한 생체재료에 대해서 살펴보았다. 본 공정에서 중 요한 점은 약물 전달, 조직공학 및 재생의학에 활용 될 수 있는 생체재료를 모두 간단한 미세 유체 채널

을 이용하여 제조 가능하다는 것과 재료에 한계가 거의 없다는 것이다. 제조된 생체재료들은 세포 및 응용에 따라 구조가 최적화되어야하며, 약물 함유 및 표면 개질을 통하여 더욱 많은 기능들이 추가될 수 있다.

조직공학과 재생의학의 발전을 위해서는 좀 더 많 은 공동연구가 필수적이다. 재료공학자들은 최적화 된 생체재료들을 개발하고, 생물학자들은 치료용 줄 기세포에 대한 연구 및 세포가 생체재료에 대하여 보이는 거동을 연구하며, 의학자들은 동물실험 및 인체실험을 통하여 최종적으로 검증하여야 한다. 조 직공학과 재생의학은 인간의 건강에 대한 기본적인 욕구를 향상시킬 수 있는 첨단 융복합 분야로써, 앞 으로의 비약적인 발전이 기대된다.

그림 5. (A) 다공성 입자 제조 공정 및 이를 이용하여 제조된 균일 크기의 다공성 비드의 이미지, (B) 기공 크기에

따른 세포 생존/사멸 이미지(붉은색: 사멸 세포, 녹색: 생존 세포)[Small 2010, 6, 1492].