의 대부분이 헤테로발효를 한다.

□ 연구목적

○ 친환경적인 전지를 개발해 배터리 매립지와 같은 환경 파괴적인 시설 의 제거를 목표로 하고, 이와 관련된 다양한 연구 주제를 모색한 뒤 가장 유력한 주제인 유산균 발효 젖산을 이용한 전지개발로 주제 선정하였다. 이후 외부전문가의 자문에 따라 그의 하위 주제로 파생 되는 유산균의 생물학적 효용성 탐구를 연구 계획에 추가 보강하였 다.

□ 연구범위

○ 기존 발효 환경에서 서식하는 균 중 산을 내는 종을 탐색하였다.

○ 충분한 산을 부산물로 내는 균, 그 중에 Leuconostoc종(Kimchi I, Gasicomitatum, Citreum)과 Lactobacillus종(Paraplantanum, Casei, Plantarum)의 증식과 산의 생성을 관찰하고 비교한다.

○ 이전의 유산균 배양 배지와는 달리, 주변에서 쉽게 볼 수 있는 폐기물 형태의 배추로 배지를 제작해 새로운 에너지를 창출하는 방안을 제시 한다.

○ 유산균 배양이 이루어지고 균을 다시 사용할 시의 면역학적 효용성을 검증하여 낭비되는 자원이 없는 전지생산과정을 제시한다.

2. 연구 수행 내용

□ 이론적 배경 및 선행 연구 ○ 발효과정

-homolactic fermentation(호모 발효) C₆H₁₂O₆ → 2 CH₃CH(OH)COOH

Lactobacillus의 대부분이 호모발효를 한다.

-heterolactic fermentation(헤테로 발효)

C6H12O6 → CH3CH(OH)COOH + C2H5OH + CO2

Leuconostoc의 대부분이 헤테로발효를 한다.

암세포

세포독성 (킬러)T 세포

(Tc) 1.종양항원 으로 취급

2. 활성화

대식세포

3. 인터루킨-1 (IL-1) 분비 3. 종양괴사인자

(TNF)분비à파괴 B세포

4. 항체생성 à

섭식작용 활발히 다른

면역 세포

다른 면역 세포

그림 2 대식세포의 반응

○ 면역세포의 암에 대한 반응

암에 대한 면역세포의 반응은 다양하지만 그 중 대식세포만의 반응을 정리 하자면 다음 그림과 같게 된다.

이때 대식세포는 사이토카인을 만들게 된다.

□ 연구주제의 선정

○ 3월 18일 교내 R&E 아이디어를 구상하기 위해 오후동안 모였다.

팀원 3명이서 각자 여러 아이디어를 구상한 뒤에 서울대 박사과정을 하신 김태훈 선생님께 자문을 구하였다. 가장 유력한 연구주제를 선정하고, 이후 서울대 연구실에서 외부전문가 정가진 교수님으로 부터 조언을 들었다.

□ 연구 방법

○ 산전지의 원리를 이해했으나 산전지가 전류가 흐른다는 것을 확인할 필요가 있었다. 그에 따라 아세트산과 과산화수소를 전해질과 감극 제로, 구리와 알루미늄은 전극으로 활용해서 볼타전지를 만들어 확 인하였다.

○ 유산균 발효를 위해서 유산균을 접종하고 배양하는 방법을 알아야 했다. 그에 따라서 서울대 연구실을 방문해 루프를 이용한 접종, Agar plate 활용법, 배지의 구성 요소, 균의 3차 Streaking과 균의 Spreading

방법을 익혔다.

○ 다양한 유산균이 증식하면서 나타나는 pH 변화를 측정하여 낮은 pH를 보이는 유산균을 선별하였다.

○ 가장 낮은 pH를 보이는 것으로 선정된 균 2종(Leuconostoc gasicomitatum, Lactobaccilus casei)을 토대로 대조군 3개(MRS, GYP, 배추)와 실험군 2세트 5개씩(배추:GYP 비율- 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1/

배추:Glucose 2%용액- 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1) 의 액상 배지를 선정하고 균 2종을 접종하여 pH 변화를 관찰하였다.

○ 유산균의 생물학적 효용성을 면역학적 관점에서 검토하기 위해 이전 과정에서 사용한 유산균 2 종을 heat-killing한 후에 대식세포에 시간 별로(미처리 대조군/30분, 1시간, 2시간) 처리하고, 대식세포의 RNA 를 추출한 다음, RT-PCR을 통해 사이토카인의 발현을 겔 전기영동으 로 확인하였다. 또한 생쥐에 유산균을 경구 투여하여 관찰한 유산균 의 생물학적 효용성을 재차 확인하였다.

□ 연구 활동 및 과정

○ 발효 환경에서 서식하는 미생물 탐색

본 연구과정에서는 액체 전지 생성을 위해 많은 양의 산을 만들어 내 는 미생물을 탐색하는 목적을 가지고 있다. 또한 산을 생성하는 미생 물 중에서 사람이 먹어 정장 작용을 증가 시키거나 면역 활성을 높이 는 균을 탐색 하고자 하였다. 미생물의 탐색은 크게 두 영역으로 좁 혀 실험을 진행 하였다. 첫째는 배추와 김치로부터 증식하는 유산균 을 주 목표로 하였다. 둘째는 유재품의 발효로 만들어지는 치즈나 발 효식품에 존재하는 유산균을 목표로 하였다.

1 2 3 4 5 6

김치 간장 고추장 치즈 요거트 정장제

표 1 <시료의 종류>

시료는 총 여섯 가지를 선택하여 실험을 진행하였다.

배지는 일반 영양배지로 potato dextrose agar(PDA)를 사용하였으며, 혐기적 환경에서 발효가 일어나는 유산균을 선별하기 위해 MRS(Gibco) 배지를 이용하였다. 각각의 시료는 1mL 씩 추출하여 연 속희석법의 방법으로 평판배지에 도말하였다.

- Gimsa 염색을 통한 미생물 관찰 및 생화학적 특성 확인

Gimsa 염색은 crystal violet, Gram's iO.D.ine, 95% ethyl alcohol, safranine을 이용하여 염색하였다. 관찰은 1000배 의 광학현미경 (nikon)으로 관찰하였다. 생화학적 특성은 indol test, catalase test, 등 을 사용하여 분리된 미생물의 종류를 확인하였다.

○ 균의 산도 screening

배추김치, 깍두기, 동치미, 치즈, 유산균음료, 유산균정장제에서 시료를 채 취해 각각 MRS배지에 접종하였다. 그리고 혐기적 대사를 진행할 수 있도록 가열을 통해 산소를 제거해 주었다. 그리고 12시간마다 O.D.를 측정하여 균의 생장곡선을 그렸다. 균의 산 생성 여부를 알아보기 위해 stationary phase에 이르렀을 때 두 가지 방법을 통해 그 여부를 확인하였다.

- Calcium phosphate를 이용한 산 생성 시각화

Calcium phosphate는 산성에서 다음과 같은 반응을 통해 산을 시각화한다.

Ca_PO__  RH ↔H_PO_  CaR

이때 H_PO_는 흰색 고체로써 뿌옇게 나타나게 된다.

- Phenol red를 이용한 산 생성 시각화

보다 정확한 유산균의 분리, 동정을 위해 Phenol red 용액을 사용하였다.

Phenol red는 pH 6.8이하에서 노란색, 중성에서 빨간색, pH 8.2이상에서 자주색을 띠어 세포 생물학에 자주 사용된다.

Phenol red 지시약을 사용하기 위해 agar배지에 균을 접종하고 자람에 따라 주황색, 노란색 순으로 변하면서 배지의 pH변화를 알 수 있게 한다.

그리고 colony 중 노란색으로 변한 것을 선별하여 16s rRNA 분석을 통해 균의 종을 파악하였다.

○ 산 생산에 적합한 유산균 세부 분석

균의 산도 screening 실험을 통해 대표적인 유산균 6종 (Leuconostoc kimchii, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei, Lactobacillus Plantarum, Leuconostoc Citreum) 중에서 산 생산에 적합한 균주를 선별하였다. 균을 선별하기 위해 균을 접종한 broth의 pH 변화와 O.D. 값을 12Hr 마다 3번, pH는 pH테이프지로 O.D.

값은 O.D.측정기기(powerwave x. BIOTEK)로 측정하였다.

Broth는 MRS, MRS+, GYP, GYP+ (‘+’는 glucose 를 10g/L 더 추가 한 것임)로 5mL씩 이용하였다. 이와 같이 다양한 broth에 균을 접종 하여 경제성 있는 배지를 디자인 할 때 참고하였다.

○ 유산균을 접종한 배지의 종류와 성분에 따른 pH변화 측정

그림 2 pH 변화 실험장치

-배지의 종류에 따른 pH변화 측정

산 생산에 적합한 유산균 세부 분석에서 pH와 O.D.값에 따라 균 2종

(Lactobacillus casei, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus paraplantanum)이 선별되었다. 하지만 paraplantanum의 경우 agar에서의 성장이 매우 느려 실험의 대상에서 제외하였다. 그리고 앞서 말했듯이 MRS나 GYP 배지는 경제적으로 효율성이 떨어져 본 연구의 취지에 맞지 않아 이를 대체할 경제적인 배지가 필요하다. 본 연구에서는 배추를 갈아 배추즙을 만들어 사용하였다. 배추는 김치 발효가 이루어지는 환경으로써 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides 등의 여러 유산균이 자라는 것으로 알려져 있다. 그리고 보다 효율적인 배지를 만들기 위해 포도당 용액[20g/L]와 GYP배지를 배추와 각각 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1의 비율 로 섞어 두 종의 유산균을 접종하고 pH를 측정하였다. pH를 측정하기 위해서는 ‘pH Sensor’(Vernier Software & Technology)를 이용하였다.

비교를 위해 MRS, GYP, 배추, 혼합 배지를 각각 10mL씩 취하여 autoclave(ALL AMERICAN-PRESSURE STERILIZER MO.D.EL NO.

1925X)를 한 후 균을 접종하고 인큐베이터에 넣어 37℃에서 하루 간 격으로 7일간 pH를 측정하였다.

그림 3 pH 측정 MBL 실험장치

○ 유산균의 생물학적 효용성의 검토와 증명

유산균의 생물학적 효용성을 면역반응을 통해 관찰하고자 했다. 이를 위해 사람이 유산균을 직접 복용하는 상황을 실험모델로 선정하였다.

Balb/c mouse에게 직접 유산균과 Pathogen을 경구투여하여 유산균을 투여한 군과 그렇지 않은 군을 비교하는 실험과, 대식세포에 직접 처 리하여 대식세포의 사이토카인 분비량을 유산균 처리 유무, 시간과 종에 따라 비교하는 실험을 진행하였다.

그림 4 RNeasy mini kit를 이용한 실험

-대식세포의 사이토카인 발현정도로 파악한 유산균의 생물학적 효용성 유산균 균주의 배지는 Lactobacilli MRS broth (Difco 0881)를 사용하 였으며, 25℃ incubator에서 대수기까지 배양하였다. 유산균은 인체에 서 소화된 형태로 면역세포에 노출되며, 인체 섭취를 모델로 삼았기 때문에 수확하여 PBS(phospatate buffered saline, pH7.2)로 3회 세척한 후 1x10¹²cfu/ml의 농도로 100℃에서 20분간 가열하여 heat-killing을 거친다. 유산균을 처리를 위한 대식세포주는 TNF-α, IL-6, β-actin 을 분비하는 AW 264.7 세포주를 사용하였다. AW 264.7 세포주는 10% fetal bovine serum 과 50ug/ml gentamycin을 넣은 RPMI 1640 media (Gibco BRL)을 이용하여 37℃, humidified 5%

CO2incubator(FormaScientific)에서 배양하였으며, 고착성을 갖는 세포 를 cell scraper로 회수, 부유시켜 사용하였다. RAW 264.7cell을 6-well plate에 3x10⁵cells/well이 되도록 분주한 후, 1x10¹⁰cfu/well의 유산균 균주를 시간별(미투여 대조군/30min/1hr/2hr)로 처리하여 37℃, humidified 5% CO₂incubator에서 배양하였다.유산균을 세포주에 시간 별로 처리하여 배양한 후, RNeasy mini kit (Qiagen, USA)을 이용하여 RNA를 분리하였다.

모든 RT-PCR 분석에서는 2μg RNA를 주형으로 하여 AMV reverse-transcriptase (Intron biotechnology)를 이용하여 실시하였다.

RT-PCR 분석용 mixture는 37℃ 온도조건에서 60분 간 반응한 후 97℃에서 10분 간 가열하였다. PCR 분석은 5 U/μl Taq polymerase

(Takara Co., Japan)를 이용하여 준비된 total cDNA의 _



 의 양을 사용하여 실시하였다. PCR이 끝난 후, 1.0% agarose gel을 이용하여 prO.D.uct를 전기영동하였으며 ethidium bromide (Sigma-Aldrich Co., MO, USA)로 염색하여 각 사이토카인의 발현정도를 cDNA band(그림 c)의 형성여부를 통해 관찰하였다. PCR 분석 조건은 다음과 같다:

94℃, 30 sec for denaturation; 58℃, 30 sec for annealing; 72℃, 30 sec for polymerization; 총 30 cycles. 실험에서 사용한 PCR primer는 다음과 같다.

Forward Primer Reverse Primer Mouse

TNF-α

5′-ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC-3′

5′-TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT-3′

IL-6 5′-GAC AAA GCC AGA GTC CTT CAG AGA G-3′

5′-CTA GGT TTG CCG AGT AGA TCT C-3′

β-actin 5′-TGT GAT GGT GGG AAT GGG TCA G-3′

5′-TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3′

-생쥐에 유산균을 경구 투여하여 관찰한 유산균의 생물학적 효용성 모든 생체 내 실험동물은 (주)샘타코에서 분양 받은 약 18~20g, 생후 5~6주의 female Blab/c 생쥐를 플라스틱 cage에 넣고 고형사료와 물 을 제한없이 공급하며 12시간 일광을 주기로 온도 24℃, 습도 50%를 유지하는 항온 항습 동물 사육장에서 사육하였다. 모든 생체 내 실험 은 환경 적응기를 주기 위해 1주일간 사육한 후 시작하였다.

Pathogen으로 Salmonella thyphimurium(ATCC 14028)을 사용하였으며 생쥐를 3군으로 나누어 day –14부터 day –1까지 14일 동안 Gasicomitatum, L.casei, 물을 각 군별로 먹이고 day 0에 Salmonella thyphimurium을 2x10⁸cfu/ml의 농도로 맞추어 마리당 200ul씩 경구투 여하고, 다시 day +1부터 day +5까지 Gasicomitatum, L.casei를 각 군 별로 먹인 후 생존시간을 관찰하였다.

○ 전지구현 -전지구현

비커에 농축한 발효젖산 전해질을 넣은 후 이온화 경향이 다른 두 금속 (Cu,Al)을 전극으로 삽입하였다. 배추+GYP(1:9) 1000mL로 15개의 셀을 제작하였고, MRS 1000mL로 15개의 셀을 제작하여 직렬로 연결하였다.

3. 연구 결과 및 시사점

□ 연구 결과

○ 발효 환경에서 서식하는 미생물 탐색

① 각각의 발효환경에 존재하는 미생물 colony 종류

1 2 3

4 5 6

표 3 미생물의 종류

1 2 3

4 5 6

표 4 균의 Gram 염색 관찰

② 대표적인 균의 Gram 염색관찰

발효가 잘 진행된 환경에 있는 균은 대부분 그람 양성 간균의 형태로 확인 되었다. 김치에서는 구형처럼 보이는 단 간균 형태로

Leuconostoc종류와 유사한 특성이 나타났다. 유제품과 유산균 정장제

의 경우 그람양성 간균이 뚜렷하게 관찰되는데 Lactobacillus 종류와 유사한 특성임을 확인 할 수 있었다.

○ 균의 산도 screening

-Calcium phosphate를 이용한 산 생성 시각화

6개의 시료를 agar배지에 접종하여 Calcium phosphate를 이용해 산 생성을 확인하였다. 6종 모두 Calcium phosphate에 의해 뿌옇게 되는 효과가 보여 유산균을 분리, 동정할 때는 유용하지 않았다.

-Phenol red를 이용한 산 생성 시각화

Phenol red를 이용해 시료를 재접종하고 산 생성을 관찰하였다. 그리고 노란색으로 변한 부분을 16s rRNA 분석을 의뢰해 균종을 파악하였다. 생성

된 균종은 Leuconostoc kimchii, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei, Lactobacillus Plantarum , Leuconostoc Citreum으로 확인되었다.

○ 산 생산에 적합한 유산균 세부 분석

그림 5 실험 결과 사진

네른스트 식을 살펴보면 broth의 pH가 낮을수록 전지의 산으로 이용 할 시에 전압이 높다는 것을 알 수 있다. 따라서 broth의 pH 가 가장 낮은 균주가 적합하다. 실험결과 Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei의 pH가 낮은 것을 확 인 할 수 있다.

Day 1 오전 Day 1 오후 Day 2 오전

그림 6 실험결과

O.D. 값은 유산균의 개체 수를 간접적으로 측정하는 방법이다. 균주 별로 개체 수를 파악함으로써 어떤 균주가 건강 기능 식품에 이용할 시 경쟁력 있는지 판단 할 수 있다. 측정결과 Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei 가 다 른 균주에 비해 O.D.값이 크다. 즉, 이 세 균주가 개체 수가 많아 건 강 기능 식품으로써 의 경쟁력이 높다.

pH 측정결과와 O.D.값 측정결과를 보면 Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei가 pH가 낮을 뿐만 아 니라 개체 수도 많다는 것을 알 수 있다. 또한 GYP배지보다 MRS배 지에서 균이 더 잘 자란다는 것도 확인 할 수 있다.따라서, 이 결과를 통해 개체 수가 많을 수록 그 만큼 젖산이 많이 생성되어 결과적으로 낮은 pH로 이어진다는 것을 유추 할 수 있다.

이로써, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei 3종을 산 생성에 적합한 유산균으로 선별하였다.

○ 유산균을 접종한 배지의 종류와 성분에 따른 pH변화 측정

-배지의 종류에 따른 pH변화 측정

Lactobacillus casei와 Leuconostoc gasicomitatum를 MRS, GYP, 배추 즙, 포도당+배추즙(1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1), GYP+배추즙(1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1)에 접종하였다(그림: 접종 9일째).

그림 7 접종 9일째

그 결과 Lactobacillus casei와 Leuconostoc gasicomitatum는 배추, GYP, MRS를 비롯한 모든 혼합배지에서 증식하는 것으로 관찰되었다.

그리고 배추와 포도당 혼합배지에서 배추와 포도당의 비율이 1:9일 때 가장 잘 증식하는 것으로 보인다. 배추와 GYP 혼합배지에서도 역 시 배추와 GYP의 비율이 1:9일 때 가장 잘 증식하는 것으로 보였다.

또한 배추+GYP(1:9), 배추+포도당(1:9)와 배추, GYP, MRS배지를 비교 하였을 때 배추:포도당(1:9)과 GYP가 비슷한 정도로 가장 잘 증식하는 것으로 보인다.

표1,2에는 각각 Lactobacillus casei와 Leuconostoc gasicomitatum를 하 루에 한번, 7일간 측정한 MRS, GYP, 배추, 혼합배지의 pH를 나타낸 것이다. 배추나 혼합배지의 초기 pH가 낮은 것은 배추가 기본적으로 내는 유기산 때문으로 보인다. 배지에 따라 차이가 있지만 대체적으 로 모든 배지가 1~3일에는 pH가 낮아지고 3~5일 사이에서 최저의 pH

L.casei Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day 7

MRS 6.26 4.15 4 4 3.77 3.94 4.22

GYP 6.14 3.99 3.72 3.73 3.49 3.63 3.95

배추 4.05 4.04 3.96 3.98 3.74 3.9 4.16

G:배 1:9 4.05 4.09 3.95 3.97 3.73 3.91 4.15

3:7 4.16 4.07 3.97 3.99 3.71 3.86 4.15

5:5 4.32 4.12 3.99 4 3.73 3.83 4.02

7:3 4.59 3.99 3.8 3.82 3.52 3.66 3.97

9:1 5.13 3.74 3.54 3.57 3.3 3.46 3.78

포:배 1:9 4 4 3.91 3.94 3.67 3.84 4.09

3:7 4.02 3.96 3.88 3.92 3.63 3.83 4.08

5:5 4.1 3.96 3.83 3.86 3.57 3.75 4.01

7:3 4.06 3.83 3.64 3.67 3.38 3.55 3.81

9:1 4.06 4.06 3.31 3.34 3.03 3.26 3.57

표 5 pH값의 변화

L.gasicomitatum Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 Day 5 Day 6 Day 7

MRS 6.25 4.18 3.99 4.03 3.74 3.96 4.16

GYP 6.2 4.58 4.04 4.06 3.77 3.96 4.14

배추 4.07 4.09 4.04 4.06 3.67 3.79 3.86

GYP:배추 1:9 4.1 4.09 3.75 3.77 3.44 3.74 3.86

3:7 4.18 4.03 3.59 3.64 3.32 3.59 3.76

5:5 4.31 3.82 3.59 3.59 3.27 3.49 3.7

7:3 4.68 3.78 3.58 3.6 3.26 3.49 3.7

9:1 5.17 3.86 3.63 3.68 3.33 3.57 3.76

포도당:배추 1:9 4.04 4.09 3.85 3.85 3.43 3.66 3.74

3:7 4.01 4.08 3.63 3.66 3.32 3.54 3.69

5:5 4.07 3.93 3.43 3.48 3.15 3.41 3.58

7:3 4.13 3.56 3.35 3.4 3.03 3.28 3.43

9:1 4.2 3.4 3.1 3.18 2.78 3.07 3.18

표 6 pH값의 변화

를 가지며 6일 이후로는 상승하는 경향을 보인다.

Lactobacillus casei와 Leuconostoc gasicomitatum의 두 경우 모두 포도 당+배추 혼합배지(9:1)의 11/19일 pH가 가장 낮음을 확인할 수 있다.

○ 유산균의 생물학적 효용성의 검토와 증명

-대식세포의 사이토카인 발현정도로 파악한 유산균의 생물학적 효용성 Macrophage는 여러 가지 factor에 의해 자극을 받아 활성화 될수 있 는데 이러한 과정에서 TNF, cytokine protein등을 분비하여 항암효과 를 비롯한 면역반응을 일으킨다. 따라서 TNF를 비롯한 cytokine의 발 현량을 측정함으로써 Leuconostoc gasicomitatum와 L.casei에 의한 Macrophage의 활성화 정도를 측정할 수 있으며, macrophage-like cell line인 RAW 264.7 cell 역시 같은 방법으로 활성화 정도를 측정할 수 있다. 유산균을 RAW 264.7 cell에 처리하여 TNF, IL-6의 발현량을 측 정한 결과, 유산균을 처리한 세포에서 TNF와 IL-6 모두 높게 발현되 는 것을 확인하였으며 , gasicomitatum의 경우 1h, L.casei의 경우 2h 에서 가장 높은 발현을 보였다. 이를 통해 유산균은 macrophage를 활 성화시켜 항암작용 및 면역을 유도할 것으로 생각할 수 있다.

-생쥐에 유산균을 경구 투여하여 관찰한 유산균의 생물학적 효용성 유산균은 장기 복용 했을 때 장내 세균총을 정상화시켜 diarrhea를 예방하고 면역계를 활성화시키는 것으로 알려져 있다, 장내에서 nisin과 같은 bacteriocin을 분비하여 병원성 세균의 성장을 저해하고, mutagenic compound와 결합하여 tumor development를 지연시키거나 억제한다. 또한 장점막의 toxin receptor를 degradation시켜 장을 질병으로부터 보호하고 nutrient와 장점막의 adhesion site에 대해 병원성 세균과 경쟁하여 우위를 지킴으로써 이들의 번식을 막는다.

이러한 사실로부터 김치에서 분리한 유산균이 복용했을 때 면역계를 활성화시키고 장내에 정착하여 병원균에 대한 방어력을 높일 수 있는 지 알아보기 위해 생쥐에게 유산균을 장기간 먹인 후, 병원균을 경구 투여하여 이에 대한 생존율을 비교하였다.

그림 9 생존율

Pathogen으로는 Salmonella thyphimurium(ATCC 14028)을 사용하였으며 생쥐를 3군으로 나누어 각 군별로 Leuconostoc. gasicomitatum, L.casei, 물을 14일동안 먹인 후, Salmonella thyphimurium을 경구투여 하고 생존시간 및 생쥐의 상태를 관찰하였다.

실험결과 유산균을 먹인 실험군의 생존기간이 대조군에 비해 훨씬 높 은 수준으로 연장되었으며, 특히 Leuconostoc gasicomitatum를 경구 투여한 실험군의 60%이상이 완치되는 효과를 보여 유산균이 장내에 서 정착하여 정상 세균총을 유지시키고 병원균에 대한 방어능력을 높 이는 것을 알 수 있다. 또한 이러한 효과는 유산균에 따라 차이를 보 이는 것을 알 수 있으며, 그림 9에서 보이듯이, 물 투여군은 생존율이 0%인 데 비해 Leuconostoc gasicomitatum 투여군이 최종 60% 생존율, L.casei투여군이 최종 20%의 생존율을 보인다.

○ 전지구현 -전지구현

그림 10 전지

기전력은 12.6V가 측정되어 경쟁력이 있다는 것을 확인하였다.

□ 시사점

○ 현재 우리가 사용하고 있는 전지 중에서는 제작과정이나 사용에 유독 한 것이 많다. 특히 자동차에 쓰이는 황산전지의 경우 그 생산과정에서 이산화황과 산화바나듐 등의 물질이 쓰이는데, 특히 산화바나듐을 흡입할 경우 같은 양의 비소보다 유독한 것으로 나타난다. 본 연구에서는 유독한 물질을 대체하는 친환경적이고 인체에 무해한 전지를 개발하기 위해 유산 균을 활용하였다. 먼저 6개의 시료-배추김치, 깍두기, 백김치, 치즈, 유산균 음료, 유산균 정장제를 활용하여 유산균의 생화학적 특성을 파악하였다.

그리고 산의 생성을 파악하기 위해 시료를 접종하여 Calcium phosphate와 Phenol red로 확인한 결과 유산균 6종이 나왔다. 따라서 유산균 6종 -Leuconostoc kimchii, Lactobacillus paraplantanum, Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei, Lactobacillus Plantarum, Leuconostoc Citreum-를 broth에 배양해 가장 잘 증식하고 낮은 pH를 유지하는 균을 선별하기 위해 O.D.와 pH를 측정하였다. 그 결과 Leuconostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei , Lactobacillus paraplantanum이 가장 높은 O.D.값과 낮은 pH를 나타내었다.

그러나 균을 선별하기 위해 사용했던 MRS나 GYP는 비싸 경제적으로

효율적이지 않으므로 첫 번째로 배지를 경제적으로 바꿀 필요성이 있 었다. 따라서 김치 발효가 이루어지는 환경으로써 Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides 등의 여러 유산균이 자라는 것 으로 알려져 있는 배추를 활용하였다. 배지는 배추를 갈아 배추즙을 만들어 GYP와 포도당과 혼합하였다. 배추는 그리고 선별된 두 균 -Leucomostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei-을 배양하고 7일간 pH를 측정하였다. 측정한 결과 두 균 모두 5일째의 배추+포도당(1:9) 배지에서 가장 잘 자랐다. 그리고 배지의 구체적인 성분을 바꾸어 실 험해본 결과 Glucose를 8g/L 더 추가한 배지, sodium acetate를 1.5g/L 추가한 배지에서 가장 낮은 pH가 관찰되었다. Polysorbate 80를 추가 한 배지에서는 polysorbate 80 + 0.4g/L가 pH 최소치에 가장 빠르게 도달하였다.

또한 경제적으로 효율성을 높이기 위한 두 번째 방안으로 산 생산에 쓰인 유산균을 활용하는 것이다. 본 연구에서는 김치에서 분리한 유 산균이 항암 효과 및 면역 활성 효과를 보이는 지 확인하기 위해 수 행한 실험에서, 유산균은 Macrophage-like cell line인 RAW 264.7 cell 을 활성화 시켜 TNF, IL-6와 같은 cytokine의 발현량을 증가시키는 것을 확인 할 수 있었다.

또한, 김치에서 분리한 유산균을 장기복용 했을 때, 장내세균총을 정 상화시키고 면역계를 활성화 시키는 지 알아보기 위해 유산균을 생쥐 에게 경구투여한 실험에서 김치 유산균을 장기복용시킨 생쥐에서 병 원균에 대한 방어력을 강화시켜 생쥐의 생존율을 높이는 것을 확인 할 수 있었으며, 이러한 효과는 유산균에 따라 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과로부터 김치에서 분리한 유산균은 장내 세균총을 정상화 시켜 건강증진에 기여할 수 있음을 확인할 수 있다. 또한 immunomodulator로써 작용하여 암의 치료 및 질병 예방의 목적으로 사용될 수 있음을 예상할 수 있다.

위의 결과를 정리하면, 6종의 시료(배추김치, 깍두기, 백김치, 치즈, 유산균음료, 유산균 정장제)에서 균을 추출하고 산을 내는 유산균을

분리, 동정한 결과, 6종의 유산균의 시간에 따른 pH와 O.D.를 측정한 결과 중 가장 낮은 pH와 높은 증식률을 보이는 것은 Leucomostoc gasicomitatum, Lactobacillus Casei이다. 그리고 이들을 배추+포도당, 배추+GYP, 배추, GYP, MRS에서 배양한 결과 이들이 pH가 가장 낮아 지는 조건은 배추+포도당(1:9) 배지에서 5일째라는 결과가 나왔다. 또 한 경제적인 효율성을 위해 유산균의 생물학적 효용성을 테스트하였 다. 항암 효과 및 면역활성 효과를 보이는지 확인한 결과 유산균은 cytokine의 발현량을 증가시키고 장기복용 시 생쥐에서 병원균에 대한 방어력을 강화시켜 생존률을 높이는 것으로 확인되었다.

또한 본 연구결과를 활용해 제품화하면, 일반적인 휴대용 전지뿐만이 아 니라 발전소의 친환경에너지 생산에 상당한 기여를 할 것으로 보인다.

4. 홍보 및 사후 활용

□ 후속연구

○ 배지의 성분에 따른 pH변화 측정

배지의 종류에 따른 pH변화 측정에서 pH가 가장 낮게 나오는 배지를 선별한 후에 그 배지종류를 기준으로 삼아 성분을 다르게 하여 pH 변화를 관찰한다. 유산균의 배양에 최적화된 MRS 배지의 조성과 비 교하여 선별된 배지의 성분에 변화를 주는 것을 변인으로 한다. 다음 이 MRS배지의 조성이다.

§ 1.0 % peptone

§ 0.8 % meat extract

§ 0.4 % yeast extract

§ 2.0 % glucose

§ 0.5 % sO.D.ium acetate trihydrate

§ 0.1 % polysorbate 80 (also known as Tween 80)

§ 0.2 % dipotassium hydrogen phosphate

§ 0.2 % triammonium citrate

§ 0.02 % magnesium sulfate heptahydrate

§ 0.005 % manganese sulfate tetrahydrat

MRS 에서 glucose, yeast extract, meat extract, peptone 는 유산균이 배양되는데 기본적으로 필요한 탄소, 질소 그리고 비타민을 제공한다.

sodium acetate은 유산균 이외의 균이 자라는 것을 억제하고, polysorbate 80 은 계면활성제의 일종으로 환원제 역할을 한다. 환원제 역할을 하는 polysorbate 80 는 배지 내의 용존산소량을 줄여 젖산발효가 일어나도록 혐기적 환경을 조성한다. 그리고 마지막으로 magnesium sulfate, manganese sulfate 는 균의 신진대사에 이용되는 양이온을 제공한다.

MRS의 구성성분 중 유산균 배양에 핵심적인 역할을 하는 glucose, sodium acetate 그리고 polysorbate 80를 2-1에서 선별한 배지에 각각 추가하여 pH변화를 관찰할 것이다. Glucose는 2g/L, 4g/L, 6g/L, 8g/L

씩 배지에 추가할 것이다. sodium acetate는 0.5g/L, 1g/L, 1.5g/L, 2g/

씩 배지에 추가할 것이다. Polysorbate 80는 0.1g/L, 0.2g/L, 0.3g/L, 0.4g/L씩 배지에 추가할 것이다.

□ 추후활용

○ 삼성 휴먼테크 논문대상에 제출 5. 참고문헌

○ 강영희, “생명과학대사전”, 아카데미서적, 2008. 2

○ 이정은, “김치에서 분리한 유산균의 항암효과 및 면역세포에 미치는 영향”, 서울대학교 학위 논문