서 2)론
甘豆湯1-2)은 甘草 (Glyrrhiza uralensis Fischer)와 黑豆 (Glycine max (L) Merr)를 배 합한 것으로 黑豆는 豆科植物의 黑大豆와 黑小 豆의 검은 種子로 둘다 解毒作用을 가지고 있 는 藥草로 알려져 있다. 黑豆의 效能3-5)은 風毒, 脚氣, 黃疸, 癰腫, 瘡毒, 散五臟結積, 能補腎, 腸 痛, 中風,癱瘓, 一切熱毒, 腹脹, 除痺去腫, 百藥 之毒, 消腫, 心痛筋孿, 一切腫毒, 長肌膚, 一切
▪교신저자 : 임종국, 경북 경주시 석장동 707 동국대학교 한의과대학 경혈학교실 Tel. 054-770-2365, Fax. 054-770-2649, E-mail : [email protected]
下血, 發腫, 消渴, 風疽瘡疥, 癰腫, 皮膚腫滿, 惡 瘡, 一切風毒, 消腫止痛, 消血結등에 應用하였 다.
甘草는 豆科의 多年生 草本植物이며 效能6-7) 은 解百藥毒, 五臟六腑의 寒熱邪氣, 堅筋骨, 溫 中下氣, 養陰血, 潤肺, 補裨和中, 淸熱解毒, 癰 疽, 瘡毒, 腫毒, 腫痛, 堅筋骨, 久服輕身延年, 通 經脈, 補五勞七傷, 一切虛損, 利百脈, 益精養氣, 養陰血, 壯筋骨, 消瘡疽, 降火止痛, 諸般癰疽, 癰疽秘塞, 癰癤, 乳癰, 懸癰, 濕痒, 生瘡, 腫痛등 에 活用되였고 劉8)등은 舌癌, 鼻咽癌, 胃癌, 白 血病, 骨髓腫瘤, 腹水癌, 肝癌, 食道癌, 乳腺癌, 髓腔腫瘤, 上皮癌등에 抗癌效能이 있다고 보고
生藥 藥鍼液의 癌細胞 成長沮害效果
조경희1․김중완1․박경미1․손윤희2․남경수2․임종국1
동국대학교 한의과대학 경혈학교실1, 동국대학교 의과대학 약리학교실 및 난치병한양방치료연구센터2
Effect of Medicinal Plants Aqua-acupuncture Solution on Tumor Cells
Kyoung-Hee Cho1․Jung-Wan Kim1․Gyung-Mi Park1․Yun-Hee Shon2․ Kyung-Soo Nam2․Jong-Kook Lim1
Dept. of AM-Meridian & Pointology, College of Oriental Medicine1, Dept. of Pharmacology, College of Medicine and Intractable Diseases Research Center2,
Dongguk University
Abstract
Gamdutang aqua-acupunture solution (GAS), Glycyrrhizae radix aqua-acupuncture solution (GRAS) and Lonicerae flos aqua-acupuncture solution (LFAS) were prepared and tested for their antitumor activities in vitro. It was shown to possess considerable toxicity toward various tumor cells lines. GAS at the concentration of 5× and 10×resulted in more than 70% inhibition of growth in Ehrlich ascites tumor cells (EATC), Hepa1c1c7 and A549 and 60% inhibition in HeLa. GRAS resulted in more than 80% inhibition of growth in Ehrlich ascites tumor cells (EATC), Hepa1c1c7 and HeLa cells. Toxicity of GRAS to A549 revealed that 68% inhibition of growth. LFAS at the concentration of 5× and 10× resulted in more than 60% inhibition of growth in Ehrlich ascites tumor cells (EATC), Hepa1c1c7 and HeLa cells. Cytotoxicity of LFAS to A549 revealed that 82% inhibition of growth at concentration of 10×.
Key Words : Gamdutang aqua-acupunture solution (GAS), Glycyrrhizae radix aqua-acupuncture solution (GRAS), Lonicerae flos aqua-acupuncture solution (LFAS), Antitumor activities
하였다.
金銀花(Lonicerae flos)는 忍冬科에 속하는 蔓 性藤本인 忍冬덩굴 Lonicerae japonica Thunb 의 花冠으로 癰疽 腫毒 惡瘡등에 應用하여 凉 肝淸肺 消腫敗毒 經絡濕熱 筋骨酸痛의 主治 藥 物로 使用되여 왔다9-10).
세포분열 조절기능의 결함이나 악성종양 유전 자를 억제하는 능력의 상실등으로 발생하는 비 정상적인 세포의 증식을 병리학적으로 암이라 규정하고 있다. 이러한 악성종양을 치료하기 위하여 수술요법, 방사선요법, 화학요법 및 면 역요법과 유전자요법등을 사용하고 있으나 한 계성이 있으므로 현재로서는 그 치료방법이 정 립되어 있지 않은 상태이다. 또한, 암치료에 의 한 독성문제를 해결하지 못하고 있는 실정이므 로 이러한 점들을 해결하기 위해서는 항종양 효능이 우수한 새로운 천연산물에서 안전성이 있는 약물개발에 관한 연구가 요구되고 있다.
안전성 있는 약물개발에 있어서 단기간에 많은 천연물들의 항종양 여부를 검사할수 있는 민감 하면서도 실험조작이 간편한 항종양검색법이 중요하다. 따라서 본연구에서는 생약을 이용한 약침액을 조제하여 이의 항종양 효과를 살펴보 기 위하여 암세포의 성장에 미치는 영향을 관 찰하였다. 세포에 대한 독성효과의 검정은 tetrazolium-based colorimetric (MTT) 검색법
11) 이용하였다. MTT 검색법은 96-well plate를 사용하고 ELISA reader를 이용하여 검사결과 를 측정하므로 많은 시료를 간단하면서도 빠르 고 객관성 높게 판독할수 있어 세포독성 및 세 포증식 검색법으로 널리 사용되고 잇다. MTT assay는 생존 암세포의 효소작용에 의해 MTT 가 환원되어 formazan crystal로 침전되는 정 도를 흡광도로 측정하여 이로부터 항암제에 의 해 암세포가 사멸 또는 증식 억제되는 정도를 결정하는 실험법이다.
본연구에서는 천연물로부터 항암 제제 개발을 가속화하기 위해서 in vitro상에서 생쥐 및 사 람의 여러 암세포에 미치는 독성실험을 실시하 였다.
재료 및 방법
생약 약침액의 조제
본 실험에서 감두탕, 감초, 금은화 약침액을 제조하기 위하여 동국대학교 부속한방병원에 서 구입한 생약들을 정선하여 사용하였다.
약침액은 수제 알콜침법에 의하여 조제하였다
12). 감두탕은 흑소두와 감초 60 g (1:1), 감초 60 g, 금은화 60 g을 각각 조말하여 증류수 400 ㎖을 가한 뒤 rotary evaporator (BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전탕하여 추 출하고 여과한 후 4℃, 2,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액 200 ㎖을 감압농축 하였다. 이 농축된 용액에 99.9% ethanol을 가 하여 75%, 85%, 95%의 ethanol 용액이 되게 하여 침전물을 여별하고, pH 7.4로 적정한 후 저온에서 24시간 방치하여 membrane filter (0.22 ㎛, Whatman, Germany)로 여과한다.
그리고 3차 증류수를 가하여 200 ㎖이 되게 하 여 1×의 약침액으로 사용하였으며 10×, 5×
약침액은 1×의 약침액을 감압농축하여 사용하 였고, 증류수나 phosphate buffered saline (PBS)를 첨가하여 0.1× 농도로 조제하였다.
세포배양
세포독성 실험은 mouse Ehrlich ascites tumor cell (EATC, ascites carcinoma), Hepalclc7 (hepatoma), human A549 (lung carcinoma)와 HeLa (epithelioid carcinoma, cervix)세포를 사용하여 실시하였다. 계대 보존 중인 Ehrlich ascites tumer cell (EATC, ATCC CCL-77)을 1×106 cells씩 ICR 마우스 의 복강내에 매주 이식하고 다시 세포를 복강 에서 추출하여 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco)이 포함된 NCTC135 (Sigma)를 배양액 으로 CO2 배양기 (5% CO2, 37℃)에서 배양하 였고, 배양액은 3 또는 4일 간격으로 교환해 주 었다. 생쥐의 Hepalclc7과 사람의 HeLa세포는 10% FBS가 첨가된 Minimum Essential
0 40 80
10 5 1 0.1
Concentration (X )
Inhibition (%)
GAS GRAS LAFS
0 40 80
10 5 1 0.1
Concentration (X )
Inhibition (%)
GRAS LFAS
Medium Eagle's (MEM)으로, A549는 10%
FBS가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배양액으로 각각 배양하였 다. 세포 독성 실험에 사용한 세포들은 액체질 소의 기체상태 (-150℃)에 보존해 두었다가 같 은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 사용하 였다.
MTT assay
실험에 사용한 적정세포수는 세포 부유액을 세포 밀도 1/2로 희석하면서 접종한 후 96-well plate를 37℃, 5% CO2 하에서 3일간 배양한 후 MTT 처리 후의 흡광도를 측정하였다. 세포 농도에 따른 지수 곡선에서 흡광도가 0.6-0.7인 부분의 세포농도가 적정세포의 수로 본 실험에 사용하였다. 적정수의 세포를 180 ㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종시키고 CO2 배 양기에서 2시간 배양 후 각각의 준비된 생약 약침액 (0.1×, 1×, 5×, 10×)을 20 ㎕씩 각 well에 가하였다. 세포를 약침액이 첨가된 배양 액에서 72시간 배양한 후, PBS에 녹인 20 ㎕ MTT 용액 (5 ㎎/㎖ PBS)을 well에 넣고 4시간
배양하여 MTT가 환원되게 하였다. 450× g에 서 5분간 원심분리한 후 배양액을 버리고 DMSO와 ethanol을 1:1 섞어 만든 용액 150
㎕씩 각각의 well에 넣어 20분간 formazan결 정을 용해하여 ELISA microplate reader (Behring EL 311) 630 nm에서 흡광도를 측정 하였다.
결과 및 고찰
생쥐의 암세포에 미치는 영향
감두, 감초, 금은화 약침액을 암세포 (EATC, Hepalclc7, A549, HeLa)에 처리하여 살펴보았 다. EATC에 대한 실험에서 감두 약침액은 5
×, 10× 농도에서 각각 100%의 세포 성장 억 제율이 나타났으며, 감초 약침액은 5×, 10×
농도에서 88.5% 및 94.3%, 금은화 약침액은 5
×, 10× 농도에서 86.6% 및 90.2% 세포 성장 억제율이 나타났으며, 약침액의 농도가 높아질 수록 억제효과가 높아졌다 (Fig. 1). EATC에서 사용한 농도와 같은 농도의 약침액을 Hepa1c1c7 세포에 처리했을 때 감두 약침액 5
×, 10× 농도에서 84%, 90.4%의 세포 성장 억 Fig 1. In vitro toxicity assay of GAS, GRAS and
LFAS to Ehrlich ascites tumor cells. The cells were incubated for 72 hours with GAS, GRAS and LFAS at the concentrations indicated. Data shown are mean values with error bars indicating the standard deviation of the mean (n=3).
Fig 2. In vitro toxicity assay of GAS, GRAS and LFAS to Hepa1c1c7 cells. The cells were incubated for 72 hours with GAS, GRAS and LFAS at the concentrations indicated. Data shown are mean values with error bars indicating the standard deviation of the mean (n=3).
0 40 80 120
10 5 1 0.1
Concentration (X )
Inhibition (%)
GAS GRAS LFAS
0 40 80 120
10 5 1 0.1
Concentration (X)
Inhibition (%)
GAS GRAS LFAS
제효과가 나타났으며, 감초 약침액 5×, 10×
농도에서 81.3%, 94.2%의 세포 성장 억제효과 가 나타났으며, 금은화 약침액 5×, 10× 농도 에서 69.7%, 89.5%의 세포 성장 억제효과가 나타났다 (Fig. 2).
사람의 암세포에 미치는 영향
쥐의 암세포에 실시한 것과 같은 방법으로 사 람의 A549, HeLa 세포주에 대한 감초 약침액 의 세포 독성 실험을 실시한 결과, A549 세포 에 감두 약침액 5×, 10×를 처리한 후 72시간 배양에서 72.1%, 98%의 세포 성장 억제효과가 나타났고, 감초 약침액 5×, 10×에서 67.7%, 89.8%의 세포 성장 억제 효과가 나타났으며, 금은화 약침액 5×, 10×에서 46.1%, 82.0%의 세포 성장 억제효과가 나타났다 (Fig. 3).
HeLa 세포에 감두 약침액을 처리했을 때 59%, 86.0%의 억제효과가 나타났으며, 5×, 10× 감 초 약침액을 처리했을 때 88.2%, 95.3%, 금은 화 약침액 5×, 10× 농도에서도 62.1%, 80.0%
로 암세포 성장 억제효과가 나타났다 (Fig. 4).
이와 같이 감두, 감초, 금은화 약침액은 사람의 종양세포에서도 농도가 높을수록 암세포 독성
효과가 증가하였다.
금은화, 소엽을 물과 유기용매를 이용한 추출 물에 의한 종양세포독성 실험 결과의 보고13-14) 와 비교해 보았을 때, 본 연구에서 수제 알콜침 법을 이용하여 조제한 약침액이 더 높은 암세 포 성장 억제효과를 나타내었다.
항암제의 독성에 의한 부작용도 다양하게 나 타나기 때문에 암치료시 문제점으로 지적되고 있는바 항암제의 부작용을 최소화하면서 암 치 료를 하기위해서는 이러한 생약들을 이용한 항 암제의 개발이 시급하다. 이상을 결과들을 종 합해 볼 때 감두탕, 감초, 금은화 약침액들은 종양세포의 성장을 저해함을 알수 있었고, 향 후 이러한 효능들의 작용기전 규명에 대한 연 구는 매우 흥미로울 것이다.
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Fig 3. In vitro toxicity assay of GAS, GRAS and LFAS to A549 cells. The cells were incubated for 72 hours with GAS, GRAS and LFAS at the concentrations indicated. Data shown are mean values with error bars indicating the standard deviation of the mean (n=3).
Fig 4. In vitro toxicity assay of GAS, GRAS and LFAS to HeLa cells. The cells were incubated for 72 hours with GAS, GRAS and LFAS at the concentrations indicated. Data shown are mean values with error bars indicating the standard deviation of the mean (n=3).
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