Anti-oxidative effect of electroacupuncture to Yinlingquan (SP9) in<br /> AAPH induced oxidative stress of rats

백서의 음릉천에 시술한 저주파 침자극의 항산화 효과에 대한 실험적 연구

이정태

․김영일

․임윤경

1대전대학교 한의과대학 경락경혈학교실

Anti-oxidative effect of electroacupuncture to Yinlingquan (SP9) in AAPH induced oxidative stress of rats

Jung-Tae Lee

, Young-Il Kim

, Yun-Kyoung Yim

1

Dept. of Meridian & Acupoint, College of Oriental Medicine, Daejeon Unioversity Abstract

Objectives & Methods : The purpose of this study is to observe the anti-oxidative effects of electroacupuncture to Yinlingquan(SP9) in AAPH induced oxidative stress of rats. The author performed several experimental items including measurements of body weight, levels of albumin, total bilirubin, LDL-cholesterol, GOT and GPT in serum, levels of SOD, glutathione, catalase, NO and MDA in liver, histological analysis of liver. The conclusions are as follows.

Results : 1. In the SP9-EA group, the level of LDL-cholesterol was significantly decreased in comparison with that of the holder group and control group.

2. In the SP9-EA group, SOD activity, glutathione concentration in liver were increased, and NO concentration was decreased significantly in comparison with those of the control group and the holder group.

3. In the SP9-EA group, the density of liver tissue was maintained more similarly to the normal group in comparison with those of the control group and the holder group.

5. The results of the SP9-NR group showed similar tendencies with those of the SP9-EA group, but the effects were lower than those of the SP9-EA group.

Conclusion : These results suggest that electroacupuncture at SP9 has an anti oxidative effect through suppressing both the reduction of anti-oxidative enzymes and production of oxidized substances.

Key words : anti-oxidative effect, Yinlingquan (SP9), electroacupuncture

Ⅰ. 緖 論

산화는 산소를 소비하는 모든 생물체에서

발생하는 현상으로, 산소가 전자전달계의 말 단에서 전자의 주고받음에 관여함으로써 1 전자가 환원된 O

- (superoxide)를 생성하며 계속 환원되어 H

O를 생성하게 된다. 이 과 정 중에 생성된 free radical은 중요한 생체 내 분자와 반응하여 이러한 손상의 계속적

⋅교신저자 : 임윤경, 대전 동구 용운동 96-3 대전대학교 한의과대학 경락경혈학교실, Tel. 042-280-2610, Fax. 042-280-2610, E-mail: [email protected]

⋅투고 : 2008/02/21 심사 : 2008/03/07 채택 : 2008/03/21

인 축적의 결과로 노화와 관련된 기능의 쇠 퇴를 초래하며, 생체내 분자들을 공격하여 변형시킴으로서 세포 및 조직손상을 일으킨 다

.

電鍼은 치료나 진통의 목적으로 침을 통 해 신체조직에 박동성의 전류를 흘리는 것 이다

. 電鍼은 지속적인 運鍼이 가능하고, 人力을 절약할 수 있으며, 비교적 자극량을 조절할 수 있다는 장점이 있어, 疼痛질환, 消化器질환, 痲痺질환 등 일반적인 자극요법 의 적응증에는 모두 응용되고, 일부 神經痛 이나 痲痺질환등 機械性 질환에는 더욱 효 과적인 것으로 알려져 있다

.

陰陵泉은 足太陰脾經의 合水穴로서, 종아 리의 안쪽에 위치하며, 運中焦, 化濕滯, 調膀 胱, 祛風冷의 효능이 있다

. 陰陵泉과 관련 된 연구로는 주

등의 비만에 관한 연구와, 배

등의 월경곤란증에 관한 연구, 박

등 의 급성신부전에 관한 연구, 이

등의 관절 염에 관한 연구 등이 있었으나, 陰陵泉 電鍼 자극의 항산화 효과에 대한 연구는 접하지 못하였다.

이에 著者는 AAPH로 산화적 스트레스를 유발하고, 陰陵泉(SP9)

에 저주파 電鍼을 자극을 가한 후, 혈핵학적 검사 및 간 조직

에서의 항산화 효과를 측정하여 유의성 있 는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

Ⅱ. 實 驗

1. 재료 1) 동물

실험동물은 (주)대한 바이오 링크(한국) 로 부터 공급받은 웅성의 6주령 Sprague- Dawley Rat(180±10g)을 1주일 동안 일정한 조건의 실험실환경(溫度: 22±2℃, 濕度:

50%, 明暗: 12시간 light/dark cycle)에서 적 응시킨 후 실험에 사용하였다.

2) 시약 및 기기 (1) 시약

시약명 제조사 제조국

SOD assay kit

Glutathione kit Dojindo Japan Lipid peroxidation assay kit

Nitric Oxide assay kit Catalase kit

Oxford

Hematoxylin USA Eosin B

Xylene OCT compound

Sigma

(2) 기기

기기명 제조사 제조국

Thermo aluminum bath Vortex mixer

Water bath

Fine PCR Japan

Vision Scientific Co

Korea Intron biotech.

Electric chemical balance MC1

Germany Primus 96 thermocycler system MWG Biotech

ELISA reader TECAN Canada

Microscope Homogenizer

BD Biosciences OMNi USA

Stainless steel Dong Bang Acupuncture Co Korea Electric stimulator(PG-6)

Camera Bio-freezer

Ito Co

Japan Nikon

Sanyo

Cryotome Shandon UK

2. 방법

1) 실험군 설정

실험동물은 각각 정상군(normal group), 대조군(control group), 구속대조군(holder group), 임의혈전침군(sham EA group), 음 릉천 유침군(SP9-NR group), 음릉천 전침 군(SP9-EA group)으로 분류하였고 각 실험 군은 8마리씩 배정하였다.

(1) 정상군(normal group) : Normal SD rat 군

(2) 대조군(control group) : 1주간 매일 AAPH(50mg/kg)를 복강투여한 군

(3) 구속 대조군(holder group) : 1주간 매일 AAPH(50mg/kg)를 복강투여하고 주 3 회 15분간 아크릴 홀더에 구속한 군

(4) 임의혈 전침군(sham-EA group) : 1 주간 매일 AAPH(50mg/kg)를 복강투여하 고 주 3회 아크릴 홀더에 넣은 상태에서 좌 측 둔부에 15분간 전침자극 (electro-

acupuncture)한 군

(5) 음릉천 유침군(SP9-NR group) : 1주 간 매일 AAPH(50mg/kg)를 복강투여하고 주 3회 아크릴 홀더에 넣은 상태에서 왼쪽 음릉천 (SP9)에 자침 후 15분간 유침 (needle retention)한 군

(6) 음릉천 전침군(SP9-EA group) : 1주 간 매일 AAPH(50mg/kg)를 복강투여하고 주 3회 아크릴 홀더에 넣은 상태에서 왼쪽 음릉천 (SP9)에 자침 후 15분간 전침자극 (electro-acupuncture)한 군

2) 산화적 스트레스 유발

정상군을 제외한 모든 군의 실험동물에게 AAPH를 매일 오전에 50mg/kg씩 1 주일간 복강에 투여 하여, 산화적 스트레스를 유발 하였다.

3) 취혈 및 전침 처치

길이 20㎝, 지름 5㎝의 원통형 아크릴 홀 더를 제작하여 4개의 구멍을 뚫어 실험동물 의 사지를 노출하여 자침 및 전침을 시행할 수 있도록 하였다. 실험동물을 특수제작한 아크릴 홀더에 넣고 멸균된 stainless steel 호침(0.25mm × 30mm, Dong Bang Acupuncture Co. Korea)으로 골도분촌법에 준하여 인체의 음릉천(SP9)에 상응하는 부 위를 실험동물의 좌측 후지에 취하여 약 2∼3㎜ 깊이로 자침하였다. 전침 자극군은 0.5×1㎠의 패드를 좌측 解谿(ST41) 상응 부 위에 부착한 후, 저주파 치료기(PG-6, Suzuki iryoki, Japan)의 한쪽 극을 자입된 침의 끝에 연결하고 다른 한쪽 극을 패드에 연결하여 2Hz의 저빈도에서 근육의 수축이 육안으로 확인되는 정도로 전압을 조절하여 15분간 자극을 가하였다. 전침자극은 AAPH 투여 기간 동안 격일로 오후에 시행하였다.

임의 혈 대조군은 좌측 둔부에 같은 방법으 로 전침자극을 가하였고, 음릉천 유침군은 좌측 음릉천에 자침후 전침 자극을 가하지 않고 15분간 유침하였다.

4) 항산화 효과 측정

(1) 체중 측정

실험 기간 동안, 매일 실험동물의 체중을 측정하여, 산화적 스트레스로 인한 체중의 변화를 확인하였다.

(2) 혈청 분석

실험 종료 후, ethyl ether를 이용하여 rat를 마취하고 심장 채혈 법으로 채취하였다. 채혈

한 혈액으로 (주) 이원 임상검사센터(대전.

한국)에 의뢰하여 혈중 LDL Cholesterol, Total Bilirubin, Albumin, GOT, GPT를 측 정하였다.

(3) 간에서의 항산화 효과 측정

① 간 조직의 분획

생리 식염수로 관류하여 혈액을 제거한 후 간과 비장 조직의 일부를 적출하여 여지 로 혈액 및 이물질을 제거하고 Bansal등

의 방법에 의해 간 조직 1g에 4배의 150 mM의 KCl을 가하여 homogeniger를 이용하 여 균질화 하였다. 균질화한 조직을 600×g 에서 10분간 원심분리하여 균질화 되지 않 은 조직 등을 제거한 후 상등액을 10,000×g 에서 20분간 원심분리하여 mitochondrial fraction을 얻었다. 이 상등액을 105,000×g에 서 1시간 원심분리하여 cytosolic fraction을 얻고, 그 침전물에 동일한 양의 0.1M potassium phosphate buffer를 가하여 현탁 시켜 microsomal fraction을 얻었다.

microsomal fraction은 glutathione의 함량과 MDA(lipid peroxidation)의 함량을 측정하 였고 cytosolic fraction을 이용하여 SOD (superoxide dismutase) 생성저해 효과와 NO(nitric oxide) 함량을 측정하였다.

Mitochondrial fraction에서 catalase의 활성

측정하였다(Scheme 1).

Scheme 1. Preparation of mitochondrial, microsomal and cytosolic fractions.

② SOD activity

SOD 활성도는 SOD assay kit(Dojindo, Japan)을 이용하였다. 간 분획으로 얻은 sample중에서 20000rpm으로 얻은 sample을 사용하였으며, sample solution을 96 well plate에 각 well과 blank2에 20㎕씩 분주한 다. Blank1과 blank3에 D.W.를 분주한 뒤, WST working solution을 200㎕/well으로 모 든 well에 첨가한다. blank2과 blank3 well에 dilution buffer를 20㎕씩 분주하고, enzyme working solution을 각 sample well과 blank 1 에 20㎕/well으로 분주한다. 20분 동안 3 7℃에서 incubating을 실시하고 450 nm에 서 흡광도를 측정 하고 SOD 활성도를 환산 하여 준다.

SOD activity (inhibition rate %)

= {[(Ablank1 - Ablank3) - (Asample - Ablank2)]/ (Ablank1 - Ablank3)} × 100

③ Glutathine

조직 내 Glutathione함량은 kit(Dojindo,

Japan)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측 정해서 결과를 얻었다.

④ NO assay

조직 내 NO함량은 kit(Oxford, USA)을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정해서 결 과를 얻었다.

⑤ Lipid peroxidation

Lipid peroxidation assay kit(Oxford Biomedical Research. USA)을 이용하여 측 정하였고 586nm에서 흡광도를 측정한 후 MDA를 계산하였다.

⑥ Catalase activity

Catalase assay kit(Oxford Biomedical Research. USA) 를 이용하여 측정하였으며, 520nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.

5) 조직학적 분석

실험 종료 후, 간 조직을 취하여 cryotome 을 이용하여 절편한 후, Hematoxylin and eosin염색(scheme 2)을 실시하였으며, 200배 또는 400배율로 현미경에서 관찰하고 사진 촬영을 실시하였다.

6) 통계처리

본 실험에서 얻은 결과에 대하여 ANOVA

and Bonferroni-type multiple t-test

(parametric), Ver 1.1로 분석하여 p값을 구

하였다. 각 실험군을 비교하여 p<0.05 일 때

유의성이 있는 것으로 판정하였다.

Cryotome

━ PBS 3 min.

Harris Hematoxlin

Rinse(several times) ━ ━ 1 min reaction.

Eosin B Rinse(several times) ━ ━ 5 min

100% EtOH

━ 1 min Xylene

━ 5 min.

Mount

Scheme 2. Harris Hematoxylin & Eosin staining

Ⅲ. 結 果

1. 체중 변화

산화 스트레스를 받은 실험동물의 체중 변화를 확인하기 위하여, 실험 시작일 부터 매일 실험동물의 체중을 측정하였다. 실험 종료 시점에서 정상군은 꾸준한 체중의 증

가를 나타냈으며, 음릉천 유침군 및 음릉천 전침군은 체중의 증가폭이 높지는 않았지만 증가하는 경향을 나타내었다. 군간 통계적으 로 유의한 차이는 발견되지 않았다(Fig. 1).

Fig. 1. The effect of EA at SP9 on body weight oxidized rats.

2. 혈청 분석

각 실험군의 혈청으로부터 혈청 단백질인 albumin, total bilirubin, LDL-cholesterol, LDH, Glucose, GOT 및 GPT의 농도를 측 정하였다(Table 1).

Table 1. The effect of EA at SP9 on serum level of oxidized rats

Parameter Normal Control Holder Sham-EA SP9-NR SP9-EA Albumin(g/㎗) 2.82

±0.09

2.17

±0.26

2.23

±0.04

2.38

±0.12

2.13

±0.51

2.63

±0.07 Total

bilirubin(㎎/㎗)

0.58

±0.12

0.36

±0.01

0.34

±0.01

0.41

±0.08

0.54

±0.19

0.71

±0.29 LDL-cholesterol

(㎎/㎗)

12.75

±2.50

25.25

±2.22

23.50

±4.12

14.00

±1.42

12.20

±2.17

13.00

±2.24 GOT(IU/L) 344.25

±49.80

380.25

±92.45

411.75

±198.69

290.25

±49.15

366.00

±83.17

268.40

±29.62 GPT(IU/L) 39.00

±4.24

48.25 ±6.99

51.25

±20.98

41.00

±7.53

50.60

±9.37

45.60

±5.37

1) Albumin

각 실험군에서 취한 혈청에서 albumin 농 도를 측정한 결과, control군과 holder군에서

normal군에 비하여 혈청 albumin 농도가 감

소하였으며, SP9-EA군은 control군 및 holder

군에 비하여 혈청 albumin 농도가 증가하였

으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 2A).

2) Total bilirubin

각 실험군에서 취한 혈청에서 total bilirubin의 농도를 측정한 결과, normal군에 비하여 control군과 holder군에서 total bilirubin의 농도가 감소하였으며, SP9-NR군 과 SP9-EA군에서는 control군과 holder군에 비하여 total bilirubin의 농도가 증가하였으 나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 2B).

3) LDL-cholesterol

각 실험군에서 취한 혈청에서 LDL cholesterol의 농도를 확인하였다. Normal군 에 비하여 control군과 holder군에서 유의한 증가를 나타냈으며, Sham-EA군, SP9-NR군 및 SP9-EA군에서는 control군과 holder군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다(Fig. 2C).

4) GOT

각 실험군에서 취한 혈청에서 GOT의 농 도를 측정한 결과, normal군에 비해 control 군과 holder군에서 증가하는 것을 확인하였 으나 통계적 유의성은 나타나지 않았다.

Sham-EA 및 SP9-EA군에서 holder군에 비 하여 GOT의 농도가 유의하게 감소하였다 (Fig. 2D).

5) GPT

각 실험군에서 취한 혈청에서 GPT의 농 도를 측정한 결과, normal군에 비해 control 군 및 holder군에서 증가하였으며, sham-EA 군과 SP9-EA군에서는 약간 감소하는 경향

을 보였으나 통계적 유의성은 나타나지 않 았다(Fig. 2E).

(A) Albumin level in oxidized rat serum.

(B) Total bilirubin level in oxidized rat serum.

(C) LDL-cholesterol in oxidized rat serum.

(D) GOT in serum of oxidized rat.

(E) GPT in serum of oxidized rat.

Fig. 2. Blood Chemistry Analysis.

3. 간에서의 항산화 효과

분획한 간 조직으로부터 SOD activity, glutathione 농도, catalsase activity 및 NO 농도, MDA 농도를 측정하였다(Table 2).

1) SOD activity

분획한 간 조직으로부터 항산화 효소인 SOD의 활성을 측정한 결과, normal군에 비 하여 control군 및 holder군에서는 SOD 활 성도가 유의하게 감소하였으며, SP9-EA군 에서는 control군, holder군, sham-EA군 및 SP9-NR군에 비하여 SOD 활성도가 유의하 게 증가하였다(Fig. 3A).

2) Glutathione concentration

분획한 간 조직으로부터 glutathione의 함 량을 측정한 결과, normal군에 비하여 control 및 holder군에서는 glutathione의 함 량이 유의하게 감소하였으며, sham-EA군, SP9-NR군 및 SP9-EA군에서는 glutathione 의 함량이 control및 holder군에 비하여 유의 하게 증가하였다(Fig. 3B).

3) Nitric oxide concentration

분획한 간 조직으로부터 산화물질인 NO함 량을 측정하였다. Normal군에 비하여 control 군에서 NO 함량이 유의하게 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. Sham-EA군, SP9-NR군 및 SP9-EA군에서는 control군과 holder군에 비하여 NO 함량이 감소하였다(Fig. 3C).

4) MDA concentration

분획한 간 조직으로부터 MDA 함량을 측 정한 결과 normal군에 비하여 control군 및 holder군에서 유의한 증가를 확인하였다.

SP9-EA군에서는 control군 및 holder군에 비하여 약간 감소하였으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 3D).

5) Catalase activity

분획한 간 조직으로부터 항산화 효소인 catalase 농도를 측정한 결과, normal군에 비하여 control군에서 유의한 감소를 나타내 었으며, Sham-EA군, SP9-NR군 및 SP9-EA 군에서는 control군에 비하여 유의한 증가를 나타내었다(Fig. 3E).

Table 2. The effect of EA at SP9 on the level of various oxidants and antioxidants in oxidized rat liver Parameter Normal Control Holder Sham-EA SP9-NR SP9-EA

SOD

activity(%) 55.79±5.12 29.02±4.72 28.22±5.73 30.40±11.48 32.68±7.49 48.54±6.81 Glutathione conc.

(umol/L) 126.99±4.70 81.36±3.80 81.40±5.86 123.03±5.01 115.95±4.12 132.62±9.53 NO conc.

(umol/L) 29.73±1.86 45.91±3.00 37.61±2.28 28.32±6.34 30.41±0.96 19.08±4.87 MDA conc.

(umol/㎖) 0.41±0.01 0.56±0.07 0.63±0.01 0.60±0.03 0.63±0.09 0.53±0.02 Catalase

activity(U/㎎) 168.00±0.06 99.82±10.11 168.23±0.16 168.28±0.09 167.83±0.53 168.10±0.12

(A) SOD activity in oxidized rat river.

(B) Glutathione level in oxidized rat river.

(C) NO concentration in oxidized rat river.

(D) MDA concentration in oxidized rat river.

(E) Catalase activity in oxidized rat river.

Fig. 3. Antioxidant effect in liver tissue analysis.

4. 조직학적 분석

항산화에 의한 간 조직에서의 변화를 확 인하기 위하여 간 조직을 적출하여 H&E 염 색법을 이용하여 염색하였다. Normal군(A) 에 비해 control군(B) 및 holder군(C)의 간 조직의 조밀도가 저하되어 있었다. SP9-EA 군에서는 조직의 조밀도가 normal군과 유사 하게 유지되었다(Fig. 4).

Fig. 4. Histological analysis of rat liver tissue.

The rats were injected intraperitoneally (i.p) with AAPH for 7 days (once a day, 50 mg/kg). The rats in the holder, sham-EA, SP9-NR and SP9-EA groups were treated as described in the experimental methods. Rat liver was removed and the liver tissue was sliced and embedded in OCT compound, and 6 ㎛ sections was stained with hematoxilin and eosin.

A: Normal(×400) B: Control(×400) C: Holder(×100) D: Sham-EA(×100) E: SP9-NR(×400) F: SP9-EA (×400)

Normal : normal SD rat

Control : SD rat treated with AAPH

Holder : SD rat treated with AAPH and restraint in the holder

Sham-EA : SD rat treated with AAPH and EA at a sham-EA point

SP9-NR : SD rat treated with AAPH and NR at SP9 SP9-EA : SD rat treated with AAPH and EA at SP9

Ⅳ. 考 察

산소를 이용하여 생명을 유지하고 있는

생물에서는 산소가 전자전달계의 말단에서

전자의 주고받음에 관여함으로써 1전자가 환원된 O

-(superoxide)를 생성하며 계속 환 원되어 H

O를 생성하게 된다. 이 과정 중에 생성된 free radical은 중요한 생체내 분자와 반응하여 이러한 손상의 계속적인 축적의 결과로 노화와 관련된 기능의 쇠퇴를 초래 한다고 하였다

. 물의 방사선 분해에 의 한 radical의 형성과 생체내 산화반응에 대 한 redical의 관여 등이 거론된다. 또한 superoxide(․O

-) dismutase(SOD)의 발견 이래 대사과정에서 O

-등 radical을 포함하 는 활성산소가 생성되는 것이 알려지고, 또 한 radical의 연쇄반응인 과산화지질이 노화 에 관여한다는 사실이 보강되었다

.

Free radical은 정상적인 세포 대사 과정 에서 생성되는데 방사선, 약물, 오존 등 환 경적인 요인에 의해서 그 생성이 증가될 수 있다. Free radical과 반응하는 생체내의 고 분자 물질로는 불포화지방산, 단백질, DNA 등이 있으며 free radical이 불포화지방산과 작용하여 지질과산물질(lipid peroxide)을 만 들고 이것이 단백질, 핵산 등의 아미노기와 반응하면 그 반응산물로 형광물질인 리포푸 신이 형성된다. 불포화지방산은 세포막에 많 이 포함되어 있으므로 이러한 free radical의 작용은 세포막의 손상을 초래하여 free radical이 축적되면 세포막, 혹은 미토콘드리 아나 리소좀 등 미세구조막의 구조를 변형시 켜 물질이동이나 기능 등에 손상을 가져와 세포의 노쇠를 초래하게 된다

. 이 같은 것에 의한 손상을 막기 위해 생명체는 항산 화계를 가지고 있는데 catalase, glutathione peroxidase등은 활성산소에 의한 radical의 생

성을 막는 작용을 나타내고 superoxide dismutase (SOD), albumin, vitamine C 등은 hydroxyl radical, alkoxyl radical을 제거하는 작용을 한다. Protein bound -SH와 glutathione 또한 간에서 독성물질에 의한 radical을 제거한다

.

이러한 free radical은 최근 노화의 기전을 설명하기 위한 이론으로 주목받고 있다. 노 화란 생물체내에서 유전적 요인과 환경적 요인들의 상호작용에 의해 나타나는 복잡한 과정으로서, 생물체내에서 발생하는 여러 가 지 생리적 기능의 저하로 인해 시간이 지남 에 따라 외부로부터 가해지는 스트레스를 이겨내지 못하게 되는 것을 말한다

. 생리 학적인 관점에서 보면 인간의 노화란 모든 기관계가 갖고 있는 항상성 여량이 지속적 으로 고갈되는 것을 특징으로 하며, 항상성 협착으로 불리는 이러한 감소는 20대에 이 미 명백히 일어난다. 개개인마다 속도와 정 도에 차이는 있으나 그 이후 점진적이고 지 속적으로 일어난다. 각각 기관계의 쇠멸은 다른 기관계에서 일어나는 변화와는 무관하 게 독립적으로 일어나는 것으로 생각되며 식이, 환경, 개인의 습관 뿐 아니라 유전적 인 요소에 의해 영향을 받는다

.

한의학에서 老化의 원인을 先天不足과 後

天失調로 설명하는데

, 『素問․上古天眞

論』

에서 “天壽過度 氣脈相通, 而腎氣有

餘”라 하여 先天的으로 타고난 腎氣의 盛衰

와 수명이 밀접한 상관관계를 가지며, “女子

七歲腎氣盛…五七陽明脈衰 面始焦 髮始墮,

丈夫八歲腎氣實…五八腎氣衰 髮墮 齒槁”라

하여 年齡에 따른 臟腑와 經絡의 衰退에 따

라 신체기능의 변화로 老化過程을 설명하고 있다. 『素問‧生氣通天論』

에 “自古通天者 生之本 本于陰陽 … 數犯此者 其邪氣傷人 此壽命之本也”, 『素問‧陰陽應象大論』

에

“年四十而陰氣自半 起居衰”라 하여 陰陽의 平衡과 老化를 관련하여 말하였다.

老化의 原因으로 陰陽學說, 形神設, 氣血 學說, 活血祛瘀設, 淸熱設 및 腎氣設 等이 있는데, 人體의 衰退를 陰陽, 臟腑, 氣血, 經 絡 및 精神의 變化로 보고 있으며

, 先天 的 요소와 밀접한 臟腑로는 腎을, 老化가 진 행되면서 肝을 기시로 五臟 機能이 衰退한 다 하였다.

陰陵泉(SP9)은 足太陰脾經의 合水穴로 一 名 陰之陵泉이라고도 하며, 종아리의 안쪽에 위치하고 있다. 運中焦, 化濕滯, 調膀胱, 祛風 冷의 효능이 있어 健脾益腎, 祛濕利水, 健脾 和胃, 理氣降逆하여 陽痿, 白帶下, 子宮痙攣, 陰莖痛, 遺精등의 비뇨생식기질환과 脚氣, 膝關節周圍炎, 腰痛등의 근골격계질환과 腹 脹, 腹中切痛등의 소화기 질환을 主治한다

.

이에 著者는 陰陵泉이 항산화에 효과가 있 을 것으로 思料되어 陰陵泉을 선택하여 電鍼 刺戟을 가하고 항산화 효능을 관찰하였다.

電鍼療法은 프랑스에서 sarlandiere가 신경 계통 질환에 처음 사용한 이래 근래에 임상 에 폭넓게 응용되고 있다

. 電鍼은 지속적 인 자극을 할 수 있으며 자극량을 객관적으 로 조절할 수 있다는 장점이 있어 신경통이 나 마비질환등 기능성 질환에는 더욱 효과 적인 것으로 알려졌다. 電鍼療法은 자극요건 에 따라 치료효과가 차이가 있는 것으로 알 려져 있으며, 최근 電鍼을 이용한 연구가 활

발해 지고 있다

.

본 실험에서는 AAPH로 산화적 스트레스 를 유발시킨 쥐의 陰陵泉(SP9)

에 留鍼 및 電鍼 자극하여 혈청 albumin, total bilirubin, LDL-cholesterol, LDH, glucose, GOT 및 GPT를 측정하고, 간 조직으로부터 SOD acivity, glutathione 농도, catalase activity, NO 농도 및 MDA 농도를 측정하였다.

AAPH는 수용성의 azo화합물의 일종으로 서 열분해에 의해서 free radical을 생성시키 는 것으로 알려져 있다. 복강내로 투여된 AAPH는 수분내에 혈류를 타고 전신으로 퍼져 AAPH는 산소분자와 반응하여 생성된 탄소자유기(carbon radical)는 이어서 과산 화자유기(peroxyl radical)를 생성하여 여러 형태의 생물학적 분자와 결합 반응을 일으 켜 생체막의 구조를 허물게 하는 것으로 생 각되고 있다

.

본 실험에서 흰쥐에 AAPH로 산화적 스트 레스를 유발하고 電鍼刺戟을 가한 후 실험동 물의 체중변화를 살펴본 결과, 산화와 陰陵 泉 留鍼 및 電鍼刺戟에 의하여 체중변화에 유의한 차이를 나타내지는 않았다(Fig. 1).

각 실험군의 혈청으로부터 albumin, total bililubin, LDL-cholesterol, GOT및 GPT의 농도를 측정하여 분석하였다(Table 1).

Albumin은 혈청 총단백 중에서 가장 많

은 성분으로, 영양상태와 간 상해 정도를 판

정하는데 유용하며, 신증후군, 중증 간질환,

영양실조, 단백 누출성 위장증, 각종 염증

질환 등에서 감소하는 경향이 있다

. 본 실

험에서 albumin의 농도는 control군과 holder

군에서 normal군에 비하여 감소하였으며,

SP9-EA군은 control군 및 holder군에 비하 여 혈청 albumin 농도가 증가한 것을 확인 하였으나 통계적 유의성은 없었다(Table 1, Fig. 2).

Bilirubin은 헤모글로빈의 구성성분인 헴 (Heme)의 대사산물로서 간에서 포함, 배설 되는데 간질환이 있으면 정체되어 혈중농도 가 증가된다

. 본 실험에서 total bilirubin 의 농도는 normal군에 비하여 control군과 holder군에서 減少하였으며, SP9-NR군과 SP9-EA군에서는 control군과 holder군에 비 하여 total bilirubin의 농도가 증가하였으나 통계적 유의성은 없었다(Table 1, Fig. 3).

Cholesterol은 간기능장애, 각종 내분비 질 환 등에서 변화하는데 당뇨병, 신증후군, 만 성사구체신염의 활동기, 폐색성황달, 갑상선 기능저하, 동맥경화증, 지질대사장해 및 급 성출혈 후 등과 같은 질환에서 증가하는 경 향을 나타낸다

. 본 실험에서 산화 작용에 의한 LDL cholesterol의 생성은 normal군에 비하여 control군과 holder군에서 유의한 증 가를 나타냈으며, sham-EA군, SP9-NR군 및 SP9-EA군에서는 control군과 holder군에 비하여 유의한 감소를 나타내었다(Table 1, Fig. 4). 이는 陰陵泉 留鍼刺戟 및 電鍼刺戟 이 간손상을 방지하는 효과가 있음을 의미 하는 것으로 思料된다.

Aminotransferase는 Amino기 전이반응을 촉매하는 효소의 총칭으로 임상적으로 saparatate aminotransferase(GOT)와 alanine aminotransferase(GPT)가 많이 이용되는데 설치류에서도 이와 같은 경향을 뚜렷하다

35,36)

. GOT와 GPT는 거의 모든 장기에 분

포하지만 특히 GOT는 심장, 간, 골격근에 분포하며 GPT는 간에 많이 분포한다. 이들 효소는 간질환시 동조적으로 증가하며 이 증가는 간세포의 손상정도 및 그 범위와 평 행하고 있다. 혈중의 효소는 대부분 세포질 유래효소이다. 급성간염의 경우는 GOT, GPT가 혈청 Bilirubin증가에 선행하며, 먼 저 안정된다. 또한 초기에는 GOT가 GPT보 다 높으며 뒤이어 GPT가 GOT보다 높아진 다. 이러한 경우는 바이러스성 간염, 전염성 단핵구증, 중독성 간염 등에서 나타난다. 만 성간염의 경우는 GOT, GPT가 중등도의 증 가를 보이나 GPT가 조금 더 높다. 간경변 증에서는 GOT가 GPT보다 높으며 대개 GOT가 GPT보다 2배 이상 증가한다

. 본 실험에서 GOT의 농도는 normal군에 비 해 control군과 holder군에서 증가하였으나 통계적 유의성은 없었으며, holder군에 비하 여 sham-EA 및 SP9-EA군에서는 GOT의 농도가 유의하게 감소하였다(Table 1, Fig.

5). 이는 陰陵泉 電鍼刺戟이 간손상을 억제 하는 효과가 있음을 의미하는 것으로 思料 된다. GPT의 농도는 산화에 陰陵泉 電鍼刺 戟에 의하여 별다른 변화를 나타내지 않았 다(Table 1, Fig. 6).

간에서의 항산화 효과를 알아보기 위해 분획한 간 조직으로부터 SOD acivity, glutathione 농도, catalase activity 및 NO 농도, MDA 농도를 측정하였다(Table 2).

Superoxide dismutase(SOD)는 인체내에

과산화반응 방어기구(항산화 기구)중 하나

이며, 생체에서 xanthine oxidase, aldehyde

oxidase 등의 산소반응의 결과로 생성되어진

superoxide anion radical을 H

O

로 쉽게 전 환시키는 것으로 활성산소를 제거하는 작용 을 가지고 있다

. 본 실험에서 SOD의 활성 도는 normal군에 비하여 control군 및 holder 군에서 유의하게 감소하였으며, SP9-EA군에 서는 control군, holder군, sham-EA군 및 SP9-NR군에 비하여 SOD 활성도가 유의하 게 증가하였다(Table 2, Fig. 7).

Glutathione은 생체 내에서 생합성되는 tripeptide인데 주로 간에서 생성되어 여러 장기에 널리 분포하면서 외부에서 유입된 유독물질과 포합반응을 하여 체외로 배출시 키는 작용을 지니고 있다

. 본 실험에서 glutathione의 함량은 normal군에 비해서 control 및 holder군에서는 유의하게 감소하 였으며, sham-EA군, SP9-NR군 및 SP9-EA 군에서는 glutathione의 함량이 control및 holder군에 비하여 유의하게 증가하였다 (Table 2, Fig. 8).

NO는 염증의 화학 매개체 중 하나이며, 동시에 free radical로 작용하고, 반응성이 강 한 NO2와 NO3-로 바뀔 수 있어, 병리적 혈 관확장, 세포독성, 조직손상 등 생체에 유해 한 작용을 나타내고, 염증상태에서 혈관 투 과성, 부종 등 염증반응을 촉진시키는 것으 로 알려져 있다

. 본 실험에서 NO함량은 normal군에 비하여 control군에서 유의하게 증가하였으며, SP9-NR군과 SP9-EA군에서 는 control군과 holder군에 비하여 감소를 나 타내었다(Table 2, Fig. 9).

Lipid peroxide는 세포막의 지질성분이 독 성물질들에 의해서 손상을 받게 되면 지질 성분의 산화반응이 촉진되어 나타나는 반응

산물이다

. 본 실험에서 MDA 함량은

normal군에 비하여 control군에서 유의하게 증 가하였으나, 陰陵泉 留鍼이나 電鍼刺戟에 의한 변화는 발견되지 않았다(Table 2, Fig. 10).

Catalase는 세포내 존재하는 항산화효소 로써, H

O

를 분해하여 제거하는 작용을 가 진다

. Catalase 농도는 normal군에 비하여 control군에서 유의한 감소를 나타내었으며, sham-EA군, SP9-NR군 및 SP9-EA군에서 는 control군에 비하여 유의한 증가를 나타 내었다(Table 2, Fig. 11).

SP9-EA군에서 control군에 비하여 SOD, glutathione, NO, MDA, catalase가 증가한 것은 陰陵泉 電鍼이 항산화 작용을 하는 이 들 효소들의 분비를 촉진하여 나타난 것으 로 思料된다(Fig. 7-11).

산화에 의한 간 조직에서의 변화에 대한 陰陵泉 電鍼의 영향을 확인하기 위하여 간 조직을 적출하여 H&E 염색 후 관찰한 결 과, normal군에 비해 control군의 간 조직의 세포의 조밀도가 저하되었으며, SP9-EA군 에서는 세포의 조밀도가 normal군과 유사하 게 유지된 것을 확인하였다(Fig. 12). 이는 陰陵泉 電鍼이 肝의 구조적 보호에도 유효 함을 나타낸 것으로 思料된다.

이상의 결과를 총괄하여 보면, blood

chemistry를 분석한 결과에서는 LDL-

cholesterol와 GOT는 유의성이 있었으나,

albumin, total bilirubin, GPT에서는 농도의

차이는 보였으나 유의성은 없었으나, 간에서의

항산화효과에서는 SOD activity, glutathione

농도, catalase activity 및 NO농도는 유의성

있는 결과를 나타내었으나 MDA농도는 유

의성이 없었다. 조직학적 분석을 통하여 보 았을 때도 유의성 있는 결과를 보였다. 이는 陰陵泉 留鍼刺戟 및 電鍼刺戟이 일부 실험 에서는 간손상을 방지하는 효과가 있는 것 으로 보였고, 항산화 작용을 하는 효소들의 분비를 촉진하며, 간의 구조적 보호함에도 유효함을 나타낸 것으로 思料된다.

Sham-EA군에서도 대부분 SP9-EA군과 비슷한 결과를 보였으나 그 변화가 미약하 였고, SP9-NR과 SP9-EA군을 비교했을 때 도 SP9-EA군의 결과가 좀 더 유의성이 있 었다. 이는 전기적 자극이 자침효과를 증대 시켰음을 의미하는 것으로 사료된다.

이상으로 陰陵泉電鍼이 항산화작용에 미 치는 영향을 분석한 결과, 陰陵泉 電鍼이 항 산화에 유효함을 나타내었으며, 임상적인 활 용을 위해서는 좀 더 깊은 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Ⅴ. 結 論

AAPH로 산화적 stress를 유발시킨 흰쥐 를 대상으로 陰陵泉 電鍼이 항산화에 미치 는 영향을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. SP9-EA군에서 control군 및 holder군에 비하여 혈청 LDL-cholesterol이 유의하게 감소하였다.

2. SP9-EA군에서 control군, holder군 및 sham-EA군에 비하여 간장내 SOD 활성 도가 유의하게 증가하였고, control군 및 holder군에 비하여 glutathione 농도는

유의한 증가를 NO농도는 유의한 감소를 나타내었다.

3. SP9-EA군의 간조직은 control군 및 holder 군의 간조직에 비하여 세포의 조밀도가 normal군과 유사하게 유지되었다.

4. SP9-NR군에서도 SP9-EA군과 비슷한 경 향의 결과를 보였으나 SP9-EA군에 비하 여 유의성이 낮았다.

以上의 결과로부터, 陰陵泉 電鍼이 항산화 효소의 감소를 억제함으로써 산화물질의 생 성을 억제시켜 항산화효과를 발휘하는 것으 로 思料된다.

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