COX-2 and iNOS as Potential Targets

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116 서 론

Resveratrol (3,5,4’-trihydoxy-trans-stilbene)은 1963년 호장 (虎杖; Polygonum cuspidatum, Polygonaceae)의 건조된 뿌리에

서 최초로 발견되었으며,¹⁾ 포도 덩굴(grapevine)에서는 1976년 Langcake와 Pryce에 의해 보고되었다.²⁾ Resveratrol 은 stilbene 구조체(Fig. 1)이며, 주로 포도나무(Vitis vinifera, Vitaceae)의 과실이나 잎 부위에서 진균, 세균 및 바이러 스의 침입, 자외선, 오존 등의 외부 자극에 대항하는 방

Correspondence to：Sang Kook Lee

College of Pharmacy, Ewha Womans University, 11-1 Daehyeon-dong, Seodaemun-gu, Seoul 120-750, Korea

Tel: +82-2-3277-3023, Fax: +82-2-3277-2851 E-mail: [email protected]

Resveratrol 및 그 유도체의 항염증 작용:

새로운 COX-2 및 iNOS 저해제

이화여자대학교 약학대학 박 은 정․이 상 국

Anti-inflammatory Effects of Resveratrol and Its Analogs:

COX-2 and iNOS as Potential Targets

Eun-Jung Park and Sang Kook Lee

College of Pharmacy, Ewha Womans University, Seoul 120-750, Korea

It has been known that resveratrol, a phytoalexin mainly present in grapes, has antioxidant, anti-inflammatory, and cancer chemopreventive activities. One mechanism of its anti-inflammation and cancer prevention is considered to modulate cyclooxygenase-2 (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) activities. Since COX-2 and iNOS play important roles in inflammation and carcinogenesis, the potential COX-2 and iNOS inhibitors have been considered as anti-inflammatory or cancer chemopreventive agents. In order to discover novel chemopreventive agents, we synthesized about thirty analogs of resveratrol and evaluated their COX-2 and iNOS inhibitory activities with the production of prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide (NO) in RAW 264.7 cells, respectively. As a result, several compounds exhibited more potent inhibitory activity than resveratrol. Among them, 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane which showed inhibitory effects on both PGE2

and NO production was further investigated its mechanism of action on COX-2 and iNOS activities and their expressions. This compound suppressed the lipopolysaccharide (LPS)-induced COX-2 and iNOS protein and mRNA expression. In addition, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) study revealed that the suppressions of the COX-2 and iNOS gene expression were related to the inhibition of NF-κB binding activity. Further study exhibited that 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane inhibited IκB-α degradation in LPS-stimulated macrophage cells. These findings suggest that 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane might be a promising candidate for developing cancer chemopreventive agent. (Cancer Prev Res 10, 116-123, 2005)

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Cancer prevention, Cyclooxygenase-2 (COX-2), Inducible nitric oxide synthase (iNOS),

Resveratol analogs

책임저자：이상국, ꂕ 120-750, 서울특별시 서대문구 대현동 11-1 이화여자대학교 약학대학

Tel: 02-3277-3023, Fax: 02-3277-2851 E-mail: [email protected]

접수일：2005년 5월 6일, 게재승인일：2005년 6월 20일

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어물질(phytoalexin)로 생합성된다.³⁾

Resveratrol은 많은 과학자들에 의해 지속적으로 연구 되고 있으며, 대표적인 연구로서는 적포도주가 고지방 식이를 하는 프랑스 및 그리스 지방 사람들의 심혈관계 질환에 의한 사망률을 낮춘다는^4,5) ‘French parodox’가 알 려지면서 적포도주의 함유 성분인 resveratrol (0.1∼10 mg/L)⁴⁾에 대한 연구도 활발히 이루어졌다. 그 결과, res- veratrol이 항혈전 작용(inhibition of platelet aggregation), 항 산화 작용(free-radical scavenging), endothelin-1 생성 저해 작용, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) 유도 작용, high-density lipoprotein (HDL) 생성 증진 작용 및 low- density lipoprotein (LDL) 산화 저해 작용 등을 통해 심혈관 계 보호 효능을 나타내는 것으로 입증되었다.^5,6) 또한, 암 예방 및 항암 활성을 나타내는데 암 개시단계(initiation) 에서 resveratrol은 arylhydrocarbon을 epoxydation 및 hydro- xylation화 하여 생체 내 반응성이 높은 물질로 전환하는 phase I 효소 CYP450를 저해한다. 반면, 해독화와 관련된 phase II 효소인 quinone reductase (QR)를 유도함으로써 발 암물질에 의한 DNA 변이를 저해하며, 항산화 활성을 통 해 세포 내에서 생성된 과도한 활성 산소를 소거하여 DNA 손상을 억제한다. 암 촉진단계(promotion)에서는 염 증유발 관련 효소인 cyclooxygenase-2 (COX-2), inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 protein kinase (PK) 등을 저해 하며, 암 진행단계(progression)에서는 HL-60와 같은 미분 화된 암세포의 분화를 유도하고, 다양한 암세포에서의 세포주기 저해 및 세포 사멸을 유도한다.^6,7)실제로, 암 유발 동물 모델(two-stage mouse skin model)에서도 resver- atrol의 암 발생억제 효과가 입증되어, 암예방제로서의 가능성을 제시하였다.⁸⁾

본 논문에서는 resveratrol의 위에서 언급한 생리활성 작용 중, 항염증 및 암예방과 관련된 COX-2, iNOS에 대 한 저해 작용에 초점을 맞추어, 합성된 resveratrol 유도체 들의 항염증 및 암예방 효과를 평가하고 새로운 항염증 제 및 암예방제로서의 가능성을 제시하려고 한다.

Cyclooxygenase-2 (COX-2)는 phospholipase A2 (PLA2)에 의 해 세포막 인지질로부터 유리된 arachidonic acid를 prosta-

glandin H2 (PGH2)로 전환하는 과정에 관여하는 효소이 다. 조직 내에서 일정하게 발현되는 COX-1, COX-3와 달 리 COX-2는 성장인자, 염증유발인자, 산화적 스트레스, 외상, 암유전자, 사이토카인 등에 의해 유도되는 효소 (inducible enzyme)이다.^9,10) COX-2는 염증 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, COX-2의 지속적 과 발현은 암을 유발 혹은 악화시키거나, 심혈관계 질병 및 알츠하이머 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 한 편, inducible nitric oxide synthase (iNOS)는 일정하게 발현 되는 neuronal NOS (nNOS) 및 endothelial NOS (eNOS)와 달리, interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF- α), lipopolysaccharide (LPS) 등과 같은 염증유발인자 및 암 발생인자에 의해 발현되어, 과량의 nitric oxide (NO)를 생 성한다. 생성된 NO는 프리라디칼의 일종으로 혈관확장 (vasodilation), 비선택적 숙주방어(nonspecific host defense) 등의 작용을 하지만, 지속적 과발현은 만성 염증(chronic inflammation), 천식(asthma), 퇴행성 뇌질환(neurodegenera- tive disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 관절염(arth- ritis), 암의 진행 및 악화 등을 유발한다.¹²⁾

위에서 언급한 바와 같이, resveratrol이 염증 반응 및 암화와 밀접한 관련이 있는 COX-2 및 iNOS의 발현 및 활성화를 저해한다는 기존 연구를 바탕으로 하여, 본 연 구에서는 resveratrol의 구조를 기본으로 hydroxyl 잔기를 methoxy 잔기로 치환하거나 그 위치를 변화시키고, stilbene 구조 자체에서 benzene을 furane이나 thiophene으로 치환하는 등의 방법으로 합성된 유도체들의 COX-2 및 iNOS 활성 저해능을 평가함으로써 항염증 및 암예방제 로서의 가능성을 제시하고자 한다.^13,14)

재료 및 방법 1. 재료

RAW 264.7 마우스 대식세포(TIB-71)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 세 포 배양에 사용된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), antibiotics-antimycotics (penicillin G sodium, streptomycin sulfate and amphotericin B), 100 bp DNA ladder는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입 하였다. Prostaglandin E2 표준품 및 PGE2-AchE tracer는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다.

ECL Western blotting detection reagents, rainbow molecular weight marker는 Amersham Pharmacia Biotechnology (Pisca- taway, NJ, USA)에서 구입하였고, anti-goat, anti-mouse, anti-rabbit IgG-HRP antibody, goat polyclonal cyclooxyge- Fig. 1. Structures of stilbene and resveratrol.

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nase-2 antibody, rabbit polyclonal iNOS antibody는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

Mouse monoclonal-actin antibody, TRI reagent, lipopolysaccharide (LPS), dimethyl sulfoxide (DMSO), bicinchoninic acid (BCA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였 으며, PCR primer로 사용한 oligonucleotide는 Bioneer Cor- poration (Daejon, Korea)에서 합성하였다. Reverse transcription (RT) system은 Promega (Madison, WI, USA)에서 구 입하였고, Taq PCR master mix kit은 Qiagen (Valencia, CA, USA)에서 구입하였다.

2. 시료

Resveratrol 및 그 유도체들은 서울대학교 약학대학 김 상희 교수님 연구실에서 제공받았다.

3. 세포배양

RAW 264.7 마우스 대식세포는 FBS (10%)과 antibiotics- antimycotics (100 U/ml penicillin G sodium, 100μg/ml streptomycin sulfate and 0.25μg/ml amphotericin B)가 함유된 DMEM 배지에서 37^oC, 5% CO2 조건으로 격일마다 계대 배양하였다.

4. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 측정

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 현탁하여 96 well plate의 각 well 당 1×10⁵개씩 넣어 37°C, 5% CO2 배양 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

RAW 264.7 세포를 phosphate buffered saline (PBS)으로 1회 세척하고 새로운 DMEM 배지로 교체한 다음 LPS (1μg/

ml)와 시험물질 혹은 시험물질을 녹인 용매(DMSO)를 동 시 처리하여 20시간 동안 배양하였다. 상등액을 희석하 여 PGE2 antibody plate에 가하고 PGE2-AchE trancer를 처리 하여 상온에서 18시간 이상 배양하였다. 배양 후 PGE2

antibody plate를 0.05% Tween in PBS로 1분간 5회씩 세척 한 다음, Ellman’s reagent를 처리하여 상온에서 약 7시간 동안 배양하였다. 405 nm에서 흡광도를 측정한 후, PGE2

표준 용액으로 작성한 검량선에 그 수치를 대입하여 PGE2 생성량을 환산하였다. LPS만을 처리한 군에서의 PGE2 생성량을 기준으로 시험물질 처리군의 PGE2 생성 저해 활성을 non-linear regression analysis를 이용하여 각 시험물질의 IC50 (PGE2 생성을 50% 저해하는 농도)를 결 정하는 방법으로 시험물질 간의 효력을 비교하였다.

5. Nitric oxide (NO) 생성 측정

RAW 264.7 세포를 phenol red가 없는 10% FBS가 함유

된 DMEM에 현탁하여 24 well plate의 각 well 당 5×10⁵ 개씩 넣어 37°C, 5% CO2 배양 조건에서 24시간 동안 배 양하였다. RAW 264.7 세포에 LPS (1μg/ml)와 시험물질 혹은 DMSO를 동시 처리하여 20시간 배양한 후 상등액 100μl를 Griess reagent (0.1% naphthylethylenediamine 용액 과 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 용액) 180μl과 반응시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 검량선은 sodium nitrite 용액을 이용하여 작성하였고, 이를 이용하여 흡광도 평균을 nitrite 양으로 환산하였다. LPS만을 처리한 군에 서의 nitrite 양을 기준으로 하여 시험물질 처리군의 NO 생성 저해 활성을 non-linear regression analysis를 이용하여 각 시험물질의 IC50 (NO 생성을 50% 저해하는 농도)를 결정하는 방법으로 시험물질 간의 효력을 비교하였다.

6. 단백질 발현 분석(Western blotting)

RAW 264.7 세포에 시험물질과 LPS (1μg/ml)를 처리하 여 10분 또는 16시간 동안 배양한 후 cell lysate를 만들었 다. 단백질 정량은 BCA 정량법을 이용하였고, 동량(40μg) 의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리하 였다. SDS-polyacrylamide gel에 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 옮긴 후 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)로 5분간 2회 세척하고 5% skim milk in PBS-T에 넣어 상온 에서 1시간 동안 blocking 하였다. 다음, primary antibody 를 1：1,000∼1：2,000 정도가 되도록 PBS에 녹인 3%

skimmed milk로 희석하여 membrane과 함께 상온에서 2∼

3시간 배양하였다. Membrane을 PBS-T로 5분간 3회 세척 한 후 HRP-conjugated secondary antibody를 1：1,500∼1：

2,000으로 희석하여 membrane과 함께 상온에서 2∼3시 간 배양하였다. 이를 PBS-T로 5분간 3회 세척한 후 ECL western blotting detection reagents를 처리하여 생성된 luminescence를 X-ray film에 감광해 확인하였다.

7. mRNA 발현 분석(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)

RAW 264.7 세포에 시험물질과 LPS (1μg/ml)를 처리한 후 5시간 동안 배양하여 Chomczynski 및 Sacchi가 제안한 방법으로 TRI reagent를 이용하여 RNA를 분리하였다. 1μg 의 RNA를 avian myeloblastosis virus (AMV)의 역전사효소 (reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, 생성된 cDNA에 관심 유전자에 선택적인 primer 및 Taq polymerase를 넣고 PCR을 수행하여 유전자를 증폭하였 다. PCR반응이 끝난 후에는 증폭된 DNA를 2% agarose gel에 전기영동 하였고, SYBR Gold로 염색한 다음 Alpha Imager^TM을 이용하여 DNA band를 확인하였다. PCR 반응

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에 사용된 primer는 Table 1에 정리하였다.

8. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 분석

RAW 264.7 세포에 시험물질을 1시간 동안 전처리한 다음 LPS (1μg/ml)를 가하여 1시간 동안 배양하였다. 세 포에 lysis buffer를 1 ml 씩 가하고 원심분리한 후 생성된 pellet을 NP-40이 함유되지 않은 lysis buffer로 세척해 준 다음, nuclease extract buffer를 가하여 14,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리한 다음 상등액을 분주하여 -70°C 냉동 고에 보관하였다. Bradford assay 정량법으로 단백질을 정 량한 다음, 5μg의 단백질을 poly (dI-dC) 2μg 및 5’에 ³²P

로 labeling된 NF-κB consensus oligonucleotide (100,000 cpm)와 상온에서 25분 동안 반응시켜 DNA-단백질 복합 체를 형성하도록 하였다. 생성된 복합체는 5% polyacrylamide gel을 이용하여 200 V에서 1시간 동안 전기영동 하 였고, 전개된 gel을 건조시킨 다음 70°C에서 X-ray film에 감광하여 확인하였다.

9. 통계처리

본 연구에서 얻어진 결과에 대해서는 SPSS를 이용하여 각 실험군마다 평균과 표준편차를 계산하고, 군 간의 유 의성을 p＜0.01 수준에서 t-test를 실시하여 검증하였다.

Table 1. Sequences of target gene-specific primers used in the PCR

ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ

Target gene Sequences

Mouse iNOS Sense 5'-ATGTCCGAAGCAAACATCAC-3'

Antisense 5'-TAATGTCCAGGAAGTAGGTG-3'

Mouse COX-2 Sense 5'-GGAGAGACTATCAAGATAGTGATC-3'

Antisense 5'-ATGGTCAGTAGACTTTTACAGCTC-3'

Mouse β-actin Sense 5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'

Antisense 5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'

Fig. 2. Inhibitory effects of resveratrol and its analogs on LPS-induced PGE2production (IC50

values were indicated in brackets). RAW 264.7 cells (5×10⁵ cells/ml) were plated in 96 well plate and incubated for 24 h. The attached cells were washed and incubated in the fresh medium containing LPS (1μg/ml) and serially diluted test compounds. After incubation for 20 h, PGE2

content was determined by enzyme immunometric assay. The percent inhibition was expressed as [1-(PGE2 level of test compounds/PGE2 levels of vehicle treated-control)]×100.

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결과 및 고찰

1. Resveratrol 유도체의 PGE2 생성 저해능

RAW 264.7 마우스 대식세포에 LPS와 시험물질(res-

veratrol 및 그 유도체)를 처리하여, LPS에 의하여 유도, 생성되는 COX-2 및 iNOS에 대한 시험물질의 저해 활성 을 평가하였다. 우선, COX-2에 대한 저해 활성은 유도된 COX-2에 의해 생성된 PGH2가 하위 효소에 의해 발현되 는 대표적인 prostaglandin류인 PGE2의 생성량을 측정함 으로써 평가하였다. 그 결과, phenyl ring에 4-methoxy 기 를 가진 styrylheterocycle (compound 1c∼3c)이 phenyl ring 에 3,5-dimethoxy 기를 가진 styrylheterocycle (compound 4c∼

9c)보다 뛰어난 활성을 보였다. 반면, aryl기에 methoxy 기 가 결합된 phenyl ring으로 치환될 경우(compound 10c, 11c) resveratrol에 비해서는 PGE2 생성 저해능이 우수하였 으나, styrylheterocycle을 가진 물질보다는 활성이 저하됨 을 알 수 있었다(Fig. 2). Fig. 3에 제시된 바와 같이 활성 이 우수한 유도체 중 하나인 compound 5c는 농도 의존적 으로 LPS에 의해 유도되는 PGE2 생성을 저해하는 것으 로 나타났다.

2. Resveratrol 유도체의 NO 생성 저해능

Resveratrol 및 그 유도체가 LPS에 의해 유도되는 iNOS 에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 iNOS에 의해 유도되는 NO 생성에 대한 시험물질의 저해 활성을

Fig. 4. Inhibitory effects of resveratrol and its analogs on LPS- induced NO production (IC50

values were indicated in brackets). RAW 264.7 cells (5×10⁵ cells/ml) were plated in 24 well plate and incubated for 24 h. The attached cells were washed and incubated in the fresh medium containing LPS (1μg/ml) and serially diluted compound 2n. After incubation for 20 h, NO content was determined by Griess reaction. The percentage inhibition was expressed as [1-(NO level of test compounds/NO levels of vehicle treated control)]×100.

Fig. 3. Dose-dependent inhibition of compound 5c on LPS- induced PGE2 production. Data were represented by mean±SD.

*These values were significantly different compared to LPS- treated control (p＜0.01).

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Griess 반응을 이용하여 확인하였다. 그 결과 phenyl ring 에 3,4,5-trimethoxy 기를 가진 styrylheterocycle (compound 3n∼6n)이 3,5-dimethoxy 혹은 4-methoxy 기를 가진 물질 들(data not shown)보다 상대적으로 뛰어난 NO 생성 저해 능을 나타내었다. 3,5-dimethoxy 혹은 4-methoxyphenyl 기 를 가진 물질 중에서는 furanyl 유도체(compound 1n, 2n, 7n)만이 활성을 나타내었다. 특이하게 Z-, E- 이성체는 NO 생성 저해 활성에 거의 영향을 주지 않은 것으로 밝 혀졌다(Fig. 4). NO 생성 저해 효능 물질 중 대표적인 compound 2n의 농도 의존적인 NO 생성 저해 활성을 Fig.

5에 제시하였다.

3. 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane 의 COX-2 및 iNOS 단백질 발현 저해 작용

PGE2 생성 및 NO 생성 저해 활성이 우수하였던 2-[2- (3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane (Fig. 6; compound 5c in Fig. 5; compound 2n in Fig. 6)에 대하여, COX-2 및 iNOS의 단백질 발현에는 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위해 Western blotting을 시행하였다. 실험 결과, 시험물질은 최 고 농도인 21.7μM에서 COX-2 및 iNOS의 발현을 강력

하게 저해하였으며, 농도 의존적인 저해 활성을 보였다 (Fig. 7).

4. 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane 의 COX-2 mRNA 발현 저해 작용

2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane이 COX-2의 mRNA 발현에 미치는 영향을 RT-PCR 법을 통해 확인하였다.

LPS에 의해 RAW 264.7 세포에서의 COX-2 mRNA의 발 현이 증가하였고, 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane 이 COX-2의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 저해하는 것으로 나타났다(Fig. 8).

5. 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane 의 유전자 발현 조절 인자에 미치는 영향 평가

2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane가 COX-2 및 iNOS 의 유전자 발현 저해 효능이 있음을 확인함에 따라, 이들 유전자의 발현에 관여하는 transcription factor인 NF-κB가

Fig. 5. Dose-dependent inhibition of compound 2n on LPS- induced NO production.

*These values were significantly different compared to LPS-treated control (p＜0.01).

Fig. 6. Chemical structure of 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)- vinyl]-furane.

Fig. 8. Inhibitory effect of 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]- furane on LPS-induced COX-2 mRNA expression. RAW 264.7 cells (5×10⁵ cells/ml) were plated in 60 mm dish and incubated for 24 h, and then treated with LPS (1μg/ml) and a test compound for 5 h. Cells were lysed, and total RNA (1μg) was used in the RT-PCR. PCR products were separated on a 2%

agarose gel, stained with SYBR Gold, and visualized under UV illumination. β-actin was used as an internal standard.

+ - + + +

LPS (1 g/ml)µ

Compound ( M)µ 0 0 21.7 10.9 5.4 COX 2-

β-actin

Marker

Fig. 7. Inhibitory effect of 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]- furane on LPS-induced COX-2 and iNOS protein expressions.

RAW 264.7 cells (5×10⁵ cells/ml) were plated in 60 mm dish and incubated for 24 h, and then treated with LPS (1μg/ml) and a test compound for 16 h. After incubation, cells were lysed, and protein (40μg) was applied on a 8% SDS-polyacrylamide gel.

The level of iNOS or COX-2 protein expression was examined by Western blot analysis.

+ - + + +

LPS (1 g/ml)µ

Compound ( M)µ 0 0 21.7 10.9 5.4 iNOS

COX 2-

β-actin

(7)

DNA와 결합하는 데에 이 물질이 어떠한 영향을 주는지 EMSA로 확인하였다. 그 결과, 시험물질은 NF-κB와 DNA의 결합을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하 였다(Fig. 9). 다음으로, 본 시험물질의 NF-κB에 대한 저 해 활성이, 세포질에서 NF-κB와 공존하는 IκB의 분해를 막아 NF-κB의 핵 내 이동을 저해한 것에서 기인하는지 를 알아보기 위해, IκB단백질의 분해 정도를 확인해 보 았다. IκB는 LPS를 처리하였을 때 10여분 정도 경과하면 최대로 분해 되었고, 따라서 10분 후의 IκB 단백질 분해 정도를 확인한 바, 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane 은 최고 농도인 21.7μM에서 IκB의 분해를 강력하게 저 해하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 10).

결 론

최근 의료 기술의 발달로 인한 평균 수명의 증가, 산업 화에 따른 환경오염, 생활 방식의 변화 등으로 암 발생률 이 증가하고 있는 추세이다. 따라서 암 발생 이전에 암을 예방하자는 ‘화학적 암예방’에 대한 관심이 커지고 있으 며 특히 천연물로부터 유래한 물질의 암예방 활성에 대 한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 만성적인 염증 반응

으로 인하여 암화가 촉진될 수 있다는¹⁵⁾ 여러 연구 결과 들에 따라, 염증 유발 인자인 COX-2 및 iNOS의 활성을 저해하는 물질 또한 암예방제로서 역할을 할 수 있을 것 으로 여겨진다. 본 논문에서는 resveratrol의 항염증 및 암 예방 효능을 바탕으로 하여 resveratrol보다 활성이 우수 한 물질을 도출하기 위하여 여러 유도체들을 합성하여 이들의 COX-2 및 iNOS에 대한 저해 활성을 검색하였으 며, 효능물질인 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]-furane의 COX-2 및 iNOS 저해 작용기전을 제시하였다. 이러한 연 구는 보다 우수한 효능을 지닌 항염증제 및 화학적 암예 방 물질의 개발에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 이화여자대학교 약학연구소의 연구비 지원 으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

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furane on DNA binding activity of NF-κB in LPS stimulated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (5×10⁵ cells/ml) plated in 100 mm dish and incubated for 24 h, and then pretreated with a test compound for 1 h. After incubation, LPS (1μg/ml) was treated for an additional 1 h. Cells were lysed and nuclear extracts were prepared, and 5μg of nuclear extracts were used in the EMSA.

DNA-protein complexes were separated on 5% polyacrylamide gel. After 1h, the gel was vacuum-dried, and autographed at 70^oC for 9∼12 h.

+ - + + +

LPS (1 g/ml)µ

Compound ( M)µ 0 0 40 15 5

NF B DNA binding

-κ -

Fig. 10. Inhibitory effect of 2-[2-(3,5-dimethoxy-phenyl)-vinyl]- furane on LPS-induced IκB-α degradation in cultured RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were pretreated with various concentration of a test compound for 1h, and then stimulated with LPS (1μg/ml) for 10 min (Western blotting).

+ - + + +

LPS (1 g/ml)µ

Compound ( M)µ 0 0 21.7 10.9 5.4 l Bκ -α

β-actin

(8)

4-hydroxystilbene. Phys Chem Chem Phys 4, 757-764, 2002.

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