Effects of Fermented Lotus Extracts on the Differentiation in 3T3-L1 Preadipocytes
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(2) 이신지 외: 연잎-연근 혼합 발효물의 지방세포 분화 억제 효과. 것이 아니라 식이개선과 그 식이를 보충해 줄 수 있는 건강. 추출물을 4가지 주요 유산균으로 각각 발효시킨 후 3T3-L1. 기능식품의 개발이 시급해지는 실정이다. 비만을 동반하는. 전지방세포의 분화 억제 활성과 CCAAT/enhancer-binding. 내과적인 질환을 연계해서 효율적으로 치료하는 방법들이. protein α (C/EBPα)와 peroxisome proliferators-activated. 다양하게 모색되고 있는 가운데 전통방식을 고수하여 한약. receptor γ (PPARγ)의 유전자 발현 억제 작용을 관찰하였다.. 4,5). 을 이용한 비만치료제 개발이 활발하게 이루어지고 있다 . 이는 안전하면서도 근본적으로 대사개선에 접근할 수 있으. 재료 및 방법. 면서 복용하기 편한 검증된 대체요법을 갈구하고 있는 현재 한약시장의 동향을 반영한 것으로 보여진다.. 1. 실험재료. 연(Nelumbo nucifera Gaertner, 連)은 한국 일본 등에. 본 실험에 사용한 약재는 인천광역시 강화군 선원면에. 널리 분포하는 고생대의 식물로 수련과에 속한 다년생 초본. 위치한 선원사 좋은 연 식품에서 선별된 하엽(연잎)과 우절. 6). 이다 . 꽃은 관상용과 차 재료로 이용해 왔으며 잎과 뿌리는. (연근)을 정선하여 사용하였다.. 식용으로 사용되어 왔다. 연잎에 해당되는 하엽(Nelumbo. 마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 American Type. nucifera leaves, 荷葉)은 더위를 내리고 습을 제거하며 지혈. Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구. 효과가 있어 暑濕으로 인한 설사 및 부종, 출혈질환에 치료. 입하였고, 세포배양은 10% fetal bovine serum (FBS;. 7). 하는 데 사용되어 왔고 , 연근에 해당되는 우절(Nelumbinis. Invitrogen, Grand Island, NY, USA)과 100 unit/ml. rhizomatis nodus, 藕節)은 연꽃의 근경 마디를 잘라 씻은. penicillin, 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL, Grand. 뒤 건조시킨 약재로 주름이 져 있고 짧은 원주상의 모양을. Island, NY, USA)이 함유된 DMEM (Invitrogen) 배지를. 하고 있으며 횡단면이 7~9개의 둥근 구멍이 있는 것이 특. 사용하였다. 발효에 사용된 4종류의 유산균(Lactobacillus. 징이다. 어혈제거 및 지혈 효과가 있어 열로 인한 각종 출혈. plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium. 8). 성 만성질환에 활용될 수 있다고 알려져 있다 . 연근과 연잎. breve, Bifidobacterium longum )은 Cellbiotech (Gimpo,. 의 약리작용에 대하여 국내외에서 다양한 연구들이 진행되. Korea)에서 구입하였다.. 어 왔는데, 특히 항비만작용, 내분비대사 및 지질대사에 대 한 연구가 많이 보고되어 있다. 연 추출물이 당뇨 유발 동물 모델에서 공복혈당, 총콜레스테롤, 중성지방을 감소시켜 항 9). 혈당 및 항지질 효과를 발휘한다는 연구보고가 있었고 연 10). 근이 비알콜성지방간과 항비만작용에 효과적이라는 결과. 2. 연잎-연근 추출물 및 발효물 제조 연근 2%와 연잎 2% 분말에 5.5% (w/v) 농도의 MRS powder를 첨가하였고 배지에 0.05% (w/v)의 L-cystein이. 및. 공급되어 발효에 필요한 균주가 선택적으로 잘 배양될 수. 연잎이 고지방식이로 유발된 비만 동물에 대하여 비만 증상. 있도록 하였다. 혼합 용액은 초음파 처리하여 입자들을 고. 11). 과 고지혈증을 개선시킨다는 점과. 12). 혈당강하효과 , 항산. 루 분산시킨 후 지속적인 흔들림을 주면서 항온수조에서. 등에 대해서도 각각 밝혀져 있다.. 70oC 조건하에 3시간 동안 처리하였다. 연근-연잎 혼합 추. 발효 한약의 항염14) 및 항비만15), 항당뇨16) 작용에 대한. 출물을 121oC에서 20분간 고압 멸균시킨 후 실온에서 충분. 효과가 지속적으로 보고됨으로써 최대의 치료 효과를 얻기. 7 히 식히고 4종류의 유산균이 2×10 colony forming units. 위해 발효 기술이 한약에 구현되고 있는데17) 본 연구에서. (CFU)/ml가 되도록 접종하여 Table 1과 같이 37oC에서 24. 또한 연근 및 연잎에 이를 적용하여 기존에 보고된 효과를. 시간 동안 발효시켰다. 발효되지 않은 대조군은 세균 접종. 배가시키고 한약이 가지고 있는 중금속 문제, 소화 불내성. 대신 연근-연잎 분말을 2% (w/v) 농도의 Milli-Q water. 13). 화 및 뉴런세포 보호효과. 18). 의 문제, 흡수 저하에 따른 약효 저감의 문제 에 대한 해소. 와 혼합하였고 고압멸균된 배지가 사용되었다는 점을 제외. 의 가능성을 보고자 하였다.. 하고 같은 방법으로 준비되었다. Incubation 처리가 끝난. 본 연구에서는 연잎-연근 혼합 발효물이 지방세포 분화 억제에 미치는 영향에 대해 연구하기 위해서 연잎-연근 혼합. 후 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액을 여과 하여 실험에 이용하였다. www.jkomor.org. 75.
(3) 한방비만학회지 제13권 제2호, 2013. Table 1. Bacterial Strains Used for Fermentation of Lotus Extracts Preparation. Major ingredients. Media type. A B C D. 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root 2% (w/v) lotus leaf+2% (w/v) lotus root. Bacterial strain. 5.5% MRS broth 5.5% MRS broth 5.5% MRS broth+0.05% L-cystein 5.5% MRS broth+0.05% L-cystein. Lactobacillus plantarum Lactobacillus rhamnosus Bifidobacterium breve Bifidobacterium longum. MRS: Man Rogosa Sharpe.. Table 2. The Primer Sequence Used for Real Time PCR Gene. Forward primer. Reverse primer. GAPDH C/EBPα. CGCAAGAGCCGAGATAAGC CGCAAGAGCCGAGATAAGC. CACGGCTCAGCTGTTCCA CACGGCTCAGCTGTTCCA. GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, C/EBPα: CCAAT/enhancer binding proteins.. 에 생성된 지방구를 염색한 후 그 변화를 현미경으로 관찰. 3. 3T3-L1 세포배양 및 분화유도 3T3-L1 세포는 10% FBS와 100 unit/ml penicillin, 100 μg/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin이 함유된 o. 하였다. 3T3-L1 세포가 분화 과정을 거친 후 배지를 제거하여. DMEM (Invitrogen) 배지를 사용하여 37 C, 5% CO2의 조. pH 7.4 phosphate buffer saline (PBS)로 세척하고 10%. 건에서 배양하였다. Real time polymerase chain reaction. formalin 용액으로 2시간 동안 고정한 후 60% isopropanol. 5. (PCR) 실험을 위해 6 well plate에 1×10 cell/well의 세포. 로 세척하였다. Microscope (Olympus BX61; Olympus,. 수로 분주했고 Oil red O 염색 실험을 위해서는 12 well. Tokyo, Japan)로 관찰한 후, Olympus DP70 digital camera. 5. culture plate에 1×10. cell/well의 세포수로 분주했다.. (Olympus)로 캡처하였다.. 2~3일에 한 번씩 신선한 배지로 보충하면서 세포분화가 최 대에 도달했을 때 세포를 DMEM 배지에서 분리하여 다른. 5. Real time PCR. DMEM 배지로 이동시켜서 약물처치 없이 그대로 두거나. 연잎-연근 혼합 발효물의 지방축적 감소 및 혈중지질대. (DMEM군), DM 배지(differential medium, DMEM에. 사의 분자생물학적 기전을 규명하기 위해서 연잎-연근 혼. 0.5 mM 3-isobutyle-1-methylxanthine [IBMX], 0.25. 합 발효물을 처리한 후 real time PCR을 이용하여 분화된. mM dexamethasone, 10 μg/ml insulin, 10% FBS, 100. 지방전구세포에서 C/EBPα의 mRNA의 단백질 발현 정도. unit/ml penicillin와 100 μg/ml streptomycin이 첨가된 분. 를 분석하였다.. 화배지)로 이동시켜서 여기에 발효된 연잎-연근 추출물과. 각 약물로 처리된 세포를 PBS (pH 7.4) 용액으로 세척한. 발효하지 않은 연잎-연근 추출물을 Oil red O 실험에 사용. 후, Trizol reagent (Invitrogen)를 이용하여 total cellular. 하였다. 이 상태로 4일간 배양 후 배지를 제거하고 동일한. RNA를 추출하였다. 각각의 실험 약물군에서 얻어진 2 μg. 처치를 반복하였다. 추가로 3일을 더 배양한 후 Oil red O. 의 RNA는 cDNA synthesis kit (Sprint RT Complete. 염색 혹은 real time PCR, Western blotting을 시행하였다.. Oligo-(dT)18; Clontech, Mountain View, CA, USA)를 이용해 역전사하여 first strand cDNA를 얻었다. Reverse. 4. Oil Red O 염색. transcription PCR (RT-PCR) 샘플은 Light Cycler-Fast. 연잎-연근 혼합 발효물이 3T3-L1 세포가 전지방세포에. Start DNA Master SYBR Green (Roche Applied Science,. 서 지방세포로 분화되는 과정에 어떻게 작용하는지 확인하. Indianapolis, ID, USA)을 이용하여 최종 반응 용량을 20 μl. 기 위하여 Oil red O 염색액을 이용하여 3T3-L1 세포 내. 로 하여 LightCycler instrument (Roche Applied Science). 76. www.jkomor.org.
(4) 이신지 외: 연잎-연근 혼합 발효물의 지방세포 분화 억제 효과. 에서 진행하였다. Primer 종류 및 서열은 Table 2에 표시한. MA, USA)와 4oC에서 overnight 반응하였다. 세척 후,. 바와 같다. PCR amplification은 C/EBPα에서 95oC에서 10. horseradish peroxidase-conjugated goat anti-Rabbit. o. IgG (Thermo Scientific)을 2차 항체로 하여 배양하였다. 그. o. 에서 10초간 denaturation, 52 C에서 10초간 annealing, 72 C. 후 electrochemiluminescence (ECL)으로 처리하여 image. 에서 15초간 extension)하였고 glyceraldehyde-3-phosphate. reader (LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 분. 분 동안 prior incubation 후, 50 cycle의 amplification (95 C o. o. dehydrogenase (GAPDH)에서는 95 C에서 10분 동안 o. prior incubation 후, 35 cycle의 amplification (95 C에서 o. o. 10초간 denaturation, 52 C에서 10초간 annealing, 72 C에. 석하였다. Resultant protein band의 강도는 densitometry 로 측정하였고, 단백질의 정량은 β-actin을 참고로 하여 분석하였다.. 서 15초간 extension)하였다. 데이터는 LightCycler Software (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)로 분석하. 7. 통계처리. 였다. 각각의 분석에서 cDNA 대신 물을 음성 대조군으로. 실험결과는 평균값±표준오차(mean±standard error)로. 사용하여 발생 가능한 primer-dimer 형성을 체크하였다.. 표시하였고 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이. 유전자의 전사레벨은 GAPDH를 기준으로 삼아 2-ΔCt (목. 용한 one-way ANOVA로 각 실험군 간의 통계적 분석을. 표한 유전자의 threshold 값－GAPDH의 threshold 값)를. 시행하였으며 Bonferroni 사후검정을 실시하였다. 실험의. 구하는 방식으로 계산되었고, 유전자의 발현량은 differen-. 통계적 유의성은 P값이 0.05 이하인 경우에 유의한 것으로. tiation media만 처리한 대조군을 1.0으로 간주하여 상대적. 보았다.. 인 값을 측정하였다.. 결 과 6. Western blot 분석 연잎-연근 혼합 발효물을 처리한 후 Real time PCR을. 1. 3T3-L1 전지방세포에서 지방세포로의 분화 억제 효과. 이용하여 분화된 지방전구세포에서 PPARγ의 단백질 발현. 3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로 분화되는. 정도를 분석하였다.. 과정에서 어떠한 변화가 나타났는지 Oil red O 염색을 확. Cell lysate preparation을 위해 처리된 세포를 PBS (pH. 인한 결과, 발효하지 않은 연잎-연근 추출물에 비해서 전. 7.4)용액으로 세척한 후, 4-(2-hydroxyethyl)-1-pipera-. 체적으로 발효된 혼합물의 지방구 수가 감소하는 것을 확. o. 인할 수 있었다. 그 중에서는 Bifidobacterium longum과. o. 에서 20분간 용해시켰다. 세포를 수거하여 14,000×g, 4 C. Lactobacillus plantarum에서 가장 뚜렷한 감소를 확인할. 에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 회수하여 BCA. 수 있었다(Fig. 1).. zineethanesulfonic acid (HEPES) lysis buffer에 넣고 4 C. Protein Assay kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 100 mM DTT를 o. 포함한 Laemmli sample buffer에서 95 C로 변성시킨 후. 2. 연잎-연근 혼합 발효물의 단백질 발현 및 특정 인슐린 수용체 관련 신호의 인슐린 자극 인산화 반응. 단백질 30 μg을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacry-. Real time PCR법을 이용하여 C/EBPα 유전자의 발현 정. lamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 resolve한 후,. 도를 관찰한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 대조군(0.00651). nitrocellulose membrane에 transfer시켰다. 5% 무지분유. 에 비해 발효 전 연잎-연근 혼합 추출물군(0.00733)은 발. 가 첨가된 tris-buffered saline (pH 7.6)에 넣고 상온에서 1. 현 억제 효과가 없는 것으로 나타나는데 반해 발효된 연잎-. 시간 동안 blocking시킨 후, anti-HMG-CoA reductase. 연근 추출물은 대조군에 비해서 각각의 유산균 별로 억제. antibody, anti-PPAR-γ antibody, anti-uncoupling pro-. 효과가 유의성 있게 나타났다(Lactobacillus plantarum. tein-2 antibody (Millipore, Billerica, MA, USA) 혹은. 0.00559, Lactobacillus rhamnosus: 0.00540, Bifidobac-. anti-β actin antibody (Cell Signaling Technology, Beverly,. terium breve 0.00490, Bifidobacterium longum 0.00516). www.jkomor.org. 77.
(5) 한방비만학회지 제13권 제2호, 2013. Undifferential media (DMEM). Differential media (DM). Unfermented lotus root in DM. Bifidobacterium breve in DM. Lactobacillus plantarum in DM. Bifidobacterium longum in DM. Lactobacillus rhamnosus in DM. Fig. 1. Effect of fermented lotus preparations on the fat accumulation in 3T3-L1 adipocytes is measured in Oil red O staining. Four different probiotics are used for fermentation.. 군간비교를 통해 Bifidobacterium breve 로 발효된 연 추출. PPARγ의 억제 효과가 통계적으로 유의하게 나타났으며 그. 물의 C/EBPα 발현 억제 효과가 가장 높은 유의성을 나타. 중 Bifidobacterium breve 의 억제효과가 군간비교를 통해. 냈다.. 가장 높은 유의성을 나타냈다.. PPARγ의 유전자 발현 정도는 Western blot방법으로 관 찰하였고 이에 대한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 정량적으. 고 찰. 로 분석했을 때 대조군(0.01758)에 비해 Bifidobacterium. breve (0.01371)와 Bifidobacterium longum (0.01531)이. 78. www.jkomor.org. 연은 국내를 비롯하여 아시아 남부에 널리 서식하는 식.
(6) 이신지 외: 연잎-연근 혼합 발효물의 지방세포 분화 억제 효과. Fig. 2. The level of gene expression of CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPα) in relation to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in the 3T3-L1 cells under different experimental conditions as indicated. C: control, UFL: unfermented lotus, FL: fermented lotus, LP: fermented by Lactobacillus plantarum, LR: fermented by Lactobacillus rhamnosus, BB: fermented by Bifidobacterium breve, BL: fermented by Bifidobacterium longum. † *Significantly different from control. Significantly different from UFL. Error bar means standard error.. Fig. 3. The level of gene expression of peroxisome proliferatorsactivated receptor γ (PPARγ) in relation to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in the 3T3-L1 cells under different experimental conditions as indicated. C: control, UFL: unfermented lotus, FL: fermented lotus, LP: fermented by Lactobacillus plantarum, LR: fermented by Lactobacillus rhamnosus, BB: fermented by Bifidobacterium breve, BL: fermented by Bifidobacterium longum. † *Significantly different from control. Significantly different from UFL. Error bar means standard error.. 물로 관상용 혹은 식용으로 다양하게 사용되고 있다. 연잎. 제재의 효과를 검증하는 과정이 꼭 필요한 시점이었다고 볼. 에 해당되는 하엽과 연근에 해당되는 우절은 한의학적으로. 수 있다. 아직까지는 연의 발효 추출물이 비만과 전당뇨, 고. 각각의 효능과 주치가 있는데 주로 열로 인해 발생되는 출. 지혈증을 포함하는 대사증후군에 어떠한 효과가 있는지에. 8). 혈성 질환에 효과가 있다고 알려져 있다 . 연의 항비만작용. 대해서는 연구가 거의 이루어지지 않은 실정이다.. 뿐만 아니라 내분비대사 및 지질대사 촉진에 유의한 효과가. 본 연구에서는 연잎 및 연근 성분이 발효된 상태에서 지. 있다는 연구결과가 나온 바 있으며, 연의 alkaloids, gerbs-. 방 분화 억제 효과를 나타낼 것인지에 대한 여부를 in vitro. toff, mucus 등의 성분이 신경안정, 염증억제, 위장장애개. 실험을 통해 규명하고자 하였다. 본 실험의 발효 과정에서. 선, 이뇨효과, 혈액순환개선, 탄수화물 소화지연작용, 항산. 사용된 유산균은 Lactobacillus 와 Bifidobacterium 균이다.. 19,20). 화효과와 항균효과가 있다고 보고된 바 있다. .. 이들 유산균은 당류를 발효하여 유산을 생성하며 체내 유익. 최근 발효 한약에 대한 많은 연구가 진행되고 있는 가운. 균을 생성하는 것이 특징이다25). 이들 자체만으로 체내 유. 데, 한약재에 미생물을 배양하여 발효하는 것은 한방의 전. 익균의 성장을 촉진하고 체내 콜레스테롤 흡수를 저해하는. 통적인 제약기술로서 오늘날까지 각종 한약 및 식품에 적용. 효과 등의 다양한 생리조절 작용이 우수하다고 알려져 있는. 5). 되어 다양한 질환에서 효과를 발휘하고 있다 . 자연에서 채. 데 이들이 연잎 및 연근과 발효되었을 때 어떠한 부가적인. 취한 그대로의 성분을 이용하는 것보다 독성과 부작용을 완. 효과를 나타내는지 관찰해 보고자 하였다.. 화시켜 주고 체내흡수율과 생체이용률을 극대화시켜 약리. 연잎-연근 혼합 발효물의 지방세포 분화 억제 효과를 조. 21). 적 효능을 향상시킬 수 있다는 점에서 각광받고 있는데. 사하기 위하여 Oil red O 염색을 시행하였고 광학현미경. 발효한 한약재가 그렇지 않은 것보다 항염증 및 항균효과가. 하에서 세포의 분화 양상을 관찰하였다. 발효를 거친 연잎-. 22). 더 뛰어난 것으로 보고된 바 있다 . 최근 비만, 당뇨병과 23). 연근 추출물은 약물처치를 하지 않은 DM군과 발효하지 않. 같은 대사증후군과 장내미생물 사이의 연관성 에 대한 연. 은 혼합물군에 비하여 염색된 지방구(lipid droplet) 수가. 구 결과가 발표되면서 발효 한약이 장내미생물의 균형을 유. 감소한 것으로 보아 지방량이 축적되는 정도가 감소되었다. 24). 지시켜주는 데 도움이 된다는 보고 가 있었다. 그러므로. 는 것을 알 수 있었다. 발효하지 않은 연잎-연근 혼합 발효. 지금이 발효 한약의 다양한 임상활용을 위해 새로운 발효. 물은 지방구가 비교적 규칙적으로 분포되어 있고 지방량이. www.jkomor.org. 79.
(7) 한방비만학회지 제13권 제2호, 2013. 많은 반면, 유산균으로 발효된 각각의 혼합물은 지방구가. 들의 발현을 조절하는 역할을 하는데32) 지방대사뿐만 아니라. 부서진 상태로 형태가 불규칙적이고 세포 분화량이 적게 나. 대사증후군, 염증반응 그리고 동맥경화증에 있어서 여러 가. 타났다. 그 중 특히 Lactobacillus plantarum으로 발효된. 지 유전자의 발현을 조절하는 역할을 한다고 알려져 있다33).. 군에서 지방세포의 지질층 형태가 가장 많이 변화하였고 불. 또한 말초 조직에서 인슐린 민감도를 항진시키는 데 있어서. 규칙적인 분화상태를 보이고 있다는 것이 관찰되었다. 즉,. 중요한 기능을 담당하는 것으로 예상되는데32) PPARγ 작용. Lactobacillus plantarum 이 고지방식이로 유발된 비만 동. 제 주입 시에 단백뇨의 감소, 혈압 강하 효과 및 혈중 지질. 물 모델에서 지방세포의 크기를 유의하게 감소시키는 효과. 대사에 영향을 준다는 점과33) 당뇨병 치료제 중 thiazoli-. 가 있다는 연구 결과26)를 바탕으로 지방세포 분화 억제 효. dinedione 계열에 속하는 pioglitazone이 PPARγ 작용제로. 과가 우수할 것이라고 예측해 볼 수 있다. Lactobacillus. 서 인슐린 저항성을 개선시켜 혈당을 조절한다32) 보고가 이. plantarum 이 인슐린 생성을 감소시키고 지질대사에 유효. 를 뒷받침해주고 있다.. 하게 작용하여 low densitiy lipoprotein (LDL) 콜레스테롤 27). C/EBPα의 유전자 발현 정도는 real time PCR 방법으로. 을 저하시키는 효과 가 있다고 밝혀져 연과 작용했을 때 역. 관찰하였는데 4종류의 유산균으로 발효한 군 모두 대조군. 시 유사한 효과가 나타날 수 있다는 것을 추론해 볼 수 있다.. 과 발효하지 않은 연 추출물 군과 비교했을 때 유의성 있는. 전지방세포인 3T3-L1 cell은 분화가 진행될수록 지방 생. 억제 효과가 나타났다. 4개의 발효군은 발효하지 않은 군에. 성에 관여하는 여러 가지 호르몬과 지방세포 특이적 단백질. 비하여 각각 Lactobacillus plantarum 24%, Lactobacillus. 마커 및 지방세포 분화와 관련된 전사인자(transcription. rhamnosus 26%, Bifidobacterium breve 33%, Bifido-. factor)가 발현되는데 지방구의 형성이 증가하면서 중성지. bacterium longum 30%의 감소 차이를 보였으며 그 중. 방이 증가하고 지방축적에 관여하는 효소가 활성화하면서. Bifidobacterium breve 가 실험군 간의 비교에서 가장 높은. 28). 점차적으로 세포 내 지방 축적이 일어나게 된다 . 본 실험. 통계적 유의성(P＜0.05)을 나타내었기에 가장 많은 활성 억. 에서 연잎-연근 혼합 발효물이 비만 억제 활성에 관여하는. 제를 야기한 것으로 확인되었다.. biomarker 변화에 어떠한 영향을 줄 수 있는지 살펴보기 위. PPARγ의 유전자 발현 정도는 Western blot 방법을 이용. 해 중성지방을 형성하는 효소들을 조절하는 전사 인자의 변. 하여 분석하였다. 각 군에서 나타나는 단백질 발현량을 정. 화를 관찰하였다.. 량화하여 분석한 결과, 발효되지 않은 연 추출물 군에 비해. C/EBPα는 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정. 발효된 상태의 혼합물 중 Bifidobacterium breve와 Bifido-. 중 지방 생성의 관여에 가장 중요한 역할을 하는 전사인자. bacterium longum으로 발효된 군의 억제 효과가 각각. 이다. PPARγ와 마찬가지로 지방세포의 후기 분화과정에. 22%, 13%로 나타났으며 군간 비교에서 다른 균들에 비해. 중요한 역할을 하는 전사인자이며 과다 발현할 경우 과다한. 높은 유의성(P＜0.05)을 나타내었기에 PPARγ의 발현을 억. 29). 지방세포 형성(adipogenesis)을 유도하는 역할을 한다 .. 제하는 데 있어 이 두 가지 균의 효과가 가장 좋은 것으로. 분화된 3T3-L1 세포를 고 포도당으로 처리한 경우 지방세포. 관찰되었다.. 에서 분비되는 단백질의 일종이며 인슐린 저항성을 발생시키. 이러한 결과는 선행 연구에서 밝혀진 Bifidobacterium. 는 결정적인 요소로 작용하는 것으로 알려진 adiponectin이. breve 의 항비만효과와34) Bifidobacterium longum 의 지질. 의의있게 증가하였다는 연구결과가 있었으며30) C/EBPα가. 과산화 억제 작용을 통한 혈중 지질 개선효과35)가 연의 효. 전지방세포에서 안슐린 민감성을 유도하는 중요한 역할을. 과와 배가되어 지방 생성을 억제하는 효과가 더욱 우수해지. 한다는 보고가 있었기에 당뇨병에서 인슐린 저항성의 발생. 는 가능성이 유의하게 관찰되었다고 볼 수 있다.. 기전의 규명과 억제 방법의 개발에 중요한 역할을 하고 있 31). 다는 것을 알 수 있다 .. 인슐린 저항성이란 인슐린에 대한 말초 조직의 반응 감 소를 뜻하는데 제2형 당뇨병으로 발생되기 전 단계에서 흔. PPARγ 역시 지방세포의 전사조절분자 중의 하나이다.. 히 나타난다36). 이는 대사증후군에 속하는 병리상태 중의. 이는 지방세포의 분화 및 지방합성과 저장에 관여하는 효소. 하나로 전당뇨상태(prediabetes)에 해당된다. 비만 환자에. 80. www.jkomor.org.
(8) 이신지 외: 연잎-연근 혼합 발효물의 지방세포 분화 억제 효과. 게 있어 인슐린 저항성에 의해 야기되는 당뇨병은 고지혈증. 루어 볼 때, 발효된 연의 지방세포 분화 억제 효과를 짐작할. 과 함께 가장 흔히 발생되는 질환이라고 할 수 있다. 종양괴. 수 있다.. 사인자인 tumor necrosis factor alpha (TNF-α)는 비만이. 2. 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자의 변화를 관찰. 진행되는 과정에서 분비되는 염증 유발 사이토카인으로 인. 하기 위해 C/EBPα 유전자의 발현 정도를 real time PCR법. 37). 이는 고인슐린혈증을 야기. 을 이용해서 관찰하였는데 연잎-연근 혼합 발효물은 대조. 시켜 고지혈증 및 고콜레스테롤혈증을 발생시킨다. 비만에. 군 및 발효하지 않은 연 추출물 군과 비교했을 때 각각의 유. 의해 발생되는 인슐린 저항성과 전당뇨, 더 나아가 제2형. 산균 별로 지방세포 분화 억제 효과가 유의성있게 나타났으. 당뇨병은 밀접한 연결 고리를 형성하고 있어 비만과 관련된. 며 군간비교를 통해 그 중 Bifidobacterium breve 로 발효된. 일련의 병리작용의 진행을 억제시키는 치료 약물의 개발이. 연 추출물의 C/EBPα 발현 억제 효과의 유의성이 가장 높게. 매우 시급한 실정이다. PPARγ가 인슐린 촉진 포도당 흡수. 나타난 것을 확인할 수 있었다.. 슐린 저항성을 발생시키는데. 를 증가시키는 동시에 지방 분화를 촉진하는 역할을 하기 38). 때문에. 3. 지방세포의 분화에 관여하고 인슐린 저항성을 조절하는. 연과 유산균을 이용한 발효제재가 혈당 증감제의. 또 다른 전사인자인 PPARγ의 유전자 발현 정도는 Western. 역할을 하여 상승된 인슐린 농도를 저하시켜서 당대사를 개. blot 방법으로 관찰하였는데 대조군에 비해 Bifidobac-. 선하는 효과뿐만 아니라 혈중 지질대사를 정상화하여 전반. terium breve 와 Bifidobacterium longum 의 PPARγ 발현. 적인 대사기능을 원활하게 하는 약재로 활용될 수 있을 것. 억제 효과가 통계적으로 유의하게 나타났다. 군간 비교에서. 으로 보인다. 그러므로 비만으로부터 비롯된 전당뇨, 고지혈. Bifidobacterium breve 가 다른 군과 비교했을 때 가장 높은. 증 등의 대사증후군 치료를 위한 발효 연 추출물의 향후 개. 억제율을 나타냈다.. 발 가능성은 높을것으로 사료된다. 본 연구에서는 연잎-연근 혼합 발효물이 3T3-L1 전지. 감사의 글. 방세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제하고 지방세포 분 화와 관련된 전사인자의 활성을 억제함으로서 전당뇨 및 고 지혈증 치료에 대한 활용 가능성을 확인할 수 있었다. 추후. 본 논문은 2010년 중소기업청 예비 기술 창업자 육성사 업의 지원으로 이루어졌으며 이에 감사드립니다.. 에는 지방세포의 활성을 억제시키는 경로뿐만 아니라 인슐 린과 혈중 지질 조절의 작용에 관여하는 다양한 반응 경로. References. 에 대한 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 보인다. 본 연구에서 이용된 발효물질의 보급 및 상품화를 추진하기 위해서는 유산균과 연 사이에 발생되는 발효 효과의 안전성 및 추가적인 약성을 더욱 구체적으로 규명할 수 있는 연구 가 필요할 것으로 생각된다.. 결 론 3T3-L1 전지방세포에서 연잎-연근 혼합 추출물을 4가 지 유산균과 발효시켰을 때 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 연잎-연근 추출물을 4가지 유산균으로 발효시킨 후 Oil red O 염색법으로 지방세포 분화 억제 여부를 관찰한 결과, 발효 전 연잎-연근 추출물보다 염색된 지방구의 수가 감소하고 지질 세포의 이중층막의 형태가 분해된 것으로 미. 1. KNHANES. Health behaviors and chronic disease statistics. Cheongwon: KNHANES; 2010. Available from http://knhanes. cdc.go.kr/knhanes/index.do. 2. Lee HS, Anesthetic management of the bariatric surgery. J Korean Med Assoc. 2012 ; 55(10) : 996-1002. 3. DeFronzo RA, Ferrannini E. Obesity, hypertension, dyslipidemia, and atherosclerotic cardiovascular disease. Diabetes Care. 1991 ; 14(3) : 173-94. 4. Song MY, Bose S, Kim HJ. Effect of probiotics-fermented Samjunghwan on differentiation in 3T3-L1 preadipocyte. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2013 ; 42(1) : 1-7. 5. Kang DH, Kim HS. Functionality analysis of korean medicine fermented by Lactobacillus strains. Korean J Microbiol Biotechnol. 2011 ; 39(3) : 259-65. 6. Kim SM, Yun HJ, Yi HS, Won CW, Kim JE, Park SD. Original articles: Nelumbo nucifera Leaves Inhibit HASMC proliferation and migration activated by TNF-α . The Society for Herbal. www.jkomor.org. 81.
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수치
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