Otolaryngology & Dermatology 2010;23(1) : 94-110
선퇴가 인간의 THP-1 단핵구에서 사이토카인 유전자 발현에 미치는 영향
안종현·김경준
경원대학교 한의과대학 안이비인후피부과학 교실
Effects of Cryptotympana pustulata on the expression of cytokine genes in human monocytes of THP-1
Jong-Hyun An·Kyung-Jun Kim
Objective : This study was performed to evaluate the effect of immune reaction inductive substances such as phorbol-myristate-acetate(PMA), lipopolysaccharide(LPS), dermato-phagoides pteronyssus crude extract(DPE), dinitrochloro-benzene(DNCB) and Cryptotympana pustulata(CP), the Cryptotympana pustulata extracting substance at simultaneously on the translocation of nuclear factor-kappa B(NF-κB) towards to the nucleus and the mRNA expression patterns of various cytokine genes in Human acute monocytic leukemia cell line(THP-1 cells), monocytes of human.
Experiment : To analyze cytokine genes expression patterns, the RT-PCR method was used, measuring tumor necrosis factor(TNF)-α that had been secreted during cell culture in the ELISA method. The morphological change in the cell observed during THP-1 cell culture was observed using a scanning electron microscope (SEM) and the quantitative distribution in the cell NF-κB was analyzed through immunocytochemistry and a confocal microscopy.
Result : CP showed different influences onto the mRNA expression patterns of cytokine genes with PMA, LPS. DPE and DNCB according to the types of immune inductive substances in the THP-1 cells.
The expressions of inter-leukin(IL)-10, interferon(INF)-γ, TNF-α and monocyte chemoattractantant protein(MCP)-1 induced by PMA were suppressed by CP while the expression of transforming growth factor(TGF)-β was promoted.
Regarding the secretion pattern of TNF-α according to PMA processing, its secretion amount was increased by CP concurrent processing, in case of processing CP onto PMA and LPS, We discovered that the secretion amount of TNF-α was increased.
Upon processing PMA and LPS on the THP-1 cell strain at the same time or either additionally processing CP thereon, the movement increase towards the nucleus from the NF-κB cell cytoplasm, a transcription factor was able to be observed.
Conclusion : In this study, Cryptotympana pustulata extracting substance was confirmed that it had an
교신저자 : 김경준, 인천광역시 중구 용동 117번지 경원대학교 부속 길한방병원 한방안이비인후피부과
(Tel. 032-770-1215, E-mail : [email protected])
∙접수 2010/03/06 ∙수정 2010/03/29 ∙채택 2010/04/09
*이 논문은 2010년도 경원대학교 교내연구비 지원에 의하여 수행되 었음.
influence on expression patterns of cytokine genes according to the actions of a variety kinds of immune reaction inductive substances processed on the monocyte THP-1 cell of humans. Therefore, additional studies as for the immune adjusting function of Cryptotympana pustulata are considered to be able to offer important materials for curing immune abnormal diseases such as atopy dermatitis afterward.
Key words : cytokine, Cryptotympana pustulata, PMA, LPS, DPE, DNCB, THP-1, atopy
I. 서 론
인체의 면역계는 인체에 해가 될 수 있는 세균, 박테리아, 기생충 등의 외부로부터 침입을 방어하 는 것을 목표로 하고 있다. 면역계를 크게 나누면 자연면역과 특이면역으로 나눌 수 있는데, 자연면 역은 외부 침입에 대한 1차 방어를 담당하고, 특이 면역은 자연면역만으로는 해결할 수 없는 상황을 대비하여 존재하는 것으로 볼 수 있다. 대부분의 외부 물질은 피부와 점막표면을 통해 들어오기 때 문에 대부분의 감염은 피부점막표층에서 일어나는 데 피부점막 면역은 자연면역이 어느 인체부위보 다도 고도로 잘 발달되어 있다1). 피부점막표층에서 의 과도하고 과민한 면역반응이 만성적으로 진행 되는 경우에 아토피 피부염을 유발한다. 아토피 피 부염의 경우는 1차 방어역할을 하는 피부면역이 약화되어 있고, 대신에 특이면역이 과도하게 발달 되어 있는 상태이다2). 그중 특히 세포성면역보 다는 항체면역이 과도하게 발달되어 있는데, immunoglobulin(Ig)E를 매개로 한 항체면역의 발 달이 주요 특징이다. 이러한 면역학적인 상태를 Th1 계열의 사이토카인인 interferon(INF)-γ, tumor necrosis factor(TNF)-α, inter-leukin(IL)- 12 와 Th2 계열의 사이토카인인 IL-4, IL-5,
IL-10, IL-13로 나눠 비교 할 수 있다3).
아토피 피부염은 심한 소양감을 동반하는 만성, 재발성의 피부염증을 특징으로 하는 질환으로4,5), 주로 유․소아기에 발병하며, 후에 기관지 천식이나 알레르기성 비염 등이 발생하게 되는 경우가 많다.
정확한 병인은 알려져 있지 않지만 유전적 배경부 터 음식에 대한 알레르기, 면역학적 이상, 피부장 벽의 이상, 환경적 사회적 인자 및 심리적 연관성 등이 제기되고 있으며, 그 중에서도 면역학적인 장 애는 Th2 림프구의 활성화로 알려져 있으며 급성 기에 피부림프구항원을 높게 발현하는 CD4(+) 기 억/작동 Th2 세포의 현저한 혈관주위의 침윤, 병 변부위의 Th2 사이토카인의 분비증가와 IL-4에 대 한 말초혈액 단핵구의 고반응성 등을 특징적으로 보인다. 환자의 말초 혈액은 Th2 표현세포가 증가 되어 있고 Th1 표현세포는 감소되어 있으며, IL-13의 표현이 증가되어 있어 전신적인 Th2 환 경이다. 급성 피부병변에는 많은 수의 IL-4, IL-5, IL-13 mRNA 표현 세포가 존재하지만 IFN-γ, IL-12 mRNA 표현세포는 적은 편이다. 따라서 아 토피 피부염의 급성기에는 주로 Th2 사이토카인이 염증반응에 관여됨을 알 수 있다.
아토피 피부염과 명확하게 일치하는 한의학적 병명은 없으나 瘡, 癬, 風을 포괄하고 있으며 원인 은 風, 濕, 熱이다. 奶癬, 嬰兒濕疹, 浸淫瘡, 胎斂 瘡, 血風瘡, 四灣風 등의 범주에 해당하며6), 일찍 이 巢元方의 《諸病源候論》7)에 “小兒面上癬皮如甲 錯起乾燥, 謂之乳癬”이라는 기록 이래로 , 陳實功의
《外科正宗》8)에서는 “因兒在胎中, 母食五辛, 父餐 炙煿 遺熱與兒”가 원인이 되고 임상표현은 “頭面偏
身 發奶癬, 流滋成片, 睡臥不安, 瘙痒不絶”이라고 하였다.
선퇴(蟬退, Cryptotympana pustulata)는 蟬科에 속한 곤충인 蚱蟬(Cryptotympana pustulata FABR.)이 地中에서 나와 성충이 될 때 탈락한 皮 殼으로 解表藥 중에 發散風熱藥에 속하며 性은 寒 無毒하고 味는 甘하며, 肺 肝經으로 귀경한다. 性 은 寒하고 質이 輕하여 肺와 肝經에 들어가 肺經 의 風熱을 宣散하여 解表透疹에 효능이 있고, 또한 肝經에 들어가 凉肝息風시켜 止痙退翳의 효능이 있어 風疹瘙痒의 증에 많이 응용된다9). 아토피 피 부염에 효과적이라 연구된 淸肌散, 加味敗毒散, 消 風散 등에 포함되어 있어 아토피 피부염의 원인인 風, 濕, 熱을 효과적으로 치료할 것이라고 생각되 어 약재 선정을 하였다.
선퇴의 물 추출물과 에탄올 추출물의 항경련, 진정작용, 해열효과10), 물 추출물이 compound 48/80에 유도된 전신 아나필락시의 억제와 복강비 만세포의 히스타민과 혈청 중 히스타민의 유리 억
제11,12) 등의 연구가 있으며 알레르기 반응을 억제
하는 효과가 있는 것으로 보고되었다.
선퇴가 들어간 처방으로는 淸肌散, 加味敗毒散, 消風散 등이 있는데 그에 관련한 연구 중 淸肌散 이 Th2 세포 분화와 염증에 미치는 영향13), 加味 敗毒散 경구투여에 의한 Nc/Nga 생쥐의 아토피 피부염 억제 작용14), 淸肌散과 加味淸肌散이 마우 스의 항알레르기 및 면역반응에 미치는 영향15), 消 風散과 加味消風散이 면역반응 및 항알레르기에 미치는 영향16) 등을 통해 선퇴가 면역반응 조절에 영향을 미쳐, 염증에 효과가 있으며 아토피 피부염 의 치료에 영향이 있을 것으로 보고되었다.
본 연구에서는 아토피 피부염 관련 면역 반응의 기전 연구를 위한 병리모델에서 유용하게 사용되 고 있는 인간의 단핵세포주인 Human acute monocytic leukemia cell line(THP)-1에 세포분화 유도인자인 phorbol-myristate-acetate(PMA)를 처
리하면서 면역반응 유발물질인 lipopolysaccharide (LPS), 먼지진드기 추출물 dermato-phagoides pteronyssus crude extract(DPE), 화학물질인 dinitrochloro-benzene(DNCB)을 사용하여 면역 반응을 유발한 후 다양한 사이토카인의 발현시킨 결과를 비교 분석하였다. 특히, 알레르기 반응을 억제하는 것으로 알려져 있는 선퇴추출물(CP)을 각각 처리하여 사이토카인 유전자 발현에 관련된 효과와 염증 반응의 중요한 조절인자로 알려져 있 는 TNF-α 분비량을 측정하고 다양한 사이토카인 의 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자인 nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 세포질에서 핵 으로의 전이 정도를 확인하고자 하였다.
II. 실 험
1. 재료
1) 세포주와 세포 배양
실험에 사용한 인간 단핵구 세포주인 THP-1은 한국세포주연구재단(KCLB, Korea)에서 구입하였 으며, RPMI 1640에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/㎖ penicillin과 100 ㎍/㎖ streptomycin 을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 의 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2일 마다 교 환해 주었으며, 계대배양은 배양 중인 세포들이 플 라스크의 80% 정도 자랐을 때 각 세포주의 기본 배지로 수세한 후 새로운 플라스크에 분주하였다.
계대배양 과정에서는 10% FBS 조건을 유지하였 다. THP-1을 분화시키기 위하여 Phorbol-myristate- acetate(PMA; Sigma, St Louis, USA)를 사용하였 다.
2) 사용약재
실험에서 사용한 선퇴(CP)는 허브팜에서 구입하 였고, 신흥무역에서 중국으로부터 2005년 12월 22
일 검사하여 수입한 것을 구입하여 사용하였다.
3) 시약
면역 반응 유발물질로 알려져 있는 lipopolysaccharide(LPS)는 Sigma (St Louis, USA)에 서, 먼지진드기 추출물 dermatophagoides pterony-ssus crude extract(DPE)는 Cosmo Bio (Japan)에서, 화학물질인 dini-trochlorobenzene (DNCB)은 Fisher Scientific(USA)에서 구입하였 다. CP는 막자사발을 이용하여 분말을 만들어 100
㎎을 칭량하여 1 ㎖의 dimethylsulfoxide(DMSO) 로 용해한 후 실온에서 2시간 동안 전탕하여 4000 RPM에 10분간 원심분리하였다. 원심분리된 시약 의 상청(supernatant)을 취하여 0.22 ㎛ filter로 여과멸균 후 Bradford 시약을 이용하여 단백질의 농도를 측정하였다. 각각의 면역 반응 유발물질들 이 처리된 세포들에서 total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen, Germany)를 사용하여 분리하 였으며, 사이토카인 유전자들의 발현 양상을 확인 하기 위한 RT-PCR primers 는 Table Ⅰ에 나타 낸 염기서열로 합성하였으며, AccuPower RT-PCR PreMix는 Bioneer(Korea) 제품을 사용하였다. 면 역 반응 유발물질 처리 후 PMA에 의해 분화된 THP-1 세포에서 분비된 TNF-α 양을 측정하기 위한 ELISA kit은 Koma Biotech(Korea) 제품을 사용하였다.
2. 방법
1) 세포 독성 실험
배양된 세포를 96-well plate에 THP-1을 일정 량(1×104/㎖) 접종한 후에 면역 반응 유발물질을 각각 LPS(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖), DPE(0, 1, 10, 50
㎍/㎖), DNCB(0, 1, 5, 20 ㎍/㎖), CP(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖) 등의 농도로 처리하였다. 처리 농도는 기존의 연구 결과들을 참고하여 고, 중 저 농도의
3단계로 처리하였다20,21). 각각의 물질을 48시간 동 안 처리한 후 증식된 세포의 수를 비교하여 세포 독성 결과를 확인하였다.
2) 면역 반응 유발물질의 처리
배양된 세포를 4-well plate에 각각의 세포주를 일정량(5×104/㎖) 접종한 후에 면역 반응 유발물질 을 각각 LPS(1 ㎍/㎖), DPE(10 ㎍/㎖), DNCB(5
㎍/㎖)의 농도로 처리하였다. 처리 농도는 기존의 연구 결과들과 세포 독성 실험 결과를 참고하였다
20,21)
. CP의 처리 농도는 세포 독성 시험에서 대조 군에 비해 60% 이상의 세포증식률을 나타낸 1 ㎍/
㎖의 농도로 처리하였다. 각각의 면역 반응 유발물 질들이 처리된 세포들에서 분비된 TNF-α의 단백 질량을 측정하기 위해 면역 반응 유발물질을 처리 한 후 0, 6, 12, 24, 48 시간에 배양 중인 배지를 수획하였으며, 각각의 처리 시간에 lysis buffer와 분리 시약을 이용하여 total RNA를 추출하였다.
3) 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)
각각의 시료에서 추출된 total RNA의 양은 spectrophotometer로 정량하였으며, 그 상태는 2% agarose gel 전기영동 후 18s와 28s rRNA band를 전기영동을 통해 관찰하였다. 추출한 total RNA 300 ng을 reverse transcription mixture (5X PrimeScriptTM Buffer, PrimeScript-TM RT Enzyme Mix I, 50 μM Oligo dT Primer, 100 uM Random 6 mers, RNase Free dH2O)에 혼 합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 RNA에 대 한 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다.
합성된 cDNA 1 ㎕과 각각의 유전자에 대한 primers(Table Ⅰ)를 PreMix PCR tube에 넣고 초기 denaturation(94℃에서 5분) 후에, 증폭을 위 해 94℃에서 1분, 55～59℃에서 1분, 72℃에서 1 분의 주기를 각각의 유전자의 특성에 따라 30～38 주기 시행하였다. PCR 산물은 2% agarose gel 상
에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 후 UV light 하에서 densitometer(Vilber Lourmat, France)를 이용하여 relative intensity를 측정하였다. 비교정량적인 분석을 위하여 GAPDH 를 internal control로 사용하였으며, GAPDH PCR 산물 intensity에 대한 각각의 유전자들의 PCR 산물 intensity의 비율로 양적인 비교를 실시 하였다.
4) 효소결합 면역흡착분석법
(Enzyme-linked immunosobent assay:
ELISA)
각각의 시료에서 배양액으로 분비된 TNF-α을 효소결합 면역흡착분석법(ELISA)으로 측정하기 위 해 실험 과정에서 배양액을 수획하여 측정 전까지 -70℃에서 보관하였다. 일차적으로 TNF-α에 대한 mouse monoclonal antibody가 도포되어 있는 96-well plate에 시료를 처리하기 전에 비특이적인 반응을 억제하기 위해 0.05% Tween-20이 포함된 PBS를 사용하여 2번 수세하였다. 제조사의 사용방 법에 따라 negative control과 positive control 그 리고 시료를 96-well plate에 1시간 동안 처리하였 으며, 발색 반응 결과를 Genios ELISA reader(Tecan, Switzerland)를 사용하여 측정하였 다. 시료의 TNF-α 농도는 흡광도에 대한 표준농 도곡선을 이용하여 계산하였다.
5) 주사전자현미경 관찰
(Scanning electron microscopy)
배양된 시료를 채취하여 2.5% glutaraldehyde용 액(0.1M phosphate buffer, pH 7.4, 4℃)에서 2 시간 동안 전 고정 한 후, 완충용액(0.1M phosphate buffer)으로 10분씩 3회 세척하고, 1%
Osmium tetroxide(0.1M phosphate buffer, pH 7.4, 4℃)로 1시간 동안 후 고정 하였다. 동일 완 충액(0.1M phosphate buffer)으로 10분씩 3회 세
척한 후, 50%-70%-90%-95% 에탄올로 각각 10분 씩 처리하고, 100% 에탄올로 10분씩 3회 처리하 였다. 탈수 처리가 끝난 시료는 isoamyl acetate로 치환 후 액체이산화탄소에 의한 임계점 건조 (HCP-2, Hitachi, Japan)과정으로 건조시킨 후 aluminum stub에 고정하여, 이온코팅기(E-1030, Hitachi, Japan)를 이용하여 약 5～10 ㎚ 두께로 Pt-Pd ion particle 코팅 처리 후, 전계방사형 주 사전자현미경(S-4700, Hitachi, Japan)을 이용하여 가속전압 10 ㎸상에서 관찰하였다.
6) 면역형광 세포화학염색법
(Immunofluorescent cytochemistry) 각각의 시료에서 세포질 내에서 활성화된 NF-κ B의 핵 내부로의 이동(translocation) 여부를 알아 보기 위해 mouse monoclonal NF-κB p65(F-6) antibody(Santacruz, sc-8008)를 1차 항체로 사용 하고, 2차 항체로는 goat anti-mouse IgG Rhodamine-conjugate antibody(Invitro-gen, USA)를 사용하여 공초점 현미경(Zeiss, Germany)을 통하 여 관찰하였다. 핵은 DAPI로 염색하여 관찰하였 다. 관찰된 형광이미지를 세포질과 핵질로 구분하 여 NF-κB의 intensity ratio를 Zeiss image analy-sing program(Germany)으로 정량화하여 비 교하였다.
III. 결 과
1. 단핵구에서 면역 반응 유발물질에 대한 세포 독성 양상
인간 단핵구 세포주인 THP-1에 면역 반응 유발 물질인 LPS(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖), DPE(0, 1, 10, 50 ㎍/㎖), DNCB(0, 1, 5, 20 ㎍/㎖), CP(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖) 등을 처리한 결과, 저농도에서 77~93%, 중간 농도에서 65~78%, 고농도에서
Table Ⅰ. Primers of RT-PCR for Various Cytokines
Name of genes Primer sequences (5'--->3') Product
size (bp)
IL-1α F
R
CTCACGGCTGCTGCATTACA
GTGCCGTGAGTTTCCCAGAA 236
IL-8 F
R
ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT
TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC 292
IL-10 F
R
ATCAAGGCGCATGTGAACTC
GTTGGCTCCCCAAAGAACAT 598
IFN-γ F
R
AACTGTCGCCAGCAGCTAAA
GAAGCACCAGGCATGAAATC 560
TGF-β F
R
GCGGCAGCTGTACATTGACT
CCACGTAGTACACGATGGGC 239
TNF-α F
R
TGGGATTCAGGAATGTGTGG
TACCCCGGTCTCCCAAATAA 363
LT-α F
R
GGTCGTCACCACCTCTCCTT
TAGTCCCCTCCCTGCCTCTA 279
MCP-1 F
R
AATGCCCCAGTCACCTGCTGTTAT
GCAATTTCCCCAAGTCTCTGTATC 427
β2-MG F
R
TGAATTCACCCCCATTGAAA
CAAATGCGGCATCTTCAAAC 137
GAPDH F
R
ACTGCCAACGTGTCAGTGGT
TGGTCCAGGGGTCTTACTCC 320
Abbreviation
IL: interleukin, IFN: interferon, TGF: transforming growth factor, TNF: tumor necrosis factor, LT: lymphotoxin, MCP: monocyte chemoattractantant protein, MG: microglobulin, GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
Table Ⅱ. Cytotoxicity of Immune Modulating Substances (LPS, DPE, DNCB and CP) on THP-1 Monocytes
Low conc. Medium
conc. High conc.
LPS DPE DNCB
CP
77.1%
86.0%
92.7%
90.3%
64.5%
76.0%
78.1%
64.6%
45.1%
52.0%
61.0%
45.2%
Abbreviation : lipopolysaccharide(LPS), dermatophagoides pteronyssus crude extract (DPE), dinitrochlorobenzene (DNCB), Cryptotympana pustulata Extract (CP), Human acute monocytic leukemia cell line (THP-1)
45~61%정도의 세포가 증식하는 독성을 나타내었 다(Table Ⅱ). 본 연구에서는 세포가 증식하는 중
간 정도의 독성을 나타내는 농도를 선정하여, 1 ㎍ /㎖의 LPS, 10 ㎍/㎖의 DPE, 5 ㎍/㎖의 DNCB, 1
㎍/㎖의 CP 등을 실험에 사용하였다.
2. THP-1에서 면역 반응 유발물질에 의한 사이 토카인 유전자의 발현 양상
THP-1에서는 IL-8, IL-10, IFN-γ, lymphotoxin (LT)-α, transforming growth factor(TGF)-β, TNF-α, monocyte chemoattractantant protein (MCP)-1 등의 발현이 관찰되었으며, THP-1에 10 ng/㎖의 PMA를 처리하여 대식세포로의 분화를 유 도하였을 때, IL-1α의 발현이 유발되었으며, IL-10, IFN-γ, LT-α TGF-β, TNF-α, MCP-1, IL-8, IFN-γ, TGF-β, TNF-α, MCP-1 등의
Fig. 1. Effects of immune modulating substances, PMA, DPE, DNCB, LPS and CP on the mRNA expression of various cytokines in THP-1 cells. Schematic presentation of relative expression pattern as color intensity of tiles.
Abbreviation : same as Table I, Table Ⅱ, Phorbol-myristate-acetate (PMA)
mRNA 발현이 다소 증가되었다. PMA 처리 후 24시간까지 대부분의 mRNA 발현이 유사하거나 증가하였으나, 48시간에서는 TNF-α 의 mRNA 발현이 감소되었다(Fig. 1).
THP-1에 PMA와 박테리아 항원인 LPS를 동시 에 처리한 경우에는 PMA 단독 처리 시에 비해 IL-1α의 mRNA 발현이 다소 감소되었으며, IL-8
과 TGF-β의 mRNA 발현은 증가되는 양상을 나 타내었다. PMA와 CP를 동시에 처리한 경우에는 IL-10, IFN-γ, TNF-α, MCP-1 등의 mRNA 발 현이 감소되었으며, TGF-β의 mRNA 발현은 다 소 증가되었다(Fig. 1).
THP-1에 PMA처리를 하여 대식세포로 분화시 키는 과정에서 DPE, DNCB, LPS 각각과 CP를
Fig. 2. Effects of immune modulating substances (DPE, DNCB and LPS) with CP on the mRNA expression patterns of various cytokines in PMA treated THP-1 cells. Schematic presentation of relative expression pattern as color intensity of tiles.
Abbreviation : same as Table I and Fig. 1.
추가로 동시에 처리한 경우에 나타나는 사이토카 인 유전자들의 변화 양상을 Fig. 2에 나타내었다.
THP-1 세포를 PMA처리 한 후에 DPE와 CP를 동시에 처리한 경우에는 DPE만을 처리한 경우에 비해 TGF-β의 mRNA 발현이 증가되었으나, TNF-α와 MCP-1의 mRNA 발현은 감소되는 양 상을 나타내었다. DNCB에 CP 처리한 경우에는
DNCB만 처리한 경우에 비해 IFN-γ의 mRNA 발현이 감소되었으나 TGF-β의 mRNA 발현이 증 가되었다. LPS와 CP를 동시에 처리한 경우에는 LPS만 처리한 경우에 비해 전체적으로 유사한 양 상을 보였으나, MCP-1의 mRNA 발현이 다소 감 소되는 양상이 관찰되었다(Fig. 2).
3. THP-1에서 면역 반응 유발물질에 의한 TNF- α 분비 양상
THP-1에 10 ng/㎖의 PMA를 처리하여 대식세 포로의 분화를 유도하였을 때, TNF-α의 분비량은 시간 의존적으로 증가하였다. PMA와 DPE를 동시 에 처리한 경우에는 PMA에 의해 유발되는 TNF- α의 분비량보다 현저하게 감소되었으나, PMA와 DNCB를 동시에 처리한 경우에는 PMA에 의해 유발되는 TNF-α의 분비량보다 증가하였다. PMA 와 CP를 동시에 처리한 경우에도 시간 의존적으로 TNF-α의 분비량이 증가하였다. DMSO를 PMA와 동시에 처리한 경우는 PMA 단독 처리 하였을 때 와 TNF-α의 분비량의 차이가 크지 않았다.
PMA, DPE, CP를 동시에 처리한 경우에는 PMA, DPE에 의해 유발되는 TNF-α의 분비량과 비슷하였다. PMA, DNCB, CP를 동시에 처리한 경우에는 PMA, DNCB에 의해 유발되는 TNF-α 의 분비량에 비해 변화가 줄어들다가, 48 hr 이후 로 증가하였다. PMA, LPS, CP를 동시에 처리한 경우에는 PMA, LPS에 의해 유발되는 TNF-α의 분비량에 비해 현저히 증가하였다(Table Ⅲ).
Table Ⅲ. Secretion of TNF-α by Treatments of Immune Modulating Substances (PMA, LPS, DNCB and CP) in THP-1 Cells
TNF-α(pg/㎖) 6hr 12hr 24hr 48hr
No treatment 34.6 41.5 27.3 27.1
PMA 227.2 288.1 680.8 737.7
PMA+DPE 90.3 176.5 151.5 68.6
PMA+DNCB 330.5 326.5 1647.1 1478.1
PMA+LPS 273.0 990.9 435.3 669.8
PMA+CP 144.3 476.2 1136.3 1545.6
PMA+DMSO 70.6 223.4 532.1 519.9
PMA+DPE+CP 134.4 153.0 150.9 91.9
PMA+DNCB+CP 100.0 199.5 490.8 1262.0
PMA+LPS+CP 246.7 852.7 1706.5 2018.3
Abbreviation : same as Fig. 1., dimethylsulfoxide (DMSO)
4. THP-1에서 면역 반응 유발물질에 의한 형태 학적인 변화
THP-1에 10 ng/㎖의 PMA를 처리하여 대식세 포로의 분화를 유도하였을 때, 전형적인 구형의 단 핵구 세포들이 시간 경과에 따라 집합되고, 세포돌 기가 생긴 대식세포로의 변화가 관찰되었으며, LPS를 동시에 처리한 경우에는 48시간에 세포돌기 를 갖는 대식세포로의 변화 빈도가 높게 나타났다.
처리한 면역반응 유발물질들에 따라 그 형태적인 변화들이 다양하게 관찰되었다(Fig. 3).
광학현미경으로 관찰된 형태학적 변화는 주사전 자현미경(SEM)을 이용한 미세구조 관찰에서도 다 양한 형태로 변화함을 확인하였다(Fig. 4).
CP와 면역 반응 유발물질이 THP-1에 각기 다 른 유전자 변화와 형태변화를 유도함을 확인하였 다.
Fig. 3. Morphological changes of THP-1 cells by treatments of immune modulating substances, PMA, LPS, DPE, DNCB and CP with phasecontrast microscope (Mag×290).
Abbreviation : same as Fig. 1.
Fig. 4. Ultrastructural changes of THP-1 cells by treatments of immune modulating substances, PMA, LPS, DNCB and CP.
Abbreviation : same as Fig. 1.
5. THP-1에서 면역 반응 유발물질에 의한 NF- κB 전사조절인자의 세포내 이동에 미치는 영향 THP-1에서 다양한 사이토카인의 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자인 NF-κB의 세포질에서 핵으로의 이동을 면역형광 세포조직화학적 염색 방법(immunofluorescent cytochemistry)으로 관찰 하였다(Fig. 5).
이러한 NF-κB의 이동 양상을 정량화하여 분석 하였을 때, 시간이 지남에 따라 핵으로 이동된 NF-κB의 양이 증가하였다. PMA와 DPE를 동시 에 처리하였을 때와 PMA, LPS, CP를 동시에 처
리한 경우에 NF-κB의 이동이 현저하게 증가하였 다. PMA, DPE, CP를 동시에 처리한 경우에는 PMA와 DPE를 처리한 경우보다 NF-κB의 이동 이 감소하였다(Fig. 6).
Fig. 5. Subcellular localization of NF-κB (red color) and nucleus (blue color) by immunofluorescent cytochemistry and confocal microcopy in THP-1 cells after treatments of immune modulating substances, PMA, LPS, DPE, DNCB and CP.
Abbreviation : same as Fig. 1.
Fig. 6. Translocation of NF-κB into nucleus by quantitative analysis for the intensity with immunofluorescent cytochemistry and confocal microcopy in THP-1 cells after treatments of immune modulating substances, PMA, LPS, DPE, DNCB, DMSO and CP.
Abbreviation : same as Fig. 1., dimethylsulfoxide (DMSO)
Ⅳ. 고 찰
선퇴는 蟬科에 속한 곤충인 蚱蟬(Cryptotympana pustulata FABR.)이 地中에서 나와 성충이 될 때 탈락한 皮殼으로 여름과 가을에 수거하여 泥沙를 제거하고 晒乾한다. 약간 타원형이면서 구부러졌고 길이 약 3.5cm, 너비 약 2cm이다. 표면은 황갈색 으로 반투명하고 광택이 있다. 선퇴는 解表藥중 發 散風熱藥에 속하며 性는 寒 無毒하고 味는 甘하며, 肺, 肝經으로 귀경한다. 性이 寒하고 質이 輕하여 肺와 肝經에 들어가 肺經의 風熱을 宣散하여 解表 透疹에 효능이 있고, 또한 肝經에 들어가 凉肝息風 시켜 止痙退翳의 효능이 있다. 다만 肺와 肝經을 淸疏시키는 良品으로 疏風시키고 止痒시키므로 風 疹瘙痒의 증에 많이 응용된다. 疏散風熱, 透疹止痒, 明目退翳, 祛風止痙, 治感冒風熱하는 효능과 咽痛, 音啞, 痲疹不透, 風疹瘙痒, 目赤翳障, 驚風抽搐, 破 傷風 등의 증상에 사용한다9).
선퇴가 포함되어 있는 消風散은 《和劑局方》,
《證治準繩》, 《醫宗金鑑》, 《沈氏尊生書》, 《外 科正宗》에 수재된 처방으로 《外科正宗》에서는 風毒과 濕熱이 혈맥에 침입하여 주리사이를 막기 때문에 생기는 병증에 적용된다. 습진, 풍진, 담마 진, 한포, 아토피성 피부염, 백선증, 스트로플루스 (strophulus)등에서 사용하는 消風散19,20)은 피부에 세균성 습진이나 피부 알러지, 무좀 등의 피부질환 이 생겨서 국소가 붓고, 가렵고, 진물이 날 때에 소염, 항균작용 및 항알러지, 항암작용과 피부, 점 막의 부종을 완화하는 작용을 한다. 또한 아토피피 부염 마우스 모델 BALB/c mouse21) 와 NC/Nga mouse22)에서 유의한 결과가 보고되었다.
또한 淸肌散은 《世醫得效方》23)에 “治風寒暑濕 外搏 肌膚發爲恩津 遍身瘙痒 或赤或白 口苦咽乾 或 作寒熱”이라 하여 風寒暑濕의 邪氣가 肌膚에 울체 된 피부질환을 치료하는 처방으로 아토피 피부염 에 응용할 수 있는 처방이다. 따라서 각 처방에 포함되어 있는 선퇴가 아토피피부염에 효과가 있 음을 추측해볼 수 있으며, 이에 약재선정을 하여 연구하였다.
아토피 피부염은 일반적으로 IgE 합성의 증가와 호산구 증가증이 나타나는데 기존의 면역학적 연 구에 의하면 이 질환은 IL-4, IL-5와 같은 Th2 사 이토카인이 증가하고 대표적인 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 분비가 감소하는 것과 관련이 있는 것으 로 보고되었다. T cell은 면역반응을 하는 동안 분 비하는 사이토카인에 따라 Th1 cell과 Th2 cell로
분류된다24,25). Th1 cell은 IFN-γ, TNF-α,
lymphotoxin 등을 분비하며 세균감염에 있어서 방 어적 기능을 담당하고 지연형 과민반응에 관여한 다26). 가장 핵심적인 Th1 사이토카인인 IFN-γ는 대식세포를 활성화하여 대식세포의 포식작용을 촉 진하며 CD8 T cell이 강력한 cytotoxic cell로 분 화하도록 유도하고 그 외에 다른 사이토카인과 협 조하여 염증성 백혈구를 활성화시킨다. 미경험의
T helper cell이 활성화 되어 Th1 세포로 분화하 는데 영향을 주는 주요 사이토카인은 인간의 경우 IL-12와 IFN-α이다27). 이들은 STAT-4 pathway 를 통하여 IFN-γ 합성을 조절하는데 세균이나 바 이러스 감염시 IL-12, IFN-α는 IFN-γ 합성을 강 력하게 증가시킨다. 세균에 감염되면 세균이 합성 한 endotoxin은 대식세포를 활성화시켜 IL-12를 유도하고 바이러스에 감염된 세포는 IFN-α를 합 성함으로서 T helper cell이 Th1 cell로 분화하게 하고 더 많은 IFN-γ를 합성하게 한다. 따라서 세 균감염이 빈번하지 않은 환경에서는 Th1 사이토카 인 패턴이 만성 염증과 조직 손상 및 자가면역 질 환에 우세하게 나타난다.
한편 Th2 cell은 IL-4, IL-5, IL-10, IL-13을 분 비하며 기생충 감염에 중요 역할을 하고 알러지 반응과 천식과 같은 만성적인 기관지 염증 및 기 도 과민반응과 깊은 관련이 있다28,29). IL-4는 B cell로 하여금 IgE를 생산하도록 촉진하고 IL-13은 IL-4와 비슷한 기능을 하면서 기관지 과민반응을 유도하며 IL-5는 호산구를 활성화하여 천식 등에서 지속적인 염증을 일으킨다30).
따라서 그간 아토피피부염은 Th2 사이토카인이 지나치게 분비하기 때문에 Th2 cell이 병리적으로 중요한 역할을 하는 것으로 이해되어 왔다. 그러나 아토피피부염 환자의 피부조직을 분석하면 급성기 에는 IL-4, IL-5, IL-13의 양이 증가하여 전형적인 Th2반응이 특징적이나 만성적인 병변에는 IL-12와 IFN-γ의 양이 증가하는 Th1패턴이 나타난다31,32). 또한 아토피 피부염은 일반적으로 IgE 농도가 높 아서 흡입성 또는 음식 항원에 대해 즉각적인 반 응을 보이지만 일부 아토피 피부염 환자들은 IgE 도 정상 범위에 있으면서 항원에 대한 과민반응과 무관한 유형이 있다33,34). 전자를 extrinsic type 아 토피 피부염이라고 하며 후자는 intrinsic type 아 토피 피부염이라고 분류되기도 한다. intrinsic type은 보고바다 다르지만 전체 아토피 피부염에서
15-45%를 차지하는 것으로 알려져 있다35,36). 이 두 유형은 사이토카인 발현 면에서도 뚜렷한 차이 점이 있는데 IL-5와 IFN-γ는 모두 비슷한 양으로 검출되나 extrinsic type은 intrinsic type에 비해 IL-4, IL-13 발현이 증가하였고 IgE에 대한 B cell 의 Fc receptor(CD23)가 증가하였다37). 이처럼 아 토피 피부염의 면역학적인 측면은 기관지 천식이 나 알러지 비염과 같은 다른 아토피 질환에 비해 매우 복잡한 양상을 가진다.
본 연구에서는 아토피 피부염 관련 면역 반응의 기전 연구를 위한 병리모델에서 유용하게 사용되 고 있는 인간의 단핵세포주인 THP-1을 이용하여 다양한 면역반응 유발물질(LPS, DPE, DNCB)을 처리하고 그 결과를 비교 분석하였다. 특히, 알레 르기 반응을 억제하는 것으로 알려져 있는 CP를 처리하여 사이토카인 유전자 발현에 관련된 효과 를 확인하여 CP가 아토피피부염에 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
THP-1 세포주에 중간 정도의 세포독성을 나타 내는 농도를 선정하여, 1 ㎍/㎖의 LPS, 10 ㎍/㎖의 DPE, 5 ㎍/㎖의 DNCB, 1 ㎍/㎖의 CP를 실험에 사용하였다. 이는 고농도에서의 세포사멸을 막고, 저농도에서의 반응저하를 피하기 위해 적당한 농 도를 선정하였다.
THP-1 세포주를 PMA처리를 하여 대식세포로 분화시키는 과정에서 DPE, DNCB, LPS 각각과 CP를 추가로 동시에 처리한 경우에 나타나는 사이 토카인 유전자들의 변화 양상을 살펴보면, PMA와 DPE 처리 상태에서 CP는 TGF-β의 mRNA 발현 을 증가시켰으나, TNF-α와 MCP-1의 mRNA 발 현을 감소시키는 양상을 나타내었다. DNCB 처리 시에 CP는 IFN-γ의 mRNA 발현을 감소시키고, TGF-β의 mRNA 발현을 증가시켰다. LPS 처리 시에 CP는 MCP-1의 발현을 감소시켰다.
THP-1에서 PMA 처리에 의해 증가되는 TNF- α의 분비량은 DPE 처리 시 감소되었으나,
DNCB와 CP를 처리 시에는 TNF-α의 분비량이 48 시간에 2배 정도 증가되었다. 그러나 PMA, DNCB, CP를 동시에 처리한 경우에는 TNF-α의 분비량이 다소 감소하였다. PMA와 LPS 처리 시 증가하는 TNF-α의 분비량은 CP를 동시에 처리한 경우에 현저히 증가하였다. CP는 PMA와 DPE 처 리 시 TNF-α 분비량에 영향을 주지 못하였다.
DPE, DNCB와 달리 PMA에 LPS 처리를 한 경 우에서 CP는 TNF-α의 분비량을 현저하게 증가시 키는 영향을 주고 있다. 이는 LPS로 유발된 면역 자극에 CP가 영향을 주고 있다고 사료된다.
THP-1에 PMA를 처리하여 대식세포로의 분화 를 유도하였을 때, 전형적인 구형의 단핵구 세포들 이 시간 경과에 따라 집합되고 세포돌기를 갖춘 대식세포로의 변화가 관찰되었으며, 면역반응 유발 물질들과 CP를 같이 처리 하였을 때에도 광학현미 경으로 관찰된 형태학적 변화는 주사전자현미경 (SEM)을 이용한 미세구조 관찰에서도 다양한 형태 로 변화함을 확인하였다(Fig. 4). 이로 인해 면역반 응 유발물질과 CP를 처리한 경우에 다양한 유전자 발현을 일으키고 있음을 확인 할 수 있었으며, CP 가 대식세포의 면역반응에 영향을 주고 있음을 확 인 할 수 있다. 하지만 각각 다른 형태에 대한 추 가적인 연구는 필요할 것으로 사료된다.
THP-1에서 전사조절인자인 NF-κB의 세포질에 서 핵으로의 이동을 면역형광 세포조직화학적 염 색 방법(immunofluorescent cytochemistry)으로 관찰하였다. NF-κB는 p50 subunit family (p50, p52)와 p65 subunit family (p65,c-Rel, RelB)의 homodimer 또는 heterodimer로 구성되며, 보통 상태에서는 세포질에서 inhibitor인 IκB protein (IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBε, IκBζ)들과 결 합하고 있어 불활성화된 상태로 세포질에 존재한 다. 그러나 사이토카인(TNF-α, IL-1), LPS, dsRNA, stress (ROI, UV, adriamycin, 방사선) 등의 다양한 자극에 의해 IκB protein이 인산화
되어 분해됨으로서 유리된 NF-κB는 핵으로 들어 가 해당 유전자의 NF- B binding site 에 결합하 여 염증관련 유전자, anti-apoptosis 유전자 등의 발현을 유도한다38). PMA와 DPE를 동시에 처리하 였을 때와 PMA, LPS, CP를 동시에 처리한 경우 에 NF-κB의 핵으로의 이동이 현저하게 증가함을 알 수 있으며, NF-κB가 작용하는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 PMA, DPE, CP를 동시에 처 리하였을 때와 PMA, DNCB, CP를 동시에 처리 하였을 때에는 큰 변화를 보이지 않았다. CP는 PMA와 LPS 처리 시에 NF-κB의 이동을 증가시 켰으나 PMA와 DPE를 동시에 처리 시에 NF-κB 의 이동을 감소시켰다. 하지만 TNF-α의 분비량은 PMA, DPE, CP를 처리 시에 확연한 감소가 보였 다(Table Ⅲ). 이는 NF-κB가 아닌 다른 경로에서 의 TNF-α의 분비가 감소가 된 것으로 보이며 차 후 더 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
CP는 대식세포에 영향으로 주어 면역 반응에 변화가 있는 것으로 확인이 되나 각각 LPS, DPE, DNCB로 면역반응이 유발된 상태에서 각각 다른 형태의 결과를 보였다. 유발된 물질에 따라 각기 다른 사이토카인의 mRNA 발현 증감을 보였다.
LPS로 면역 반응이 유발된 경우에는 CP가 TNF- α의 분비량이 증가시켰고, NF-κB의 이동을 증가 시켰다. CP는 인간의 THP-1 단핵구에서 사이토카 인 유전자들의 발현 양상에 다양한 영향을 미치는 것으로 확인하였으며 면역반응 유발 물질에 대한 다양한 영향도 확인하였다. 각기 다른 부분에 작용 하는 영향에 대한 기전에 대해서는 차후 더 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
Ⅴ. 결 론
본 연구에서는 THP-1 세포주에 PMA처리를 하 고 면역반응 유발물질인 LPS, DPE, DNCB를 각
각 처리한 뒤 추가로 선퇴추출물(CP)을 처리하여 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.
1. THP-1 세포에 PMA 처리 후 DPE 처리 시에 CP는 TGF-β의 mRNA 발현을 증가시켰으나, TNF-α와 MCP-1의 mRNA 발현을 감소시켰 다. DNCB 처리 시에 CP는 IFN-γ의 mRNA 발현을 감소시키고, TGF-β의 mRNA 발현을 증가시켰다.
2. THP-1에 PMA, LPS, CP를 처리한 경우에는 PMA와 LPS를 처리 한 경우보다 TNF-α의 분 비량이 현저히 증가하였다. CP는 THP-1에 PMA와 LPS 처리한 경우에서 TNF-α의 분비 량을 증가시켰다.
3. THP-1에 다양한 면역반응 유발물질과 CP를 처리하였을 때, 전형적인 구형의 단핵구 세포들 이 시간 경과에 따라 집합되고 세포돌기를 갖 춘 대식세포로의 변화가 관찰되었다.
4. THP-1에서 CP는 PMA, LPS를 동시에 처리한 경우에 NF-κB의 이동을 현저하게 증가시켰다.
반면 PMA, DPE를 처리한 경우에 NF-κB의 이동을 감소시켰다.
이상의 결과를 바탕으로 선퇴추출물인 CP는 인 간의 THP-1 단핵구에서 사이토카인 유전자들의 발현 양상에 다양한 영향을 미치는 것으로 확인하 였으며 면역반응 유발 물질에 대한 다양한 영향도 확인하였다.
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